СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ ИЛИ БОЛИ, СОПРОВОЖДАЮЩЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЕ, ПРИ КОТОРОМ ВЫЯВЛЕНА ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ НЕЙРОПАТИЯ ИЛИ НАРУШЕНИЕ АСТРОЦИТОВ Российский патент 2024 года по МПК A61K39/395 A61K45/00 C07K16/22 A61P25/02 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0001]

Настоящее изобретение относится к средству для предупреждения или лечения периферических нейропатий или болей, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, и к способу их предупреждения или лечения с применением такого средства, где способ отличается ингибированием активности RGMa.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002]

Астроциты, одни из глиальных клеток, присутствующих в центральной нервной системе, обладают различными функциями, такими как: (1) функция структурной поддержки сети нейронов; (2) функция регуляции различных условий вокруг астроцитов посредством транспортировки веществ; (3) являются одним из элементов в синаптической функции, которую проявляют три типа клеток через плотные контакты между пресинаптическими, постсинаптическими и глиальными клетками; (4) регуляция внеклеточной концентрации ионов; (5) буферное действие в энергетических аспектах; и (6) повышение миелинизирующей активности олигодендроцитов. Описанные выше функции астроцитов при различных заболеваниях головного мозга, в особенности связь нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и нарушение когнитивных функций, острые нарушения мозгового кровообращения и психические заболевания, с гипофункцией астроцитов, ассоциированной со старением, привлекают повышенное внимание (Непатентные документы 1-3).

Периферические нейропатии представляют собой патологические состояния, при которых нарушается нормальная проводимость периферических нервов. При периферических нейропатиях поражаются нервы, такие как двигательные нервы, чувствительные нервы и вегетативные нервы. Периферические нейропатии клинически подразделяют на классы мононейропатий (нарушений в одном нерве), множественных мононейропатий (нарушений двух или более нервов, присутствующих в отдельных областях) или полинейропатий (симметрично и широко развившихся нейропатий), или патоморфологически на аксонопатии, при которых в основном поражаются аксоны, или миелинопатии, при которых денатурируются и отслаиваются миелиновые оболочки. Периферические нейропатии приводят к дисфункции двигательных нервов, чувствительных нервов и вегетативных нервов. Это вызывает такие симптомы, как боль, дизестезию, паралич, онемение, мышечную слабость, дисгидроз и дизурию, которые со временем ухудшаются. Периферические нейропатии в основном возникают, например, вследствие повреждений, вызванных физическими факторами, такими как деформация; компрессии, нарушения кровообращения, генетические факторы и нарушения обмена веществ. Диабетические нейропатии включают полинейропатии и мононейропатии. Полинейропатии включают нейропатии периферических нервов, чувствительных нервов, двигательных нервов и вегетативных нервов.

Метилированная форма витамина B12 (метилкобаламин) используется в настоящее время в клинической практике в качестве терапевтического средства для лечения периферических нейропатий (Непатентный документ 4), но демонстрирует клиническую эффективность лишь в очень редких случаях. Кроме того, для ассоциированного с нейропатиями двигательного паралича пока не было найдено эффективной терапии, хотя он оказывает серьезное влияние на повседневную деятельность.

[0003]

RGM (направляющая молекула отталкивания) представляет собой мембранный белок, который был первоначально идентифицированным в качестве направляющей молекулы аксонов в визуальной системе (см. Непатентный документ 5). Семейство RGM включает трех представителей, называемых RGMa, RGMb и RGMc (Непатентный документ 6). Как известно, по меньшей мере, RGMa и RGMb работают в одном сигнальном механизме (см. Непатентный документ 7). RGMc играет важную роль в обмене железа.

Последующие исследования показали, что RGM регулирует, например, наведение аксонов и формирование слоев в эмбрионах Xenopus и куриных эмбрионах, а также закрытие головной нервной трубки в мышиных эмбрионах (см. Непатентный документ 8). В Патентном документе 1 раскрыто средство, стимулирующее регенерацию аксонов, содержащее в качестве действующего вещества нейтрализующее антитело против RGM.

[0004]

В дополнение к его функциям в стадиях развития, RGMa снова экспрессируется после повреждений центральной нервной системы у взрослого человека и крысы. Кроме того, ингибирование RGMa у крысы вызывает рост аксонов после повреждений спинного мозга и облегчает функциональное восстановление (см. Непатентный источник 9). На основе этих фактов, RGMa считается ингибитором регенерации аксонов после повреждений центральной нервной системы. Конкретные примеры антител для нейтрализации RGMa описаны в Патентном документе 2 (такие как 5F9 и 8D1), Патентном документе 3 (такие как AE12-1, AE12-1Y) и Патентном документе 4 (такие как r116A3, r70E4, r116A3C и rH116A3).

Также было известно, что антитела против RGMa эффективны при оптиконевромиелите (см. Непатентный документ 10).

Как описано выше, роли RGMa при повреждениях центральной нервной системы уже были установлены, однако еще не была определена роль RGMa при периферических нейропатиях или болевых симптомах, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения.

[Предшествующий уровень техники]

[Патентные документы]

[0005]

Патентный документ 1: WO2005/087268

Патентный документ 2: WO2009/106356

Патентный документ 3: WO2013/112922

Патентный документ 4: WO2016/175236

[Непатентные документы]

[0006]

Непатентный документ 1: Dallerac G et al., Prog Neurobiol. 144: 48-67(2016)

Непатентный документ 2: Gerkau NJ et al., J Neurosci Res. 2017 Feb 2.

Непатентный документ 3: Alam Q et al., Curr Pharm Des. 22: 541-8(2016)

Непатентный документ 4: Yamazaki et al., Neurosci Lett, 170: 195-197. (1994)

Непатентный документ 5: Stahl, B., Muller, B., von Boxberg, Y., Cox, E.C. & Bonhoeffer, F. Biochemical characterization of a putative axonal guidance molecule of the chick visual system. Neuron 5, 735-743 (1990)

Непатентный документ 6: Mueller et al., Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci., 361: 1513-29, 2006

Непатентный документ 7: Liu, X., Hashimoto, M., Horii, H., Yamaguchi, A., Naito, K. and Yamashita, T. Repulsive guidance molecule b inhibits neurite growth and is increased after spinal cord injury. Biochem. Biophys. Res. Commun. 382, 795-800 (2009)

Непатентный документ 8: Yamashita, T., Mueller, B.K. & Hata, K. Neogenin and repulsive guidance molecule signaling in the central nervous system. Curr. Opin. Neurobiol.17, 29-34 (2007)

Непатентный документ 9: Hata, K. et al. RGMa inhibition promotes axonal growth and recovery after spinal cord injury. J. Cell Biol. 173, 47-58 (2006)

Непатентный документ 10: Harada K. et al., Inhibition of RGMa alleviates symptoms in a rat model of neuromyelitis optica. Scientific Reports 8:34 1-9 (2018)

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[Задачи, решаемые изобретением]

[0007]

Цель настоящего изобретения состоит в предоставлении нового способа предупреждения или лечения периферических нейропатий или болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения.

[Способы решения задачи]

[0008]

Для решения вышеперечисленных задач авторы настоящего изобретения провели интенсивное исследование и обнаружили, что ингибирующие RGMa средства могут быть средствами для предупреждения или лечения периферических нейропатий. Авторы настоящего изобретения также обнаружили, что ингибирующие RGMa вещества воздействуют на болевые симптомы посредством облегчения не только периферических нейропатий, но также и астроцитарных повреждений или гипофункций, что указывает на то, что ингибирующие RGMa вещества также могут быть средствами для предупреждения или лечения болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, и, таким образом, выполнили настоящее изобретение.

[0009]

Таким образом, настоящее изобретение относится к следующему.

[1] Средство для предупреждения или лечения периферической нейропатии, включающее ингибирующее RGM вещество.

[2] Средство согласно [1], где ингибитор RGM является ингибирующим RGMa веществом.

[3] Средство согласно [2], где ингибирующее RGMa вещество является нейтрализующим антителом против RGMa или его фрагментом.

[4] Средство согласно [3], где нейтрализующее антитело против RGMa является гуманизированным антителом.

[5] Средство согласно [3] или [4], где нейтрализующее антитело против RGMa является антителом, распознающим аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 36, 37, 38 и 39.

[6] Средство согласно любому из [3]-[5], где нейтрализующее антитело против RGMa является антителом, выбранным из группы, состоящей из:

(a1) нейтрализующего антитела против RGMa, которое включает:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9 и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10;

(b1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, включающую SFG;

(c1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22;

(d1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 26, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 27, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 28;

(e1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(f1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(g1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(h1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 41, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(i1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 42, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(j1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(k1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 44, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34; и

(l1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 45, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34.

[7] Средство согласно любому из [1]-[6], где периферическая нейропатия выбрана из группы, состоящей из диабетической нейропатии; туннельной нейропатии, такой как синдром запястного канала, локтевая нейропатия кубитального канала, паралич малоберцового нерва и синдром предплюсневого канала; семейной амилоидной полинейропатии; токсической нейропатии; канцероматозной нейропатии; иммуноопосредованной нейропатии, такой как синдром Гийена-Барре (СГБ) и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (ХВДП); нейропатии, ассоциированной с заболеваниями соединительной ткани; синдрома Кроу-Фукасе (POEMS-синдром); наследственной нейропатии, такой как болезнь Шарко-Мари-Тута; постгерпетической невралгии; периферической нейропатии, ассоциированной со СПИДом или болезнью Лайма; уремии; мультифокальной двигательной нейропатии; и васкулитной нейропатии.

[8] Средство согласно любому из [1]-[6], где периферическая нейропатия является диабетической нейропатией.

[9] Средство согласно [8], где диабетическая нейропатия является болезненной диабетической нейропатией и/или бессимптомной диабетической нейропатией.

[10] Средство согласно любому из [1]-[6] для применения в предупреждении или лечении болевых симптомов, связанных с заболеванием, включающим периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение.

[11] Средство согласно [10], где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, выбрано из группы, состоящей из:

диабетической нейропатии; туннельной нейропатии, такой как синдром запястного канала, локтевая нейропатия кубитального канала, паралич малоберцового нерва и синдром предплюсневого канала; семейной амилоидной полинейропатии; токсической нейропатии; канцероматозной нейропатии; иммуноопосредованной нейропатии, такой как синдром Гийена-Барре (СГБ) и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (ХВДП); нейропатии, ассоциированной с заболеваниями соединительной ткани; синдрома Кроу-Фукасе (POEMS-синдром); наследственной нейропатии, такой как болезнь Шарко-Мари-Тута; постгерпетической невралгии; периферической нейропатии, ассоциированной со СПИДом или болезнью Лайма; уремии; мультифокальной двигательной нейропатии; васкулитной нейропатии; оптиконевромиелита; и болезни Александера.

[12] Средство согласно [11], где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, является диабетической нейропатией или оптиконевромиелитом.

[13] Средство согласно [11], где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, является диабетической нейропатией.

[14] Средство согласно [11], где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, является оптиконевромиелитом.

[15] Способ предупреждения или лечения периферической нейропатии, включающий введение эффективного количества ингибирующего RGMa средства нуждающемуся в этом млекопитающему.

[16] Способ согласно [15], где периферическая нейропатия является диабетической нейропатией.

[Полезные эффекты изобретения]

[0010]

В одном аспекте настоящего изобретения может быть предложено средство для предупреждения или лечения периферической нейропатии. В другом аспекте настоящего изобретения может быть предложено средство для предупреждения или лечения симптома боли, связанного с заболеванием, включающим периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0011]

ФИГ. 1 является графиком, на котором показан эффект улучшения при повторном введении r116A3 в отношении механической гипералгезии в модели диабетической нейропатии, вызванной стрептозотоцином (STZ) у крыс.

ФИГ. 2 является графиком, на котором показан эффект улучшения при повторном введении r116A3 в отношении пониженной проводимости двигательных нервов в модели диабетической нейропатии, вызванной STZ у крыс.

ФИГ. 3 является графиком, на котором показан эффект при повторном введении r116A3 в отношении процента положительной площади при иммунноокрашивании на глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) в спинном мозге в модели диабетической нейропатии, вызванной STZ у крыс.

ФИГ. 4 является графиком, на котором показан эффект при повторном введении r116A3 в отношении процента положительной площади при иммуноокрашивании на Iba1 в спинном мозге в модели диабетической нейропатии, вызванной STZ у крыс.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0012]

Варианты осуществления настоящего изобретения будут описаны ниже.

Если не определено иное, используемые в настоящем документе научные и технические термины имеют те же значения, которые обычно известны специалистам в данной области. Хотя значение и объем термина должны быть ясными, определение, приведенное в в настоящем документе, должно иметь приоритет над определениями в словарях или вне, когда значение неясно. Кроме того, если не указано иное, термин в единственном числе должен включать множественное число и наоборот. В настоящем описании использование "или" означает "и/или", если не указано иное.

[0013]

В общем, номенклатура, используемая в отношении культур клеток и тканей, молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, генетике, химии белков и нуклеиновых кислот и гибридизации, и их методики, описанные в настоящем документе, являются известными в данной области и широко используемыми. Если не указано иное, способы и методики настоящего изобретения обычно выполняются в соответствии с обычными способами, известными в данной области техники и описанными в различных общих и более конкретных ссылках, цитируемых и обсуждаемых в настоящем документе. Ферментные реакции и методики очистки являются стандартно выполняемыми в данной области или выполняются в соответствии со спецификациями производителя, как описано в настоящем документе. Номенклатуры, используемые в отношении, и экспериментальные процедуры и методики аналитической химии, химии органического синтеза и химии, такой как медицинская химия, и медицины, описанные в настоящем документе, являются известными в данной области и широко используемыми. Стандартные методики используются для химического синтеза, химического анализа, медицины, изготовления составов, доставки и лечения пациентов.

Для облегчения понимания настоящего изобретения, термины, используемые в настоящем документе, будут описаны ниже.

[0014]

[Нейтрализация]

Термин "нейтрализация" при использовании в настоящем документе относится к действию, посредством которого может осуществляться связывание с целевой мишенью и ингибирование любой функции мишени. Например, ингибирующее RGMa вещество относится к веществу, которое связывается с RGMa, вызывая ингибирование биологической активности RGMa.

[0015]

[Эпитоп]

При использовании в настоящем документе термин "эпитоп" включает детерминанту полипептида, которая может специфично связываться с иммуноглобулином или T-клеточным рецептором. В некоторых вариантах осуществления эпитоп может включать химически активную группу на поверхности молекулы (например, аминокислоту, боковую цепь сахара, фосфорил или сульфонил). В некоторых вариантах осуществления эпитоп может иметь конкретные особенности трехмерной структуры и/или электрического заряда. Эпитопы относятся к областям в антигенах, с которыми связываются антитела.

[0016]

[Выделенный]

При использовании в настоящем документе термин "выделенный", такой как в выделенное ингибирующее RGMa вещество (например, антитело), означает идентифицированный и отделенный и/или полученный из компонентов в естественных условиях. Примеси в естественных условиях являются веществами, которые могут препятствовать диагностическому или терапевтическому применению антитела, включая ферменты, гормоны и другой белковые или небелковые растворенные вещества. Как правило, ингибирующие RGMa вещества и т.п. могут быть выделены с помощью по меньшей мере одной стадии очистки. Ингибирующие RGMa вещества, очищенные по меньшей мере посредством одной стадии очистки, могут именоваться "выделенными ингибирующими RGMa веществами".

[0017]

[Антитело]

При использовании в настоящем документе термин "антитело" в широком смысле относится к молекуле иммуноглобулина (Ig), включающей четыре полипептидных цепи - две тяжелых цепи (H-цепи) и две легких цепи (L-цепи) - и по существу сохраняющей способность молекулы Ig связываться с эпитопом.

[0018]

[Человеческое антитело]

При использовании в настоящем документе термин "человеческое антитело" относится к антителу, включающему легкие и тяжелые цепи, полученные из иммуноглобулинов человека. В зависимости от различия в константной области тяжелой цепи человеческие антитела включают IgG, включающий γ тяжелую цепь (включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4); IgM, включающий µ тяжелую цепь; IgA, включающий α тяжелую цепь (включая IgA1 и IgA2); IgD, включающий δ тяжелую цепь; и IgE, включающий ε тяжелую цепь. В принципе, в качестве легкой цепи человеческие антитела включают κ или λ цепь.

[0019]

[Гуманизированное антитело]

При использовании в настоящем документе термин "гуманизированное антитело" относится к антителу, включающему вариабельные области, включающие определяющие комплементарность области из антител, полученных у не относящихся к человеку животных, каркасные области, полученные из человеческих антител и константные области, полученные из человеческих антител.

[0020]

[Химерное антитело]

При использовании в настоящем документе термин "химерное антитело" относится к антителу, в котором легкая цепь и/или тяжелая цепь включают полученную не у человека вариабельную область и полученную у человека константную область.

[0021]

[Моноспецифичное антитело]

При использовании в настоящем документе термин "моноспецифичное антитело" относится к антителу, включающему один независимый участок распознавания антигена, обладающий специфичностью к одному антигену. Например, моноспецифичное антитело, распознающее RGMa, может быть указано в настоящем документе как RGMa-моноспецифичное антитело.

[0022]

[Мультиспецифичное антитело]

При использовании в настоящем документе термин "мультиспецифичное антитело" относится к антителам, включающим два или более независимых участка распознавания антигена, обладающих специфичностями к двум или более разным антигенам, включая биспецифичные антитела, обладающие специфичностью к двум антигенам, и триспецифичные антитела, обладающие специфичностью к трем антигенам.

[0023]

[Определяющая комплементарность область (CDR)]

Термин "определяющая комплементарность область (CDR)" относится к области, формирующей антигенсвязывающий участок в вариабельной области молекулы иммуноглобулина, которая также называется гипервариабельной областью и, в частности, относится к части, в которой аминокислотная последовательность сильно изменяется в каждой молекуле иммуноглобулина. Что касается CDR-областей, каждая легкая и тяжелая цепь содержит по три CDR-области. Три CDR-области, содержащиеся в легких цепях, могут быть обозначены как LCDR1, LCDR2 и LCDR3, тогда как три CDR-области, содержащиеся в тяжелых цепях, могут быть обозначены как HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Например, границы CDR-областей молекулы иммуноглобулина определяют согласно системе нумерации Кэбата (Kabat et al., 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services, NIH, USA).

[0024]

[Эффективная доза]

Термин "эффективная доза" относится к достаточной дозе средства, предупреждающего или лечащего нарушение, которая вызывает облегчение или уменьшение тяжести и/или длительности нарушения или его одного или более симптомов; предотвращает развитие нарушения; инвертирует течение нарушения; предотвращает рецидив, возникновение, развитие или прогрессирование одного или более симптомов, связанных с нарушением; обнаруживает нарушение; или усиливает или улучшить один или более профилактических или терапевтических эффектов другой терапии (например, профилактического или терапевтического лекарственного средства).

[0025]

[Процент (%) идентичности аминокислотных последовательностей]

"Процент (%) идентичности" аминокислот последовательности кандидатной полипептидной последовательности, такой как вариабельная область, относительно аминокислотной последовательности референсной полипептидной последовательности определяется как процент одинаковых аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, совпадающих с аминокислотными остатками в конкретной референсной полипептидной последовательности, где процент получают при определенном расположении последовательностей и введении пропусков при необходимости с получением максимального % идентичности, без включения каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательности. Выравнивание для определения % идентичности может быть выполнено с помощью различных методов, известных в данной области, например, с помощью общедоступной программы, такой как программа BLAST, BLAST-2, ALIGN или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области смогут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая алгоритм, требуемый для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемой последовательности. Однако в рамках настоящего документа значения % идентичности получают при парном выравнивании с помощью компьютерной программы для сравнения последовательностей, BLAST.

В случае использования BLAST при сравнении аминокислотных последовательностей, % идентичности данной аминокислотной последовательности A с данной аминокислотной последовательностью B вычисляют следующим образом:

частное X/Y, умноженное на 100

где X представляет собой число аминокислотных остатков, оцениваемых как идентичные в программном выравнивании A и B при выравнивании последовательностей в программе Blast, и где Y представляет собой общее число аминокислотных остатков в B. Следует понимать, что если длина аминокислотных последовательностей A и B отличается, % идентичности A с B будет отличаться от % идентичности B с A. Если не указано иное, все значения % идентичности в настоящем описании получают при использовании компьютерной программы BLAST, как показано в предыдущем абзаце.

[0026]

Настоящее изобретение более подробно описано ниже.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложено средство для предупреждения или лечения периферической нейропатии, которое включает ингибитор RGM, в особенности ингибирующее RGMa вещество, в качестве нового применения. В другом варианте осуществления настоящего изобретения предложено средство для предупреждения или лечения, например, диабетической нейропатии, которое включает ингибирующее RGMa вещество. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предложено средство для предупреждения или лечения болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, которое включает ингибирующее RGMa вещество.

В других вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ предупреждения или лечения периферических нейропатий, например диабетических нейропатий, включающий введение профилактического или терапевтического средства, содержащего эффективное количество ингибирующего RGMa вещества, нуждающемуся в этом млекопитающему.

[0027]

<Ингибирующее RGM вещество>

Ингибирующее RGM вещество в настоящем изобретении может быть либо веществом, ингибирующим активность RGM, который вызывает периферические нейропатии или болевые симптомы, связанные с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, описанные ниже, или замедляет выздоровление от заболеваний или состояний (в дальнейшем также именуемую просто "активностью RGM"), либо веществом, ингибирующим экспрессию RGM. RGM представляет собой один или два, или более, выбранных из группы, состоящей из RGMa, RGMb и RGMc. Предпочтительно RGM представляет собой RGMa.

[0028]

RGMa идентифицирован как белок, который ингибирует рост нейритов в центральной нервной системе. У человека белок RGMa биосинтезируется в виде белка-предшественника, включающего 450 аминокислот, как показано в SEQ ID NO: 1. Сигнальный пептид от Met 1 до Pro 47, который присутствует на N-конце (который относится к пептиду от первого остатка метионина до 47-го остатка пролина с N-концевой стороны и описан ниже, как указано выше), удаляется. Затем пептидная связь между Asp 168 и Pro 169 расщепляется с образованием N-концевого домена. В С-концевом фрагменте с Pro 169, пептид от Ala 425 до Cys 450 на С-конце удаляется, в результате чего Ala 424 становится С-концевым. Затем ГФИ якорь добавляется к C-концевой карбоксильной группе на Ala 424 с образованием C-концевого домена. N-концевой домен (от Cys 48 до Asp 168) и C-концевой домен (от Pro 169 до Ala 424) связываются дисульфидными связями с получением зрелого белка, который экспрессируется на клеточной мембране при посредстве ГФИ якоря.

[0029]

RGMa в настоящем изобретении может быть получен из любых животных. Предпочтительно RGMa является человеческим RGMa. Человеческий белок-предшественник RGMa может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1 в Списке последовательностей. Мышиный белок-предшественник RGMa может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2 в Списке последовательностей, тогда как крысиный белок-предшественник RGMa может включать аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 3 в Списке последовательностей. Впрочем, при удалении C-концевых пептидов образуются зрелые белки, которые имеют такую же аминокислотную последовательность.

Гены RGMa включают, без ограничения, ген RGMa человека, включающий нуклеотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4. Нуклеотидные последовательности генов RGM, полученных из различных организмов, могут быть легко получены из известных баз данных (например, GenBank).

[0030]

Ингибирующее RGMa вещество в настоящем изобретении может быть либо веществом, ингибирующим (нейтрализующим) активность RGMa, который вызывает периферические нейропатии или болевые симптомы, связанные с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, или замедляет выздоровление от заболеваний или симптомов (в дальнейшем также именуемую просто "активностью RGM"), либо веществом, ингибирующим экспрессию RGMa. Например, ингибирующие RGMa вещества в настоящем изобретении могут быть отобраны, например, с применением способа оценки, описанного в Примере 1, то есть при оценке эффектов уменьшения боли и нарушений нервной проводимости в модели диабетической нейропатии, индуцированной STZ у крыс.

[0031]

Ингибирующие RGMa вещества в настоящем изобретении являются, например, веществами, которые напрямую ингибируют активность RGMa посредством связывания с RGMa, или вещества, которые ненапрямую ингибируют активность RGMa, препятствуя связыванию между RGMa и его рецептором, в частности, включающие низкомолекулярные соединения, нейтрализующие антитела против RGMa, функционально модифицированные антитела на их основе, конъюгированные антитела на их основе и их фрагменты. Кроме того, вещества, которые ингибируют активность RGMa путем ингибирования экспрессии RGMa, также являются ингибирующими RGMa веществами и, в частности, включают миРНК (короткую интерферирующую РНК), мшРНК (короткую шпилечную РНК) и антисмысловые олигонуклеотиды против генов RGMa. Из них ингибирующие RGMa вещества в настоящем изобретении предпочтительно являются нейтрализующими антителами против RGMa, функционально модифицированными антителами на их основе, конъюгированными антителами на их основе или их фрагментами, более предпочтительно нейтрализующими антителами против RGMa или их фрагментами, особенно предпочтительно нейтрализующими антителами против RGMa.

[0032]

Ингибирующие RGMa вещества в настоящем изобретении также включают вещества, которые не воздействуют непосредственно на RGMa, но ингибируют активность любой из родственных молекул в сигнальных системах, через которые RGMa вызывает симптомы периферических нейропатий, например диабетической нейропатии.

[0033]

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело против RGMa может быть антителом, которое связывается с RGMa, нейтрализуя активность RGMa. Нейтрализующее антитело против RGMa может быть поликлональным или моноклональным антителом и предпочтительно является моноклональным антителом. RGMa-нейтрализующее антитело согласно настоящему изобретению может быть RGMa-моноспецифичным антителом или мультиспецифичным антителом, которое множественно распознает RGMa и другие антигены, и предпочтительно является RGMa-моноспецифичным антителом.

[0034]

В частности, эпитопами RGMa человека предпочтительно являются один или более из SEQ ID NO: 16 (номера аминокислот 47-69 в SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 36 (номера аминокислот 298-311 в SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 37 (номера аминокислот 322-335 в SEQ ID NO: 1), SEQ ID NO: 38 (номера аминокислот 349-359 в SEQ ID NO: 1) и SEQ ID NO: 39 (номера аминокислот 367-377 в SEQ ID NO: 1), более предпочтительно комбинация SEQ ID NO: 36 и 37, особенно предпочтительно комбинация SEQ ID NO: 36, 37 и 39.

[0035]

Нейтрализующие антитела против RGMa согласно настоящему изобретению включают поликлональные или моноклональные антитела, полученные при иммунизации млекопитающих, таких как мыши, белками RGMa или их фрагментами (например, эпитопными фрагментами, описанными выше) в качестве антигенов; химерные антитела и гуманизированные антитела, полученные с помощью технологией рекомбинации генов; и человеческие антитела, полученные, например, в трансгенных животных, продуцирующих человеческие антитела. При введении антитела согласно настоящему изобретению человеку в качестве лекарственного средства, антитело желательно является гуманизированным антителом или человеческим антителом с точки зрения побочных эффектов.

[0036]

Конкретные примеры нейтрализующего антитела против RGMa согласно настоящему изобретению включает следующие антитела (a1) - (l2), которые могут быть получены с применением способов, описанных в Патентных документах 2-4.

[0037]

Нейтрализующее антитело против RGMa согласно настоящему изобретению выбрано из:

(a1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитела, эпитопами которых являются SEQ ID NO: 36, 37 и 39);

(b1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, включающую SFG

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитела, эпитопами которых являются SEQ ID NO: 36, 37 и 38);

(c1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22;

(d1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 26, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 27, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 28;

(e1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(f1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(g1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40, и вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(h1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 41, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(i1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 42, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(j1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(k1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 44, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16); и

(l1) нейтрализующих антител против RGMa, включающих

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 45, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16).

Более предпочтительно нейтрализующее антитело против RGMa настоящего изобретения выбрано из следующих (a2)-(l2):

(a2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 5, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 6, и LCDR3, состоящий из последовательности аминокислот, представленной SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 8, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 9, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 10

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитела, эпитопами которых являются SEQ ID NO: 36, 37 и 39);

(b2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 11, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 13, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 14, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 15, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности SFG

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитела, эпитопами которых являются SEQ ID NO: 36, 37 и 38);

(c2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 17, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 18, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 19, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 20, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 21, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 22;

(d2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 23, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 24, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 25, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 26, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 27, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 28;

(e2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 31, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(f2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 35, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(g2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 40, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(h2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 41, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(i2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 42, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(j2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 43, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16);

(k2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 44, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16); и

(l2) нейтрализующих антител против RGMa, включающих:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 29, LCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 30, и LCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 45, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 32, HCDR2, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 33, и HCDR3, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 34

(эти нейтрализующие антитела против RGMa также включают антитело, эпитопом которого является SEQ ID NO: 16).

Из них антитела, описанные в (a2), являются особенно предпочтительными.

[0038]

Нейтрализующие антитела против RGMa настоящего изобретения могут быть получены с использованием стандартных и обычно используемых способов получения. Антигены могут непосредственно использоваться для иммунизации или могут использоваться в виде комплекса с белком-носителем. Для получения комплекса антигена и белка-носителя могут использоваться конденсирующие агенты, такие как глутаровый альдегид, карбодиимиды и малеимидные активные сложные эфиры. Примеры белка-носителя включают бычий сывороточный альбумин, тиреоглобулин, гемоцианин и KLH.

[0039]

Примеры иммунизируемого млекопитающего включают мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов, кошек, собак, свиней, коз, лошадей и рогатый скот. Примеры способа инокуляции включают подкожное, внутримышечное и внутрибрюшинное введение. При введении антигены могут вводить в смеси с полным или неполным адъювантом Фрейнда и обычно вводят один раз в 2-5 недель. Антителопродуцирующее клетки, получаемые из селезенки или лимфатических узлов иммунизированных животных, подвергают слиянию с миеломными клетками и выделяют в виде гибридом. В качестве миеломных клеток используют клетки, полученные у млекопитающих, таких как мышь, крыса и человек.

[0040]

Поликлональные антитела могут быть получены, например, путем иммунизации описанных выше млекопитающих антигенами, описанными выше, при необходимости в комбинации с адъювантом Фрейнда, и получения поликлональных антител из сыворотки, полученной у иммунизированных животных.

[0041]

Моноклональные антитела могут получать, например, при использовании методов, описанных в "Current Protocols in Molecular Biology" (John Wiley & Sons (1987)), Antibodies: A Laboratory Manual, Ed. Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). "Гибридомы", секретирующие моноклональные антитела, могут быть получены согласно методу Келера и Милстейна и соавт. (Köhler and Milstein et al., Nature, 256, 495, 1975) или модифицированному методу на его основе. В частности, моноклональные антитела могут быть получены, как описано ниже. Описанный выше антиген используют в качестве иммуногена, при этом иммуноген вводят или прививают один или более раз, при необходимости в комбинации с адъювантом Фрейнда, млекопитающему, как описано выше, подкожно, внутримышечно, внутривенно, в лапу или внутрибрюшинно для иммунизации. Как правило, иммунизацию проводят 1-4 раза каждые 1-14 дней после начальной иммунизации, и через приблизительно 1-5 дней после последней иммунизации антителопродуцирующие клетки получают у иммунизированного млекопитающего.

[0042]

Гибридому получают путем слияния антителопродуцирующей клетки и миеломной клетки, не обладающей способностью продуцировать аутоантитело, которую получают у млекопитающего, предпочтительно мыши, крысы или человека, при использовании активатора слияния при необходимости.

[0043]

Примеры миеломной клетки, которая может использоваться при слиянии клеток, включают мышиные миеломы, такие как P3/X63-AG8.653 (653), P3/NSI/1-Ag4-1 (NS-1), P3/X63-Ag8.U1 (P3U1), SP2/0-Ag14 (Sp2/O, Sp2), PAI, F0 и BW5147; крысиные миеломы, такие как 210RCY3-Ag.2.3.; и человеческие миеломы, такие как U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, D1R11 и CEM-T15.

[0044]

Примеры активатора слияния включают полиэтиленгликоли. Слияние клеток обычно могут проводить, позволяя антителопродуцирующим клеткам и миеломным клеткам взаимодействовать при соотношении количеств клеток обычно от приблизительно 1:1 до 10:1, с использованием полиэтиленгликолей (со средней молекулярной массой от 1000 до 4000) с концентрацией от приблизительно 20 до 50%, при температуре от 20 до 40°C, предпочтительно от 30 до 37°C, в течение приблизительно 1-10 минут.

[0045]

Скрининг клонов гибридом, продуцирующих моноклональные антитела, можно проводить при культивировании гибридом, например в микротитровальных планшетах, и измерении реактивности культуральных супернатантов в лунках против иммуногена с помощью иммунохимических методов, таких как ИФА.

[0046]

При скрининге антителопродуцирующих гибридом, в дополнение к анализу связывания с белком RGMa также определяют, ингибирует ли антитело активность RGMa согласно настоящему изобретению. Способы скрининга позволяют отбирать нейтрализующее антитело против RGMa согласно настоящему изобретению.

[0047]

Клоны могут затем получать из лунок, содержащих гибридомы, продуцирующие требуемые антитела, при клонировании методом серийных разведений. Гибридомы обычно отбирают и выращивают в среде для культивирования клеток животных, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку с добавкой HAT (гипоксантин, аминоптерин и тимидин).

[0048]

Моноклональные антитела могут быть получены из гибридом при культивировании гибридом in vitro или выращивании их in vivo, например, в асцитной жидкости млекопитающих, таких как мыши и крысы, и выделении моноклональных антител из полученных в результате супернатантов культур или асцитной жидкости млекопитающих.

[0049]

При культивировании in vitro в соответствии с различными условиями, такими как характеристики и способ культивирования типов клеток, подлежащих культивированию, гибридомы можно выращивать, поддерживать и хранить при использовании питательных сред, подходящих для продукции моноклональных антител в супернатанте культуры. В качестве питательной среды можно использовать, например, известную питательную среду или питательную среду, приготовленную из базальной среды.

[0050]

Примеры базальных сред включают среды с низким содержанием кальция, такие как среда Хэма F12, среда MCDB 153 и среда MEM с низким содержанием кальция, а также среды с высоким содержанием кальция, такие как среда MCDB 104, среда MEM, среда D-MEM, среда RPMI 1640, среда ASF 104 и среда RD. Базальная среда может содержать, в соответствии с назначением, например, сыворотки, гормоны, цитокины и/или различные неорганические или органические вещества.

[0051]

Моноклональные антитела можно выделять и очищать, например, подвергая описанный выше супернатант культуры или асцитную жидкость обработке насыщенным сульфатом аммония, осаждению эуглобулина, обработке капроновой кислотой, обработке каприловой кислотой, ионообменной хроматографии (такой как ДЭАЭ или DE52) или аффинной колоночной хроматографии, такой как колонка против иммуноглобулина или колоночная хроматография с белком А. В частности, моноклональные антитела могут быть очищены любым способом, известным как способ очистки иммуноглобулинов, при этом очистка может быть легко достигнута такими способами, как обработка с фракционированием сульфатом аммония, обработка с фракционированием ПЭГ, обработка с фракционированием этанолом, применение анионообменных смол и другие методы аффинной хроматографии с использованием белков RGMa.

[0052]

Моноклональные антитела также можно получать методом фагового дисплея. В методе фагового дисплея отобранные из фаговой библиотеки антител фаги подвергают скринингу с использованием требуемого иммуногена и отбирают фаги, обладающие требуемой способностью связывания с иммуногеном. Затем соответствующую антителу последовательность, содержащуюся в фаге, выделяют или секвенируют. На основе информации из выделенной последовательности или секвенирования конструируют вектор экспрессии, включащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антитело или антигенсвязывающий домен. Затем вектор экспрессии трансфицируют в линию клеток и линию клеток могут культивировать с получением моноклонального антитела. При использовании библиотеки человеческих антител в качестве фаговой библиотеки антител может быть получено человеческое антитело, обладающее требуемой связывающей способностью.

[0053]

Например, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело против RGM или его фрагмент, может быть получена следующим способом. Сначала суммарную РНК получают из клетки, такой как гибридома, при использовании доступного в продаже набора для выделения РНК, а затем синтезируют кДНК с использованием обратной транскриптазы и случайных праймеров и т.п. Затем с помощью метода ПЦР при использовании в качестве праймеров олигонуклеотидов, имеющих консервативные последовательности генов в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи известного человеческого антитела, амплифицируют кДНК, кодирующие антитело. Последовательности, кодирующие константные области, могут быть получены при амплификации известных последовательностей методом ПЦР. Нуклеотидную последовательность ДНК можно секвенировать стандартным методом, например, путем ее включения в плазмиду для секвенирования.

В альтернативе, ДНК, кодирующая моноклональное антитело согласно настоящему изобретению, также может быть получена с помощью химического синтеза последовательностей вариабельных областей или их частей и соединения их в последовательности, включающие константные области.

Молекула нуклеиновой кислоты может кодировать все константные области и вариабельные области тяжелой и легкой цепей или может кодировать только вариабельные области тяжелой и легкой цепей. В случае кодирования всех константных областей и вариабельных областей нуклеотидные последовательности константных областей тяжелой и легкой цепей предпочтительно являются последовательностями, описанными в Nucleic Acids Research vol.14, p1779, 1986; The Journal of Biological Chemistry vol.257, p1516, 1982; and Cell vol.22, p197, 1980.

[0054]

Функционально модифицированные антитела получают следующими способами. Например, полупериод существования в крови можно увеличить при использовании варианта Fc-области с повышенным связыванием с FcRn, одним из Fc-рецепторов (Hashiguchi Shuhei et al., The Journal of Japanese Biochemical Society, Vol.82 (8), p710 (2010)). Такие функционально модифицированные антитела могут быть получены с помощью методов генной инженерии.

[0055]

Примеры конъюгированных антител включают нейтрализующие антитела против RGMa, которые химически или с помощью методов генной инженерии связаны с функциональными молекулами, отличными от настоящего нейтрализующего антитела против RGMa, такими как непептидные полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), радиоактивные вещества, токсины, низкомолекулярные соединения, цитокины, факторы роста (такие как TGF-β, NGF, нейротрофин), альбумин, ферменты и другие антитела.

[0056]

В случае связывания с ПЭГ в качестве функциональной молекулы, может использоваться ПЭГ, имеющий неограничивающую молекулярную массу от 2000 до 100000 Да, более предпочтительно от 10000 до 50000 Да, который может быть линейным или разветвленным. При использовании активной NHS группы и т.п., ПЭГ может быть связан, например, с N-концевой аминогруппой в аминокислотах ингибирующего RGMa вещества.

[0057]

При использовании радиоактивного вещества в качестве функциональной молекулы соответствующие примеры включают ¹³¹I, ¹²⁵I, ⁹⁰Y, ⁶⁴Cu, ⁹⁹Tc, ⁷⁷Lu и ²¹¹At. Радиоактивное вещество может быть непосредственно связано с ингибирующим RGMa веществом при использовании хлорамина-Т и т.п.

[0058]

При использовании токсина в качестве функциональной молекулы соответствующие примеры включают бактериальные токсины (такие как дифтерийный токсин), фитотоксины (такие как рицин), малые токсины (такие как гелданамицин), также используются майтанзиноиды и калихеамицин.

[0059]

При использовании низкомолекулярного соединения в качестве функциональной молекулы соответствующие примеры включают дауномицин, доксорубицин, метотрексат, митомицин, неокарциностатин, виндезин и флуоресцентные красители, такие как ФИТЦ.

[0060]

При использовании фермента в качестве функциональной молекулы соответствующие примеры включают люциферазу (такую как люцифераза светляка и бактериальная люцифераза; патент США 4,737,456), малатдегидрогеназы, уреазы, пероксидазы (такие как пероксидазу хрена (HRPO)), щелочные фосфатазы, β-галактозидазы, глюкоамилазы, лизоцимы, сахаридооксидазы (такие как глюкозооксидазу, галактозооксидазу и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу), гетероциклические оксидазы (такие как уриказу и ксантиноксидазу), лактопероксидазы и микропероксидазы.

[0061]

Примеры линкеров, используемых для химического связывания токсина, низкомолекулярного соединения или фермента, включают двухвалентные радикалы (таких как алкилен, арилен и гетероарилен), линкеры, представленные -(CR₂)_nO(CR₂)_n- (где R является любым заместителем, и n является положительным целым числом), алкоксильные звенья (такие как полиэтиленокси, ПЭГ и полиметиленокси), алкиламино звенья (такие как полиэтиленамино и Jeffamine^TM), и сложные эфиры и амиды двухосновных кислот (включающие сукцинат, сукцинамид, дигликолат, малонат и капрамид). Химические методы модификации для связывания функциональных молекул уже были установлены в данной области (D. J. King., Applications and Engineering of Monoclonal antibodies., 1998 T.J. International Ltd, Monoclonal Antibody-Based Therapy of Cancer., 1998 Marcel Dekker Inc; Chari et al., Cancer Res., 1992 Vol.152: 127; Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA., 1996 Vol 93: 8681).

[0062]

В вариантах осуществления настоящего изобретения "фрагменты" антител означают неполные области, обладающие антигенсвязывающими свойствами, полученные из антител, как описано выше. Конкретные примеры фрагментов включают F(ab')₂, Fab', Fab, Fv (вариабельный фрагмент антитела), связанный дисульфидной связью Fv, одноцепочечные антитела (scFv) и их полимеры. Примеры фрагментов также включают конъюгированные фрагменты, которые химически или генно-инженерно связаны с функциональными молекулами, отличными от настоящего нейтрализующего антитела против RGMa, такими как непептидные полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ), радиоактивные вещества, токсины, низкомолекулярные соединения, цитокины, факторы роста (такие как TGF-β, NGF и нейротрофин), альбумин, ферменты и другие антитела.

[0063]

Термины "F(ab')₂" и "Fab" означают фрагменты антител, полученные при обработке иммуноглобулина протеазой, такой как пепсин или папаин, или полученные при расщеплении перед или после дисульфидной связи, присутствующей между двумя тяжелыми цепями в шарнирной области. Например, IgG можно обработать папаином для расщепления перед дисульфидной связью, присутствующей между двумя тяжелыми цепями в шарнирной области, с получением двух гомологичных фрагментов антител, каждый из которых включает легкую цепь, включающую VL (вариабельную область легкой цепи) и CL (константную область легкой цепи), и фрагмент тяжелой цепи, включающий VH (вариабельную область тяжелой цепи) и CHγ1 (область γ1 в константной области тяжелой цепи), где легкая цепь и фрагмент тяжелой цепи соединены друг с другом дисульфидной связью в С-концевом домене. Два гомологичных фрагмента антитела называются Fab-фрагментами. IgG можно обработать пепсином для расщепления после дисульфидной связи, присутствующей между двумя тяжелыми цепями в шарнирной области, с получением фрагмент аантитела, который немного больше, чем два Fab, соединенных друг с другом в шарнирной области. Этот фрагмент антитела называется F(ab')₂.

[0064]

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой химерное антитело. Примеры "химерного антитела" включают антитела, в которых вариабельные области получены из иммуноглобулинов не относящихся к человеку животных (таких как мышь, крыса, хомяк и курица), а константные области получены из иммуноглобулинов человека. Химерное антитело может быть получено, например, при иммунизации мыши антигеном, удаления вариабельной области, которая связывается с антигеном, из гена, кодирующего моноклональное антитело мыши, и соединения вариабельной области с константной областью антитела, полученного из костного мозга человека. Константная область, полученная из человеческого иммуноглобулина, имеет уникальную аминокислотную последовательность в зависимости от изотипа, такого как IgG (IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgM, IgA (IgA1 или IgA2), IgD или IgE. Константная область рекомбинантного химерного антитела согласно настоящему изобретению может быть константной областью человеческого иммуноглобулина, который относится к любому из изотипов. Константная область предпочтительно представляет собой константную область IgG человека. Полученный таким образом ген химерного антитела можно использовать для получения вектора экспрессии. Клетку-хозяин трансформируют вектором экспрессии с получением трансформированной клетки, которая продуцирует химерное антитело. Затем трансформированные клетки культивируют с получением требуемого химерного антитела из супернатанта культуры.

[0065]

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой гуманизированное антитело. "Гуманизированное антитело" согласно настоящему изобретению является антителом, полученным при перевивании последовательности ДНК только антигенсвязывающего участка (CDR-областей; определяющих комплементарность областей) антитела, полученного от не относящегося к человеку животного, такого как мышь, в ген человеческого антитела (CDR-графтинг). Гуманизированное антитело можно получать способами, описанными, например, в публикации не прошедшей экспертизу заявки на патент Японии 1992-506458 и в патенте Японии 2912618. В частности, гуманизированное антитело содержит CDR-области, частично или полностью полученные из моноклональных антител млекопитающих, не относящихся к человеку (таких как мышь, крыса и хомяк); каркасные области, полученные из вариабельных областей иммуноглобулинов человека; и константные области, полученные из иммуноглобулинов человека.

[0066]

Гуманизированное антитело согласно настоящему изобретению может быть получено, например, как описано ниже. Впрочем, совершенно очевидно, что способ получения не ограничивается этим.

[0067]

Например, рекомбинантное гуманизированное антитело, полученное из мышиного моноклонального антитела, может быть получено с помощью генной инженерии со ссылкой на публикацию не прошедшей экспертизу заявки на патент Японии 1992-506458 и публикацию не прошедшей экспертизу заявки на патент Японии 1987-296890. В частности, ДНК, кодирующую часть CDR-областей мышиной тяжелой цепи, и ДНК, кодирующую часть CDR-областей мышиной легкой цепи, выделяют из гибридом, продуцирующих мышиное моноклональное антитело. Кроме того, ген тяжелой цепи человека, кодирующий всю область, отличную от CDR-областей тяжелой цепи человека, и ген легкой цепи человека, кодирующий всю область, отличную от CDR-областей легкой цепи человека, выделяют из гена иммуноглобулина человека.

[0068]

Выделенную ДНК, кодирующую часть CDR-областей мышиной тяжелой цепи, перевивают в ген тяжелой цепи человека, и полученный продукт вводят в соответствующий вектор экспрессии так, чтобы он мог экспрессироваться. Аналогичным образом, ДНК, кодирующая часть CDR-областей мышиной легкой цепи, перевивают в ген легкой цепи человека, и полученный продукт вводят в другой подходящий вектор экспрессии так, чтобы он мог экспрессироваться. В альтернативе гены тяжелой и легкой цепей человека, в которые перевивают мышиные CDR-области, могут быть введены в один вектор экспрессии так, чтобы они могли экспрессироваться. Клетку-хозяин трансформируют полученным таким образом вектором экспрессии с получением трансформированной клетки, продуцирующей гуманизированное антитело. Затем трансформированные клетки культивируют с получением требуемого гуманизированного антитела из супернатанта культуры.

[0069]

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело против RGMa является человеческим антителом. Термин "человеческое антитело" относится к антителу, в котором вся область, включая вариабельные области тяжелой цепи и константные области тяжелой цепи, а также вариабельные области легкой цепи и константные области легкой цепи, формирующие иммуноглобулин, получены из генов, кодирующих человеческие иммуноглобулины. Человеческие антитела могут быть получены при введении генов человеческих антител мышам. Человеческие антитела могут быть получены так же, как в описанном выше способе получения поликлональных антител или моноклональных антител. В частности, например, способ включает введение, по меньшей мере, генов иммуноглобулинов человека в локусы генов не относящегося к человеку млекопитающего, такого как мышь, с получением трансгенного животного и иммунизацию трансгенного животного антигеном.

[0070]

Например, трансгенная мышь, продуцирующая человеческое антитело, может быть получена согласно способам, описанным, например, в Nature Genetics, Vol.7, p.13-21, 1994; Nature Genetics, Vol.15, p.146-156, 1997; публикациях не прошедших экспертизу заявок на патент Японии 1992-504365 и 1995-509137; WO 94/25585; Nature, Vol.368, p.856-859, 1994; и публикации не прошедшей экспертизу заявки на патент Японии 1994-500233. В частности, например, используют мышь HuMab® (Medarex, Princeton NJ), мышь KMTM (Kirin Pharma Company, Japan) и мышь KM (FCγRIIb-KO).

[0071]

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения нейтрализующее антитело против RGMa содержит CDR-области, содержащие специфические аминокислотные последовательности в вариабельной области тяжелой цепи, и содержит CDR-области, содержащие специфические аминокислотные последовательности в вариабельной области легкой цепи (антитела (a1)-(l2), описанные выше).

Аминокислотная последовательность нейтрализующего антитела против RGMa может содержать замену, делецию, добавление или вставку одной или более (от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 5, от 1 до 3 или от 1 до 2) аминокислот при условии, что антитело согласно настоящему изобретению сохраняет способность связываться с RGMa и ингибировать (нейтрализовать) активность RGMa. Замена, делеция или добавление могут быть введены в CDR-области. Впрочем, предпочтительно вводить их в область, отличную от CDR. Аминокислотная замена предпочтительно является консервативной заменой с сохранением характеристик согласно настоящему изобретению.

[0072]

Если аминокислотная последовательность антитела согласно настоящему изобретению содержит замену, делецию и т.п., например, аминокислотная последовательность после модификации вариабельной области тяжелой цепи обладает идентичностью 90% или больше (более предпочтительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше) с аминокислотной последовательностью до модификации, и аминокислотная последовательность после модификации вариабельной области легкой цепи обладает идентичностью 90% или больше (более предпочтительно 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или больше) с аминокислотной последовательностью до модификации.

[0073]

Термин "миРНК" относится к короткой двухцепочечной РНК, способной ингибировать экспрессию гена-мишени (ген RGMa в настоящем изобретении). Нуклеотидная последовательность и длина (длина в основаниях) особо не ограничены при условии сохранения действия в качестве миРНК, ингибирующей активность RGMa в настоящем изобретении. Длина в основаниях предпочтительно составляет меньше чем приблизительно 30 оснований, более предпочтительно приблизительно 19-27 оснований, еще более предпочтительно приблизительно 21-25 оснований. Термин "мшРНК" относится к одноцепочечной РНК, частично включающей палиндромную нуклеотидную последовательность, образующую двухцепочечную структуру в молекуле, что приводит к молекуле длиной приблизительно 20 пар азотистых оснований или больше, имеющей 3'-выступающий конец и короткую шпилечную структуру. Такая мшРНК может быть введена в клетку и затем может расщепляться в клетке с образованием фрагмента длиной приблизительно 20 оснований (как правило, например, 21, 22 или 23 основания), который ингибирует экспрессию гена-мишени так же, как миРНК. В настоящем изобретении миРНК и мшРНК могут иметь любую форму при условии, что они могут ингибировать экспрессию гена RGMa.

[0074]

Искусственные миРНК или мшРНК могут быть синтезированы химически. Антисмысловые и смысловые РНК также могут быть синтезированы in vitro с ДНК-матриц при использовании, например, РНК-полимеразы Т7 и промотора Т7. Антисмысловой олигонуклеотид может быть нуклеотидом, который комплементарен или гибридизуется с непрерывной нуклеотидной последовательностью, имеющей длину от 5 до 100 в последовательности ДНК гена RGMa, и может представлять собой ДНК или РНК. Антисмысловой олигонуклеотид может быть модифицирован без нарушения его функции. Антисмысловой олигонуклеотид может быть синтезирован стандартным способом. Например, антисмысловой олигонуклеотид можно легко синтезировать с помощью доступного в продаже синтезатора ДНК.

Предпочтительная последовательность может быть выбрана с помощью стандартного метода отбора, и валидация в качестве миРНК или мшРНК в соответствии с настоящим изобретением может быть выполнена путем оценки ингибирования экспрессии функционального RGMa.

[0075]

В вариантах осуществления настоящего изобретения периферическая нейропатия является, например, диабетической нейропатией; туннельной нейропатией, такой как синдром запястного канала, локтевая нейропатия кубитального канала, паралич малоберцового нерва и синдром предплюсневого канала, семейной амилоидной полинейропатией, токсической нейропатией, канцероматозной нейропатией, иммуноопосредованной нейропатией, такой как синдром Гийена-Барре (СГБ) и хроническая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (ХВДП), нейропатией, ассоциированной с заболеваниями соединительной ткани, синдромом Кроу-Фукасе (POEMS-синдромом); наследственной нейропатией, такой как болезнь Шарко-Мари-Тута, постгерпетической невралгией, периферической нейропатией, ассоциированной со СПИДом или болезнью Лайма, уремией, мультифокальной двигательной нейропатией или васкулитной нейропатией.

[0076]

В других вариантах осуществления настоящего изобретения заболевания, включающие астроцитарное повреждение, включают заболевания, при которых наблюдается астроцитарное повреждение или астроцитарная гипофункция, в частности, включают оптиконевромиелит и болезнь Александера.

В таких вариантах осуществления предпочтительные периферические нейропатии включают диабетическую нейропатию. Предпочтительные заболевания, включающие астроцитарные повреждения, включают оптиконевромиелит.

[0077]

В других вариантах осуществления настоящего изобретения болевые симптомы, связанные с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, включают симптомы, вызванные повреждениями периферических нервов или астроцитарными повреждениями или гипофункцией в центральной нервной системе. В настоящем изобретении заболевания, включающие периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, которые вызывают болевые симптомы, являются синонимами заболеваний, включающих периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, описанные выше.

Например, в отношении заболеваний, включающих периферические нейропатии, вызывающие такие болевые симптомы, как показано в Примере 1 (1-6), описанном ниже, ингибирующее RGMa вещество, например антитело против RGMa, улучшает скорость нервной проводимости, что указывает на то, что ингибирующие RGMa вещества лечат заболевания, связанные с периферическими нейропатиями. Кроме того, ингибирующее RGMa вещество также уменьшает боль, что указывает на то, что ингибирующие RGMa вещества проявляют обезболивающее действие против болей, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии.

[0078]

В качестве механизма действия, который может вызывать болевые симптомы, связанные с заболеваниями, включающими астроцитарные повреждения, астроцитарные повреждения или гипофункции могут вызывать снижение экспрессии переносчика глутамата в центральных нервах, что приводит к усилению действия глутамата и сверхчувствительности или возбуждению нервов (например, Neuron 67, 834-846, 9 сентября, 2010). Болевые симптомы включают симптом, связанный с началом заболевания, например, онемение, боль или гипестезию вследствие астроцитарных повреждений.

[0079]

Таким образом, как показано в Примере 1 (1-6), описанном ниже, в модели STZ-индуцированной диабетической нейропатии у крыс, в которой вызывают периферическую нейропатию и астроцитарное повреждение, которое приводит к развитию болей, ингибирующее RGMa вещество, например антитело против RGMa, проявляет обезболивающее действие против боли. С другой стороны, ингибирующее RGMa вещество, например нейтрализующее антитело против RGMa, не вызывает уменьшение микроглии, но демонстрирует подавление снижения количества астроцитов, что указывает на то, что ингибирующее RGMa вещество, например нейтрализующее антитело против RGMa, проявляет обезболивающее действие против болей, связанных с заболеваниями, включающими астроцитарные повреждения или гипофункции. Таким образом, на основе экспериментальных результатов в Примере 1 можно ожидать, что ингибирующие RGMa вещества, предпочтительно нейтрализующие антитела против RGMa, будут воздействовать на болевые симптомы, связанные с одним или обоими заболеваниями, включающими периферическую нейропатию или астроцитарные повреждения. В Непатентном документе 10 были проведены эксперименты по повреждению астроцитов при оптиконевромиелите. Однако, поскольку эта экспериментальная модель является моделью на животных, в которой недоступна оценка боли, взаимосвязь между заболеваниями, включающими астроцитарные повреждения, и болевыми симптомами из этого документа неизвестна. Таким образом, взаимосвязь между заболеваниями, включающими повреждения астроцитов, и болевыми симптомами является новым открытием, полученным в Примере 1 в настоящем документе.

[0080]

В предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения, например, диабетические нейропатии, которые являются наиболее распространенными осложнениями у больных диабетом, вызваны известными факторами риска, связанными с развитием, такими как плохо контролируемый уровень глюкозы в крови, большая продолжительность сахарного диабета, артериальная гипертензия и дислипидемия, но их патогенный механизм пока не был идентифицирован. Диабетические нейропатии подразделяются на дистальные симметричные полинейропатии и локальные мононейропатии. В частности, первые считаются основны симптомом диабетических нейропатий и включают сенсорные нейропатии, двигательные нейропатии и автономные нейропатии.

[0081]

Специфических симптомов или тестов для диагностики диабетической нейропатии не существует. Таким образом, общее решение выносят при тщательном исследовании неврологических симптомов у пациентов и посредством неврологических обследований, таких как ощущение боли, ощущение вибрации, тактильное ощущение и тест на сухожильный рефлекс.

Основные симптомы диабетической нейропатии включают сенсорные нейропатии, двигательные нейропатии и вегетативные нейропатии. Сенсорные нейропатии включают болезненные нейропатии с выраженной паралгезией и бессимптомные нейропатии без спонтанной парестезии. Сенсорные нейропатии вызывают онемение и боль на конце нижней конечности на ранней стадии своего развития, после чего по мере прогрессирования симптомов появляется выраженная гипестезия. Кроме того, прогрессирование симптомов также приводит к появлению таких симптомов, как онемение, боль и гипестезия, не только на концах нижних конечностей, но также и на концах верхних конечностей. Сенсорные нейропатии приводят не только к снижению качества жизни пациентов, но также могут приводить, после прогрессирования симптомов и появления гипестезии, к более высокому риску гангрены стопы и сустава Шарко, что в дальнейшем может привести к ампутации рук и ног и ухудшению прогноза выживаемости. Таким образом, при диабетической нейропатии терапевтические вмешательства крайне необходимы с ранней стадии развития. С другой стороны, двигательные нейропатии характеризуются, в частности, такими симптомами, как мышечная слабость нижних конечностей, атрофия мышц и деформация стопы. Хотя обычно эти симптомы не так заметны, чтобы повлиять на повседневную деятельность, эти симптомы влияют на ходьбу с нагрузкой, например, сохранение равновесия, подъем и спуск с возвышенностей и лестниц и быстрая ходьба, по мере прогрессирования симптомов.

Средство для предупреждения или лечения диабетических нейропатий согласно настоящему изобретению может применяться для облегчения симптомов, обнаруженных в тесте, или для предупреждения или лечения симптома, выбранного из таких симптомов.

[0082]

Среди диабетических нейропатий, демонстрирующих симптомы, диабетические нейропатии, подлежащие предупреждению или лечению средством для предупреждения или лечения диабетических нейропатий согласно настоящему изобретению, предпочтительно включают болезненные диабетические нейропатии и бессимптомные диабетические нейропатии, более предпочтительно болезненные диабетические нейропатии.

[0083]

При использовании в настоящем документе термин "лечить" включает любое лечение заболеваний у млекопитающих, в особенности у человека, и включает подавление симптомов заболеваний или замедление их прогрессирования, или устранение заболеваний или симптомов и облегчение симптомов заболевания, или инвертирование течения заболеваний или симптомов, или задержку прогрессирования симптомов. Термин "лечить" в настоящем изобретении означает непосредственное лечение диабетических нейропатий, лечение диабетических нейропатий не на основе терапий для лечения сахарного диабета, таких как гипогликемическое действие. В других вариантах осуществления настоящего изобретения термин "лечить" означает терапевтическое, регенирирующее нервы или защищающее нервы, местное или системное лечение.

[0084]

Термин "предупреждать" включает предотвращение возникновения описанных выше заболеваний у млекопитающих, в особенности у человека.

[0085]

Средство для предупреждения или лечения периферических нейропатий или болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, согласно настоящему изобретению обычно вводят системно или местно в форме для перорального или парентерального введения.

Средство для предупреждения или лечения периферических нейропатий или болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, согласно настоящему изобретению может быть изготолвено в форме фармацевтической композиции, включающей ингибирующее RGMa вещество в качестве действующего вещества и фармацевтически приемлемый носитель или добавку при необходимости. В частности, средство может быть изготовлено в форме средств для перорального введения, таких как таблетки, таблетки, покрытые оболочкой, пилюли, порошки, гранулы, капсулы, растворы, суспензии и эмульсии; или в форме средств для парентерального введения, таких как формы для инъекций, инфузий, суппозитории, мази и трансдермальные пластыри. Соотношение содержания носителя или добавки может быть установлено при необходимости в соответствии с границами, обычно используемыми в области фармацевтики. Носитель или добавка, которые могут быть добавлены, особо не ограничены и включают различные носители, такие как воду, физиологический раствор, другие водные растворители, водные или масляные основы; а также различные добавки, такие как вспомогательные вещества, связующие вещества, регуляторы pH, разрыхлители, усилители всасывания, смазывающие вещества, красители, ароматизаторы и отдушки.

[0086]

В случаях, когда ингибирующее RGMa вещество является нейтрализующим антителом против RGMa, функционально модифицированным антителом на его основе, конъюгированным антителом на его основе или его фрагментом, средство предпочтительно изготавливают в форме для инъекции или инфузии с фармацевтически приемлемым носителем и вводят парентеральным путем введения, таким как внутривенное, внутримышечное, внутрикожное, внутрибрюшинное, подкожное или местное введение. Форма для инъекции или инфузии, содержащая нейтрализующее антитело против RGMa, может использоваться в виде раствора, суспензии или эмульсии. Примеры растворителя включают дистиллированную воду для инъекций, физиологический раствор, раствор декстрозы в воде и изотонические растворы (например, растворы хлорида натрия, хлорида калия, глицерина, маннита, сорбита, бората, бората натрия и пропиленгликоля). Форма для инъекции или инфузии может дополнительно содержать, например, стабилизатор, солюбилизатор, суспендирующее вещество, эмульгатор, смягчающее вещество, буферное вещество, консервант, антисептик и регулятор pH. Примеры стабилизатора включают альбумин, глобулин, желатин, маннит, глюкозу, декстран, этиленгликоль, пропиленгликоль, аскорбиновую кислоту, бисульфит натрия, тиосульфат натрия, натриевую соль ЭДТА, цитрат натрия и дибутилгидрокситолуол. Примеры солюбилизатора включают спирты (такие как этанол), многоатомные спирты (такие как пропиленгликоль и полиэтиленгликоль) и неионогенные поверхностно-активные вещества (такие как полисорбат 80® и HCO-50). Примеры суспендирующего вещества включают глицерилмоностеарат, моностеарат алюминия, метилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксиметилцеллюлозу и лаурилсульфат натрия. Примеры эмульгатора включают гуммиарабик, альгинат натрия и трагакант. Примеры смягчающего вещества включают бензиловый спирт, хлорбутанол и сорбит. Примеры буферного вещества включают фосфатный буфер, ацетатный буфер, боратный буфер, карбонатный буфер, цитратный буфер и Трис-буфер. Примеры консерванта включают метилпарагидроксибензоат, этилпарагидроксибензоат, пропилпарагидроксибензоат, бутилпарагидроксибензоат, хлорбутанол, бензиловый спирт, хлорид бензалкония, дегидроацетат натрия, эдетат натрия, борную кислоту и борат натрия. Примеры антисептика включают хлорид бензалкония, парагидроксибензойную кислоту и хлорбутанол. Примеры регулятора pH включают соляную кислоту, гидроксид натрия, фосфорную кислоту и уксусную кислоту.

[0087]

Если ингибирующее RGMa вещество является нуклеиновой кислотой (такой как молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая миРНК, мшРНК, антисмысловой олигонуклеотид или нейтрализующее антитело против RGMa или его фрагмент), его могут вводить в форме невирусного или вирусного вектора. Если ингибирующее RGMa вещество вводят в форме невирусного вектора, например, способ введения молекулы нуклеиновой кислоты при использовании липосомы (такой как липосомный метод, метод с использованием HVJ-липосом, метод с использованием катионных липосом, липофекция или метод с использованием липофектамина), микроинъекции или метода переноса молекулы нуклеиновой кислоты с носителем (частицей металла) в клетку с помощью генной пушки. Если ингибирующее RGMa вещество вводят в форме вирусного вектора, например, могут использовать вирусный вектор, такой как рекомбинантный аденовирус или ретровирус. ДНК, которая экспрессирует миРНК или мшРНК, может быть введена в ДНК-вирус или РНК-вирус, такой как аттенуированный ретровирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, герпесвирус, вирус осповакцины, поксвирус, полиовирус, вирус Синдбис, вирус Сендай или SV40. Клетку или ткань могут инфицировать рекомбинантным вирусом с целью введения гена в клетку или ткань.

[0088]

Полученный таким образом состав могут вводить субъекту, нуждающемуся в этом, например, человеку или другому млекопитающему (такому как крыса, мышь, кролик, овца, свинья, рогатый скот, кошка, собака или обезьяна), в эффективной дозе для предупреждения или лечения периферических нейропатий, например диабетических нейропатий, или болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения. Дозу устанавливают в зависимости, например, от целей, тяжести заболеваний, возраста, веса, пола и анамнеза пациентов, а также от типов действующих веществ. Например, если действующим веществом является нейтрализующее антитело против RGMa, доза для среднего человека, имеющего вес приблизительно от 65 до 70 кг, предпочтительно составляет приблизительно от 0,02 до 4000 мг в день, более предпочтительно приблизительно от 0,1 до 200 мг в день. Общая суточная доза может быть однократной дозой или разделенными дозами.

[0089]

Средство для предупреждения или лечения периферических нейропатий или болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, согласно настоящему изобретению может применяться в комбинированной терапии или в виде смеси с обычным обезболивающим средством.

Примеры средства, применяемого в комбинации с настоящим изобретением, включают обезболивающие средства и противодиабетические средства.

Примеры обезболивающих средств, которые могут применяться в комбинированной терапии или в виде смеси с настоящим изобретением, включают трициклические антидепрессанты (такие как амитриптилин и имипрамин), α2δ лиганды (такие как прегабалин), блокаторы Na-каналов (такие как мексилетин), противоэпилептические средства (такие как габапентин и карбамазепин), ингибиторы альдозоредуктазы (такие как эпалрестат) и ингибиторы обратного захвата серотонина и норадреналина (SNRI, например, дулоксетин).

[0090]

Примеры противодиабетических средств, которые могут применяться в комбинированной терапии или в виде смеси с настоящим изобретением, включают такие противодиабетические средства, как производные сульфонилмочевины, бигуаниды, средство, снижающее инсулинорезистентность (такое как пиоглитазон), ингибиторы альфа-глюкозидазы, ингибиторы ДПП-4, ингибиторы SGLT-2, аналоги ГПП-1 и аналоги инсулина.

ПРИМЕРЫ

[0091]

Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на Примеры, не ограничивающие объем настоящего изобретения.

[Пример 1]

Исследования эффектов нейтрализующего антитела против RGMa при болях и нарушениях проводимости двигательных нервов в модели STZ-индуцированной диабетической нейропатии у крыс

Модель STZ-индуцированной диабетической нейропатии у крыс является моделью для оценки эффектов при периферической нейропатии, в особенности периферической нейропатии в виде диабетической нейропатии. Кроме того, модель может использоваться для оценки эффектов при периферической нейропатии, в особенности болевых симптомах при диабетической нейропатии, а также для оценки эффектов на болевые симптомы, связанные с заболеваниями, включающими астроцитарные повреждения.

[0092]

(1-1) Подготовка модели STZ-индуцированной диабетической нейропатии у крыс

Для экспериментов использовали самцов крыс линии SD. STZ (стептозоцин) (60 мг/кг), растворенный в 0,75 мМ цитратном буфере (pH 4,5) в концентрации 30%, вводили в хвостовую вену крысы. Через 3 недели крыс, достигших уровня глюкозы в крови 300 мг/дл или больше, использовали в качестве экспериментальной группы STZ (группа диабета). Крысы, имевшие тот же возраст, как и животные в экспериментальной группе, и которым не вводили STZ, использовались в качестве нормальной группы.

[0093]

(1-2) Поведенческая оценка боли

В тесте стимуляции фон Фрея 50% порог отдергивания (г) при наблюдении поднятия задней лапы определяли с помощью метода "вверх-вниз" (см. Chaplan, S.R., Bach, F.W., Pogrel, J.W., Chung, J.M., Yaksh, T.L., Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw, J. Neurosci. Methods, 53, 55-63(1994)), чтобы оценить механическую гипералгезию.

[0094]

(1-3) Измерение Скорости проводимости двигательных нервов (MNCV)

Крысу анестезировали путем непрерывной ингаляции парами изофлурана и удерживали в наклонном положении. MNCV измеряли при поддержании постоянной температуры тела (ректальной температуры) (37,5-38,5°C) с помощью регулятора температуры тела (ATB-1100, Nihon Kohden Corporation).

Игольчатые электроды (отрицательные электроды) вводили в область седалищного бугра правого седалищного нерва в качестве ближней дистальной локализации стимула (S1) и в область голеностопного сустава правого большеберцового нерва в качестве дальней проксимальной локализации стимула (S2). Кроме того, индифферентный электрод (положительный электрод) вводили в участок примерно в 1 см по позвоночнику от S1. Для регистрации ведущий электрод (отрицательный электрод) и электрод сравнения (положительный электрод) вводили неглубоко в правые участки подошвенной мышцы. Электрод сравнения (положительный электрод) помещали на дистальную сторону от отрицательного электрода. Электрические стимулы в виде одиночного прямоугольного импульса (частота стимуляции: 1 Гц, продолжительность: 0,1 мсек, сила тока: сверхмаксимальный, количество стимуляций: один раз) подавали на S1 и S2 с помощью регистратора вызванного потенциала [Neuropack µ (модель: MEB-9102, Nihon Kohden Corporation)] и регистрировали изменения потенциала действия, полученные с помощью регистрирующих электродов. Измеряли задержки от точки стимуляции до фазы возрастания потенциала действия для стимуляции S1 и S2, t1 и t2 (мсек), соответственно, и расстояние между S1 и S2, d (мм), а затем вычисляли MNCV согласно следующей формуле:

MNCV=d/(t1-t2)

[0095]

(1-4) Группировка и введение нейтрализующего антитела против RGMa

Через три недели после введения STZ, животных с уровнем глюкозы в крови 300 мг/дл или меньше исключали из субъектов распределения в группы. Затем оставшихся животных распределяли в группы так, чтобы средние и отклонения массы тела, 50% порог отдергивания и MNCV были однородными. Обработанная STZ/контрольным антителом группа, обработанная STZ/нейтрализующим антителом против RGMa группа и нормальная/обработанная контрольным антителом группа включали по десять животных.

[0096]

Нейтрализующее антитело против RGMa или контрольное антитело (мышиный IgG) вводили в хвостовую вену в дозе 10 мг/кг, один раз в неделю, в течение в общей сложности 4 раза, начиная с точки времени через три недели после введения STZ.

В качестве нейтрализующего антитела против RGMa использовали антитело r116A3, полученное способом, описанным в ссылке (см. Патентный документ 4).

[0097]

(1-5) Патогистологическая оценка при использовании иммунноокрашивания GFAP и Iba1

Через 28 дней после первого введения тестируемого вещества (через 51 день после введения STZ) животных умерщвляли путем обескровливания при перфузии физиологическим раствором и фиксировали при перфузии 10 об. % нейтральным забуференным формалином. После этого спинной мозг извлекали и фиксировали путем погружения в 10 об. % нейтральный забуференный формалин.

Проводили имунноокрашивание на GFAP (окрашивающий астроциты) и Iba1 (окрашивающий микроглию) с целью оценки экспрессии GFAP и Iba1 при патогистологическом исследовании под оптическим микроскопом.

[0098]

Препарат фотографировали на цифровом сканере для гистопрепаратов Aperio (Aperio AT2, Leica Microsystems) (20-кратное увеличение). Затем получали 100% изображение всего образца и конвертировали в изображение JPEG. При использовании программы для анализа изображений Image-Pro premier (версии 9.3.2, Media Cybernetics) в исследуемые области (AOI)были включены передние рога (вентральные рога) и задние рога (дорсальные рога) в области серого вещества. Окрашенные положительные области в SOI выделяли и измеряли (размер: >1 мм²), и вычисляли % окрашенных положительных областей от общей площади SOI. Полученные результаты представлены в виде индивидуальных значений и среднего±стандартная погрешность. Критерий Стьюдента применяли к % окрашенных областей при сравнении группы без диабета и группы с диабетом, а также группы с диабетом и группы с диабетом+получавшей исследуемое вещество.

[0099]

(1-6) Результаты

На ФИГ. 1 показан эффект повторного введения нейтрализующего антитела против RGMa в отношении механической гипералгезии. 50% порог отдергивания, который был снижен при индукции сахарного диабета, был значительно улучшен начиная с недели 1 после введения нейтрализующего антитела против RGMa. Эффект улучшения становился сильнее в каждой неделей, причем действие продолжалось, по меньшей мере, до недели 4 в конечной точке измерения.

[0100]

На ФИГ. 2 показан эффект повторного введения нейтрализующего антитела против RGMa в отношении нарушения проводимости двигательного нерва. Нейтрализующее антитело против RGMa также показало эффект улучшения скорости проводимости двигательного нерва, которая был снижена при индукции сахарного диабета, приведя к значительному улучшению в неделю 4 после начала введения.

[0101]

На ФИГ. 3 показаны результаты вычисления % GFAP-положительной области. В отношении переднего рога, наблюдали значимое уменьшение % GFAP-положительной области в группе с диабетом по сравнению с группой без диабета. В отношении переднего рога и заднего рога, наблюдали значимое увеличение в группе с диабетом+получавшей тестируемое вещество по сравнению с группой с диабетом.

На ФИГ. 4 показаны результаты вычисления % Iba1-положительной области. В отношении переднего рога и заднего рога, наблюдали значимое уменьшение в группе с диабетом по сравнению с группой без диабета.

[0102]

<Описание Списка последовательностей>

SEQ ID NO: 1: Аминокислотная последовательность белка-предшественника RGMa человека

SEQ ID NO: 2: Аминокислотная последовательность белка-предшественника RGMa мыши

SEQ ID NO: 3: Аминокислотная последовательность белка-предшественника RGMa крысы

SEQ ID NO: 4: Последовательность ДНК гена RGMa человека

SEQ ID NO: 5: Аминокислотная последовательность LCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa r116A3

SEQ ID NO: 6: Аминокислотная последовательность LCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa r116A3

SEQ ID NO: 7: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa r116A3

SEQ ID NO: 8: Аминокислотная последовательность HCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa r116A3

SEQ ID NO: 9: Аминокислотная последовательность HCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa r116A3

SEQ ID NO: 10: Аминокислотная последовательность HCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa r116A3

SEQ ID NO: 11: Аминокислотная последовательность LCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa r70E

SEQ ID NO: 12: Аминокислотная последовательность LCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa r70E

SEQ ID NO: 13: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa r70E

SEQ ID NO: 14: Аминокислотная последовательность HCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa r70E

SEQ ID NO: 15: Аминокислотная последовательность HCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa r70E

SEQ ID NO: 16: Аминокислотная последовательность эпитопа RGMa человека

SEQ ID NO: 17: Аминокислотная последовательность LCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa 5F9

SEQ ID NO: 18: Аминокислотная последовательность LCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa 5F9

SEQ ID NO: 19: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa 5F9

SEQ ID NO: 20: Аминокислотная последовательность HCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa 5F9

SEQ ID NO: 21: Аминокислотная последовательность HCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa 5F9

SEQ ID NO: 22: Аминокислотная последовательность HCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa 5F9

SEQ ID NO: 23: Аминокислотная последовательность LCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa 8D1

SEQ ID NO: 24: Аминокислотная последовательность LCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa 8D1

SEQ ID NO: 25: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa 8D1

SEQ ID NO: 26: Аминокислотная последовательность HCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa 8D1

SEQ ID NO: 27: Аминокислотная последовательность HCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa 8D1

SEQ ID NO: 28: Аминокислотная последовательность HCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa 8D1

SEQ ID NO: 29: Аминокислотная последовательность LCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1

SEQ ID NO: 30: Аминокислотная последовательность LCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1

SEQ ID NO: 31: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1

SEQ ID NO: 32: Аминокислотная последовательность HCDR1 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1

SEQ ID NO: 33: Аминокислотная последовательность HCDR2 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1

SEQ ID NO: 34: Аминокислотная последовательность HCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1

SEQ ID NO: 35: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1Y

SEQ ID NO: 36: Аминокислотная последовательность эпитопа RGMa человека

SEQ ID NO: 37: Аминокислотная последовательность эпитопа RGMa человека

SEQ ID NO: 38: Аминокислотная последовательность эпитопа RGMa человека

SEQ ID NO: 39: Аминокислотная последовательность эпитопа RGMa человека

SEQ ID NO: 40: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1F

SEQ ID NO: 41: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1H

SEQ ID NO: 42: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1L

SEQ ID NO: 43: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1V

SEQ ID NO: 44: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1I

SEQ ID NO: 45: Аминокислотная последовательность LCDR3 нейтрализующего антитела против RGMa AE12-1K

Промышленная применимость

[0103]

Настоящее изобретение применимо в профилактике или лечении периферических нейропатий или болевых симптомов, связанных с заболеваниями, включающими периферические нейропатии или астроцитарные повреждения, и, таким образом, имеет высокое практическое значение в фармацевтической промышленности.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation

<120> СПОСОБ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ

ИЛИ БОЛИ, СОПРОВОЖДАЮЩЕЙ ЗАБОЛЕВАНИЕ, ПРИ КОТОРОМ ВЫЯВЛЕНА

ПЕРИФЕРИЧЕСКАЯ НЕЙРОПАТИЯ ИЛИ НАРУШЕНИЕ АСТРОЦИТОВ

<130> A19007-18289

<150> US 62/696,052

<151> 2018-07-10

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 450

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 1

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Phe Trp Pro

20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Thr Ser Pro Cys

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Gly Ser

50 55 60

His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Thr Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu Arg

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly Asp

85 90 95

Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser Gln

100 105 110

His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Leu Arg Thr

115 120 125

Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu Ile

130 135 140

Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Thr Pro Asn Tyr

145 150 155 160

Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr Asp

165 170 175

Arg Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp Asn

180 185 190

Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly Ser

195 200 205

Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe Gln

210 215 220

Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu Pro

225 230 235 240

Ala Ala Phe Val Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly Ala

245 250 255

Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu Ile

260 265 270

Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly Arg

275 280 285

Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala Val

290 295 300

Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys Pro

305 310 315 320

Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu Gly

325 330 335

Thr Gly Ala Arg Arg Leu Ala Ala Ala Ser Pro Ala Pro Thr Ala Pro

340 345 350

Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu

355 360 365

Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr

370 375 380

Thr Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp

385 390 395 400

Val Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Tyr Glu Arg

405 410 415

Thr Arg Asp Leu Pro Gly Arg Ala Ala Ala Gly Leu Pro Leu Ala Pro

420 425 430

Arg Pro Leu Leu Gly Ala Leu Val Pro Leu Leu Ala Leu Leu Pro Val

435 440 445

Phe Cys

450

<210> 2

<211> 454

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro

20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly

50 55 60

Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu

65 70 75 80

Arg Thr Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly

85 90 95

Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser

100 105 110

Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu

130 135 140

Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn

145 150 155 160

Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr

165 170 175

Asp His Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp

180 185 190

Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly

195 200 205

Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe

210 215 220

Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu

225 230 235 240

Pro Ser Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly

245 250 255

Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu

260 265 270

Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly

275 280 285

Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala

290 295 300

Val Glu Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys

305 310 315 320

Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu

325 330 335

Ser Pro Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu

340 345 350

Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro

355 360 365

Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr

370 375 380

Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly

385 390 395 400

Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr

405 410 415

Arg Glu Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr

420 425 430

Phe Pro Leu Ala Pro Gln Ile Leu Leu Gly Thr Ile Pro Leu Leu Val

435 440 445

Leu Leu Pro Val Leu Trp

450

<210> 3

<211> 449

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 3

Met Gln Pro Pro Arg Glu Arg Leu Val Val Thr Gly Arg Ala Gly Trp

1 5 10 15

Met Gly Met Gly Arg Gly Ala Gly Arg Ser Ala Leu Gly Leu Trp Pro

20 25 30

Thr Leu Ala Phe Leu Leu Cys Ser Phe Pro Ala Ala Ile Ser Pro Cys

35 40 45

Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser Ser Gly

50 55 60

Ser His Ala Pro Ala Ser Asp Asp Val Pro Glu Phe Cys Ala Ala Leu

65 70 75 80

Arg Thr Tyr Ala Leu Cys Thr Arg Arg Thr Ala Arg Thr Cys Arg Gly

85 90 95

Asp Leu Ala Tyr His Ser Ala Val His Gly Ile Glu Asp Leu Met Ser

100 105 110

Gln His Asn Cys Ser Lys Asp Gly Pro Thr Ser Gln Pro Arg Val Arg

115 120 125

Thr Leu Pro Pro Ala Gly Asp Ser Gln Glu Arg Ser Asp Ser Pro Glu

130 135 140

Ile Cys His Tyr Glu Lys Ser Phe His Lys His Ser Ala Ala Pro Asn

145 150 155 160

Tyr Thr His Cys Gly Leu Phe Gly Asp Pro His Leu Arg Thr Phe Thr

165 170 175

Asp His Phe Gln Thr Cys Lys Val Gln Gly Ala Trp Pro Leu Ile Asp

180 185 190

Asn Asn Tyr Leu Asn Val Gln Val Thr Asn Thr Pro Val Leu Pro Gly

195 200 205

Ser Ala Ala Thr Ala Thr Ser Lys Leu Thr Ile Ile Phe Lys Asn Phe

210 215 220

Gln Glu Cys Val Asp Gln Lys Val Tyr Gln Ala Glu Met Asp Glu Leu

225 230 235 240

Pro Ser Ala Phe Ala Asp Gly Ser Lys Asn Gly Gly Asp Lys His Gly

245 250 255

Ala Asn Ser Leu Lys Ile Thr Glu Lys Val Ser Gly Gln His Val Glu

260 265 270

Ile Gln Ala Lys Tyr Ile Gly Thr Thr Ile Val Val Arg Gln Val Gly

275 280 285

Arg Tyr Leu Thr Phe Ala Val Arg Met Pro Glu Glu Val Val Asn Ala

290 295 300

Val Glu Asp Arg Asp Ser Gln Gly Leu Tyr Leu Cys Leu Arg Gly Cys

305 310 315 320

Pro Leu Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe Arg Ala Asn Ala Glu

325 330 335

Ser Pro Arg Arg Pro Ala Ala Ala Ser Pro Ser Pro Val Val Pro Glu

340 345 350

Thr Phe Pro Tyr Glu Thr Ala Val Ala Lys Cys Lys Glu Lys Leu Pro

355 360 365

Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala Cys Val Phe Asp Leu Leu Thr Thr

370 375 380

Gly Asp Val Asn Phe Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Ala Leu Glu Asp Gly

385 390 395 400

Lys Met Leu His Ser Asn Lys Asp Lys Leu His Leu Phe Glu Arg Thr

405 410 415

Arg Glu Leu Pro Gly Ala Val Ala Ala Ala Ala Phe Pro Leu Ala Pro

420 425 430

Glu Met Leu Pro Gly Thr Val Thr Leu Leu Val Leu Leu Pro Leu Phe

435 440 445

Trp

<210> 4

<211> 1353

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

atgcagccgc caagggagag gctagtggta acaggccgag ctggatggat gggtatgggg

60

agaggggcag gacgttcagc cctgggattc tggccgaccc tcgccttcct tctctgcagc

120

ttccccgcag ccacctcccc gtgcaagatc ctcaagtgca actctgagtt ctggagcgcc

180

acgtcgggca gccacgcccc agcctcagac gacacccccg agttctgtgc agccttgcgc

240

agctacgccc tgtgcacgcg gcggacggcc cgcacctgcc ggggtgacct ggcctaccac

300

tcggccgtcc atggcataga ggacctcatg agccagcaca actgctccaa ggatggcccc

360

acctcgcagc cacgcctgcg cacgctccca ccggccggag acagccagga gcgctcggac

420

agccccgaga tctgccatta cgagaagagc tttcacaagc actcggccac ccccaactac

480

acgcactgtg gcctcttcgg ggacccacac ctcaggactt tcaccgaccg cttccagacc

540

tgcaaggtgc agggcgcctg gccgctcatc gacaataatt acctgaacgt gcaggtcacc

600

aacacgcctg tgctgcccgg ctcagcggcc actgccacca gcaagctcac catcatcttc

660

aagaacttcc aggagtgtgt ggaccagaag gtgtaccagg ctgagatgga cgagctcccg

720

gccgccttcg tggatggctc taagaacggt ggggacaagc acggggccaa cagcctgaag

780

atcactgaga aggtgtcagg ccagcacgtg gagatccagg ccaagtacat cggcaccacc

840

atcgtggtgc gccaggtggg ccgctacctg acctttgccg tccgcatgcc agaggaagtg

900

gtcaatgctg tggaggactg ggacagccag ggtctctacc tctgcctgcg gggctgcccc

960

ctcaaccagc agatcgactt ccaggccttc cacaccaatg ctgagggcac cggtgcccgc

1020

aggctggcag ccgccagccc tgcacccaca gcccccgaga ccttcccata cgagacagcc

1080

gtggccaagt gcaaggagaa gctgccggtg gaggacctgt actaccaggc ctgcgtcttc

1140

gacctcctca ccacgggcga cgtgaacttc acactggccg cctactacgc gttggaggat

1200

gtcaagatgc tccactccaa caaagacaaa ctgcacctgt atgagaggac tcgggacctg

1260

ccaggcaggg cggctgcggg gctgcccctg gccccccggc ccctcctggg cgccctcgtc

1320

ccgctcctgg ccctgctccc tgtgttctgc tag

1353

<210> 5

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 5

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 6

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 6

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 7

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 7

Gln Gln Leu Asn Thr Leu Pro

1 5

<210> 8

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 8

Asp Ala Trp Met Asp

1 5

<210> 9

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 9

Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 10

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 10

Arg Asp Gly Ala Tyr

1 5

<210> 11

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 11

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His

1 5 10 15

<210> 12

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 12

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 13

Ser Gln Ser Thr His Val Pro

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 14

Thr Ser Tyr Tyr Trp Asn

1 5

<210> 15

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 15

Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn

1 5 10 15

<210> 16

<211> 23

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Pro Cys Lys Ile Leu Lys Cys Asn Ser Glu Phe Trp Ser Ala Thr Ser

1 5 10 15

Gly Ser His Ala Pro Ala Ser

20

<210> 17

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 17

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Glu Tyr Ser Asp Gly Tyr Thr Phe Leu Glu

1 5 10 15

<210> 18

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 18

Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 19

Phe Gln Ala Thr His Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 20

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 20

Asn Tyr Gly Met Asn

1 5

<210> 21

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 21

Met Ile Tyr Tyr Asp Ser Ser Glu Lys His Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 22

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 22

Gly Thr Thr Pro Asp Tyr

1 5

<210> 23

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 23

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Asp Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 24

Gly Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 25

Leu Gln Gly Tyr Ile Pro Pro Arg Thr

1 5

<210> 26

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 26

Ser Tyr Val Met His

1 5

<210> 27

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 27

Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 28

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 28

Ala Arg Arg Asn Glu Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 29

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 29

Thr Gly Thr Ser Ser Ser Val Gly Asp Ser Ile Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 30

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 30

Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 31

Cys Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 32

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 32

Ser His Gly Ile Ser

1 5

<210> 33

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 33

Trp Ile Ser Pro Tyr Ser Gly Asn Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 34

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 34

Val Gly Ser Gly Pro Tyr Tyr Tyr Met Asp Val

1 5 10

<210> 35

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 35

Tyr Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 36

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 36

Glu Glu Val Val Asn Ala Val Glu Asp Trp Asp Ser Gln Gly

1 5 10

<210> 37

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 37

Asn Gln Gln Ile Asp Phe Gln Ala Phe His Thr Asn Ala Glu

1 5 10

<210> 38

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 38

Pro Thr Ala Pro Glu Thr Phe Pro Tyr Glu Thr

1 5 10

<210> 39

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 39

Lys Leu Pro Val Glu Asp Leu Tyr Tyr Gln Ala

1 5 10

<210> 40

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 40

Phe Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 41

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 41

His Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 42

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 42

Leu Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 43

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 43

Val Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 44

Ile Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<210> 45

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: синтетический

пептид

<400> 45

Lys Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Thr Leu

1 5

<---

Группа изобретений относится к области иммунологии и медицины. Предложены применения нейтрализующего антитела против RGMa для получения средства для предупреждения или лечения периферической нейропатии, а также для получения средства для применения в профилактике или лечении болевых симптомов, связанных с периферической нейропатией или астроцитарным повреждением. Кроме того, предложен способ предупреждения или лечения периферической нейропатии, включающий введение эффективного количества нейтрализующего антитела против RGMa нуждающемуся в этом млекопитающему. Нейтрализующие антитела против RGMa воздействуют на болевые симптомы посредством облегчения не только периферических нейропатий, но также и астроцитарных повреждений или гипофункций. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 пр.

1. Применение нейтрализующего антитела против RGMa для получения средства для предупреждения или лечения периферической нейропатии, где периферическая нейропатия выбрана из группы, состоящей из диабетической нейропатии; туннельной нейропатии, выбранной из синдрома запястного канала, локтевой нейропатии кубитального канала, паралича малоберцового нерва и синдрома предплюсневого канала; семейной амилоидной полинейропатии; канцероматозной нейропатии; хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (ХВДП); нейропатии, ассоциированной с заболеваниями соединительной ткани; синдрома Кроу-Фукасе (POEMS-синдром); постгерпетической невралгии; периферической нейропатии, ассоциированной со СПИДом или болезнью Лайма; уремии; мультифокальной двигательной нейропатии; и васкулитной нейропатии.

2. Применение по п.1, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой гуманизированное антитело.

3. Применение по п.1 или 2, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой антитело, распознающее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 36, 37, 38 и 39.

4. Применение по любому из пп.1-3, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из:

(a1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10;

(b1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, включающую SFG;

(c1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22;

(d1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 26, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 27, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 28;

(e1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(f1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(g1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(h1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 41, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(i1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 42, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(j1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(k1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 44, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34; и

(l1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 45, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34.

5. Применение по любому из пп.1-4, где периферическая нейропатия является диабетической нейропатией.

6. Применение по п.5, где диабетическая нейропатия является болезненной диабетической нейропатией и/или бессимптомной диабетической нейропатией.

7. Применение нейтрализующего антитела против RGMa для получения средства для применения в профилактике или лечении болевых симптомов, связанных с заболеванием, включающим периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, выбрано из группы, состоящей из диабетической нейропатии; туннельной нейропатии, выбранной из синдрома запястного канала, локтевой нейропатии кубитального канала, паралича малоберцового нерва и синдрома предплюсневого канала; семейной амилоидной полинейропатии; канцероматозной нейропатии; хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (ХВДП); нейропатии, ассоциированной с заболеваниями соединительной ткани; синдрома Кроу-Фукасе (POEMS-синдром); постгерпетической невралгии; периферической нейропатии, ассоциированной со СПИДом или болезнью Лайма; уремии; мультифокальной двигательной нейропатии; васкулитной нейропатии; оптиконевромиелита; и болезни Александера.

8. Применение по п.7, где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, является диабетической нейропатией или оптиконевромиелитом.

9. Применение по п.7, где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, является диабетической нейропатией.

10. Применение по п.7, где заболевание, включающее периферическую нейропатию или астроцитарное повреждение, является оптиконевромиелитом.

11. Применение по любому из пп.7-10, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой гуманизированное антитело.

12. Применение по любому из пп. 7-11, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой антитело, распознающее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 36, 37, 38 и 39.

13. Применение по любому из пп.7-12, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из:

(a1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10;

(b1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, включающую SFG;

(c1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22;

(d1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 26, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 27, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 28;

(e1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(f1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(g1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(h1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 41, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(i1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 42, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(j1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(k1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 44, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34; и

(l1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 45, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34.

14. Применение по любому из пп.7-12, где нейтрализующее антитело против RGMa включает

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.

15. Способ предупреждения или лечения периферической нейропатии, включающий введение эффективного количества нейтрализующего антитела против RGMa нуждающемуся в этом млекопитающему, где периферическая нейропатия выбрана из группы, состоящей из диабетической нейропатии; туннельной нейропатии, выбранной из синдрома запястного канала, локтевой нейропатии кубитального канала, паралича малоберцового нерва и синдрома предплюсневого канала; семейной амилоидной полинейропатии; канцероматозной нейропатии; хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (ХВДП); нейропатии, ассоциированной с заболеваниями соединительной ткани; синдрома Кроу-Фукасе (POEMS-синдром); постгерпетической невралгии; периферической нейропатии, ассоциированной со СПИДом или болезнью Лайма; уремии; мультифокальной двигательной нейропатии; и васкулитной нейропатии.

16. Способ по п.15, где периферическая нейропатия является диабетической нейропатией.

17. Способ по п.15 или 16, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой гуманизированное антитело.

18. Способ по любому из пп.15-17, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой антитело, распознающее аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 16, 36, 37, 38 и 39.

19. Способ по любому из пп.15-18, где нейтрализующее антитело против RGMa представляет собой антитело, выбранное из группы, состоящей из:

(a1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10;

(b1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 11, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 12, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 13, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 14, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 15, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, включающую SFG;

(c1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 17, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 18, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 19, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 20, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 21, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 22;

(d1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 23, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 24, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 25, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 26, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 27, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 28;

(e1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 31, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(f1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 35, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(g1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 40, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(h1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 41, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(i1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 42, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(j1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 43, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34;

(k1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 44, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34; и

(l1) нейтрализующего антитела против RGMa, включающего:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 29, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 30, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 45, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 32, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 33, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 34.

20. Способ по любому из пп. 15-18, где нейтрализующее антитело против RGMa включает нейтрализующее антитело против RGMa, включающее:

вариабельную область легкой цепи, включающую LCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 5, LCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 6, и LCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 7, и

вариабельную область тяжелой цепи, включающую HCDR1, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 8, HCDR2, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 9, и HCDR3, включающую аминокислотную последовательность, представленную SEQ ID NO: 10.