СРЕДСТВО РАЗРЕЗАНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ CAS9 БЕЛКА ИЗ БАКТЕРИИ PASTEURELLA PNEUMOTROPICA Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии, а именно, к новым ферментам Cas нуклеазам систем CRISPR-Cas, применяемым для разрезания ДНК и редактирования генома различных организмов. Данная технология может применяться в будущем для генной терапии наследственных заболеваний человека, а также для редактирования генома других организмов.

Уровень техники

Изменение последовательности ДНК – одна из актуальных задач биотехнологии на сегодняшний день. Редактирование и изменение геномов эукариотических и прокариотических организмов, а также манипуляции с ДНК in vitro, требуют направленного внесения двунитевых разрывов в последовательности ДНК.

Для решения этой задачи в настоящее время используют следующие методики: искусственные нуклеазные системы, содержащей домены типа «цинковые пальцы», TALEN-системы и бактериальные CRISPR-Cas системы. Первые два метода требуют трудозатратой оптимизации аминокислотной последовательности нуклеазы для узнавания конкретной последовательности ДНК. В отличие от них в случае CRISPR-Cas систем структурами, узнающими ДНК мишень, являются не белки, а короткие направляющие РНК. Разрезание конкретной ДНК мишени не требует синтеза нуклеазы или ее гена de novo, а обеспечивается за счет использования направляющих РНК, комплементарных целевой последовательности. Это делает CRISPR Cas системы удобными и эффективными инструментами разрезания различных ДНК-последовательностей. Методика позволяет осуществлять единовременное разрезание ДНК в нескольких участках при использовании направляющих РНК разной последовательностей. Такой подход используется в том числе для одновременного изменения нескольких генов в эукариотических организмах.

По своей природе CRISPR-Cas системы являются иммунными системами прокариот, способными высоко специфично вносить разрывы в генетический материал вирусов (Mojica F. J. M. et al. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements //Journal of molecular evolution. – 2005. – Т. 60. – №. 2. – С. 174-182). Аббревиатура CRISPR-Cas расшифровывается как “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats and CRISPR associated genes” (Jansen R. et al. Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes //Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575), что переводе с английского обозначает “короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами, и aссоциированные с ними гены”. Все CRISPR-Cas системы состоят из CRISPR кассет и генов, кодирующих различные Cas белки (Jansen R. et al. , Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575). CRISPR кассеты состоят из последовательностей-спейсеров, каждый из которых имеет уникальную нуклеотидную последовательность, и повторяющихся палиндромных повторов (Jansen R. et al. , Molecular microbiology. – 2002. – Т. 43. – №. 6. – С. 1565-1575). В результате транскрипции CRISPR кассет и их последующего процессинга образуются направляющие крРНК, которые вместе с Cas белками формируют эффекторный комплекс (Brouns S. J. J. et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes //Science. – 2008. – Т. 321. – №. 5891. – С. 960-964). За счет комплементарного спаривания крРНК с целевым участком ДНК, именуемым протоспейсером, Cas-нуклеаза узнает ДНК-мишень и высоко специфично вносит в нее разрыв.

CRISPR-Cas системы, представленными одиночным белком-эффектором, разделяют на шесть различных типов (от I до VI) в зависимости от Cas белков, входящих в состав систем. В 2013 году впервые было предложено использовать систему CRISPR-Cas9, относящуюся к типу II, для редактирования геномной ДНК клеток человека (Cong L, et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 2013 Feb 15;339(6121):819-23). Система CRISPR-Cas9 II типа отличается простотой состава и механизма работы: для ее функционирования необходимо формирование эффекторного комплекса, состоящего лишь из одного белка Cas9 и двух коротких РНК: крРНК (crRNA) и трейсерной РНК (tracrRNA). Трейсерная РНК комплементарно спаривается с участком крРНК, проиcходящим из CRISPR повтора, образуя вторичную структуру, необходимую для связывания направляющих РНК с Cas эффектором. Определение последовательности направляющих РНК является важным шагом в характеризации неизученных ранее Cas-ортологов. Эффекторный белок Cas9 является РНК-зависимой ДНК эндонуклеазой с двумя нуклеазными доменами (HNH и RuvC), вносящими разрывы в комплементарные нити целевой ДНК, таким образом образуя двунитевой разрыв ДНК (Deltcheva E. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III //Nature. – 2011. – Т. 471. – №. 7340. – С. 602).

На сегодняшний день известно несколько CRISPR-Cas нуклеаз, способных направлено и специфично вносить двунитевые разрывы в ДНК. Технология CRISPR-Cas9 является одной из самых современных и быстроразвивающихся методик внесения разрывов в ДНК различных организмов, начиная от бактериальных штаммов и заканчивая клетками человека, а также in vitro (Song M. The CRISPR/Cas9 system: Their delivery, in vivo and ex vivo applications and clinical development by startups. Biotechnol Prog. 2017 Jul;33(4):1035-1045).

Эффекторному рибонуклеиновому комплексу, состоящему из Cas9 и дуплекса крРНК и тракрРНК, для распознавания и последующего гидролиза ДНК помимо комплементарного соответствия спейсера крРНК и протоспейсера необходимо присутствие PAM (от англ. “PAM” - protospacer adjusted motif) на ДНК мишени (Mojica F. J. M. et al. 2009). PAM представляет собой строго определенную последовательность из нескольких нуклеотидов, расположенных в системах типа II вплотную либо в нескольких нуклеотидах от 3’-конца протоспейсера на нетаргетной цепи. При отсутствии PAM гидролиза связей в ДНК с образованием двунитевого разрыва не происходит. Необходимость присутствия PAM последовательности на мишени повышает специфичность узнавания, но в то же время накладывает ограничение в выборе целевых участков ДНК, в которые необходимо внести разрыв. Таким образом, наличие нужной PAM последовательности, фланирующей ДНК-мишень с 3'-конца, является характеристикой, ограничивающей применение CRISPR-Cas систем на любых участках ДНК.

Различные CRISPR-Cas белки используют для своей работы разные, оригинальные PAM последовательности. Использование CRISPR-Cas белков с новыми разнообразными PAM последовательностями необходимо для обеспечения возможности изменения любого участка ДНК, как in vitro, так и в геноме живых организмов. Изменение эукариотических геномов также требует использования нуклеаз малого размера для обеспечения доставки CRISPR-Cas систем в клетки посредством AAV вирусов.

Несмотря на известность ряда способов разрезания ДНК и изменения последовательности геномной ДНК, на сегодняшний день сохраняется потребность в новых эффективных инструментах для модификации ДНК в различных организмах и в строго определенных местах последовательности ДНК.

Сущность изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание новых инструментов для изменения последовательности геномной ДНК одноклеточных или многоклеточных организмов на основе систем CRISPR-Cas9. Существующие в настоящее время системы имеют ограниченное применение из-за специфичной последовательности РАМ, которая должна присутствовать на 3'-конце участка ДНК, подвергающегося модификации. Поиск новых ферментов Cas9 с другими РАМ последовательностями позволит расширить арсенал имеющихся средств для образования двунитевого разрыва в необходимых, строго определенных местах в молекулах ДНК разных организмов. Для решения этой задачи авторами была охарактеризована ранее предсказанная для бактерии Pasteurella pneumotropica (P. pneumotropica)

CRISPR нуклеаза II типа PpCas9, которая может быть применена для внесения направленных изменений в геном как этого, так и других организмов. Существенными признаками, отличающими настоящее изобретение, являются: (а) короткая, отличающаяся от других известных последовательность PAM; (б) относительно малый размер охарактеризованного белка PpCas9 – 1055 аминокислотных остатков (а.о.).

Указанная задача решается путем применения белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, или содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5’-NNNN(A/G)T-3’ в указанной молекуле ДНК. В некоторых вариантах изобретения данное применение характеризуется тем, что образование двунитевого разрыва в молекуле ДНК происходит при температуре от 35 ^оС до 45 ^оС.

Указанная задача также решается путем создания способа изменения последовательности геномной ДНК одноклеточного или многоклеточного организма, включающего введение в по меньшей мере одну клетку этого организма эффективного количества: а) либо белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, либо нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, и б) либо направляющей РНК, содержащей последовательность, образующую дуплекс с нуклеотидной последовательностью участка геномной ДНК организма, непосредственно примыкающей к нуклеотидной последовательности 5’-NNNN(A/G)T-3’, и взаимодействующей с указанным белком после образования дуплекса, либо последовательности ДНК, кодирующей указанную направляющую РНК; при этом взаимодействие указанного белка с направляющей РНК и нуклеотидной последовательностью 5’-NNNN(A/G)T-3’ приводит к образованию двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5’-NNNN(A/G)T-3’. В некоторых вариантах изобретения данный способ характеризуется тем, что дополнительно включающий введение экзогенной последовательности ДНК одновременно с направляющей РНК.

В качестве направляющей РНК может быть использована смесь из крРНК (crRNA) и трейсерной РНК (tracrRNA), способных образовать комплекс с участком целевой ДНК и белком PpCas9. В предпочтительных вариантах изобретения в качестве направляющей РНК может быть использована гибридная РНК, сконструированная на основе крРНК и трейсерной РНК. Методы конструирования гибридной направляющей РНК известны специалистам (Hsu PD, et al., DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 2013 Sep;31(9):827-32). Один из вариантов конструирования гибридной РНК раскрыт в Примерах ниже.

Изобретение может быть использовано как для разрезания целевой ДНК in vitro, так и для модификации генома какого-либо живого организма. Модификация генома может проводиться прямым способом – разрезанием генома в соответствующем сайте, а также вставкой экзогенной последовательности ДНК за счет гомологичной репарации.

В качестве экзогенной последовательности ДНК может быть использован любой участок двунитевой или однонитевой ДНК из генома организма, отличного от организма, используемого при введении (или смесь таких участков между собой и с другими фрагментами ДНК), при этом этот участок (или смесь участков) предназначен для интеграции в место двуцепочечного разрыва в целевой ДНК, образованного под действием нуклеазы PpCas9. В некоторых вариантах изобретения в качестве экзогенной последовательности ДНК может быть использован участок двуцепочечной ДНК из генома организма, используемого при введении белка PpCas9, но при этом измененный мутациями (заменой нуклеотидов), а также вставками или делециями одного или нескольких нуклеотидов.

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение универсальности доступных систем CRISPR-Cas9, позволяющее использовать нуклеазу Cas9 для разрезания геномной или плазмидной ДНК в большем количестве специфических сайтов и специфических условий.

Краткое описание рисунков

Фиг. 1. Схема устройства локуса CRISPR PpCas9 системы. DR - direct repeat, или прямой повтор - регулярно повторяющийся участок, входящий в состав CRISPR кассеты.

Фиг. 2. PAM скрининг in vitro. Схема эксперимента.

Фиг. 3. Разрезание нуклеазой PpCas9 фрагментов 7N библиотеки при разных температурах проведения реакции.

Фиг. 4. (А) Анализ результатов in vitro скрининга нуклеазы PpCas9 с использованием расчета логарифма изменения доли каждого конкретного нуклеотида в каждой позиции PAM (FC). (Б) PAM Logo нуклеазы PpCas9. Для каждой позиции обозначены частоты представленности аденина, цитозина, тимина и гуанина. Высота букв соответствует частоте представленности нуклеотида в данной позиции PAM последовательности.

Фиг. 5. Проверка влияния однонуклеотидных замен в первой позиции PAM на эффективность разрезания нуклеазой PpCas9 ДНК-мишени.

Фиг. 6. Проверка значимости нуклеотидных позиций в PAM последовательности PpCas9.

Фиг. 7. Проверка влияния замены A на G в 5ой позиции PAM на эффективность разрезания нуклеазой PpCas9 ДНК-мишени.

Фиг. 8. Проверка влияния однонуклеотидных замен в 7ой позиции PAM на эффективность разрезания нуклеазой PpCas9 ДНК-мишени.

Фиг. 9. Разрезание различных сайтов ДНК с помощью белка PpCas9. Дорожки 1 и 2 – положительный контроль.

Фиг. 10. Проверка распознавания нуклеазой PpCas9 PAM последовательности CAGCATT. Дорожки 1 и 2 – положительный контроль.

Фиг. 11. Схема инструмента разрезания ДНК PpCas9.

Фиг. 12. Эксперимент по разрезанию ДНК -мишени. Использованы гибридные направляющие РНК разной длины.

Фиг. 13. Выравнивание аминокислотных последовательностей белков PpCas9 и Cas9 из Staphylococcus aureus при помощи программы NCBI BLASTp (default parameters).

Подробное раскрытие изобретения

В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из». Если не определено отдельно, технические и научные термины в данной заявке имеют стандартные значения, общепринятые в научной и технической литературе.

Используемый здесь термин «процент гомологии двух последовательностей» эквивалентен термину «процент идентичности двух последовательностей». Идентичность последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol., 215, pp. 403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями может быть использовано сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами. Процент идентичности двух последовательностей определяется числом положений идентичных аминокислот в этих двух последовательностях с учетом числа пробелов и длины каждого пробела, которые необходимо ввести для оптимального сопоставления двух последовательностей путем выравнивания. Процент идентичности равен числу идентичных аминокислот в данных положениях с учетом выравнивания последовательностей, разделенному на общее число положений и умноженному на 100.

Термин "специфически гибридизуется" относится к ассоциации между двумя одноцепочечными молекулами нуклеиновых кислот или в достаточной степени комплементарными последовательностями, что разрешает такую гибридизацию в предопределенных условиях, обычно использующихся в данной области.

Фраза "двунитевой разрыв, расположенный непосредственно перед нуклеотидной последовательностью РАМ" означает, что двунитевой разрыв в целевой последовательности ДНК будет произведен на расстоянии от 0 до 25 нуклеотидов перед нуклеотидной последовательностью РАМ.

Под экзогенной последовательностью ДНК, вводимой одновременно с направляющей РНК, следует понимать последовательность ДНК, подготовленную специально для специфической модификации двуцепочечной целевой ДНК в месте разрыва, определяемого специфичностью направляющей РНК. Подобной модификацией может быть, например, вставка или делеция определенных нуклеотидов в месте разрыва целевой ДНК. Экзогенной ДНК может служить как участок ДНК из другого организма, так и участок ДНК из того же организма, что и целевая ДНК.

Под белком, содержащим определенную аминокислотную последовательность следует понимать белок, имеющий аминокислотную последовательность, составленную из указанной аминокислотной последовательности и, возможно, других последовательностей, соединённых пептидными связями с указанной аминокислотной последовательностью. Примером других последовательностей может служить последовательность сигнала ядерной локализации (NLS), или другие последовательности, обеспечивающие повышенную функциональность для указанной аминокислотной последовательности.

Под экзогенной последовательностью ДНК, вводимой одновременно с направляющей РНК, следует понимать последовательность ДНК, подготовленную специально для специфической модификации двуцепочечной целевой ДНК в месте разрыва, определяемого специфичностью направляющей РНК. Подобной модификацией может быть, например, вставка или делеция определенных нуклеотидов в месте разрыва целевой ДНК. Экзогенной ДНК может служить как участок ДНК из другого организма, так и участок ДНК из того же организма, что и целевая ДНК.

Под эффективным количеством вводимых в клетку белка и РНК следует понимать такое количество белка и РНК, которое при попадании в указанную клетку будет способно образовать функциональный комплекс, то есть комплекс, который будет специфически связываться с целевой ДНК и производить в ней двунитевой разрыв в месте, определяемом направляющей РНК и РАМ последовательностью на ДНК. Эффективность этого процесса может быть оценена при помощи анализа целевой ДНК, выделенной из указанной клетки с помощью стандартных методов, известных специалистам.

Доставка белка и РНК в клетку может быть осуществлена различными способами. Например, белок может быть доставлен в виде ДНК-плазмиды, которая кодирует ген этого белка, как мРНК для трансляции этого белка в цитоплазме клетки, или как рибонуклеопротеидный комплекс, включающий этот белок и направляющую РНК. Доставка может быть осуществлена различными методами, известными специалистам.

Нуклеиновая кислота, кодирующая компоненты системы, может быть введена в клетку, непосредственно или опосредованно: за счет трансфекции или трансформации клеток известными специалистам способами, за счет использования рекомбинатного вируса, за счет манипуляций с клеткой, таких как микроинъекция ДНК и т.п.

Доставка рибонуклеинового комплекса, состоящего из нуклеазы и направляющих РНК и экзогенной ДНК (при необходимости) может осуществляться путем трансфекции комплексов в клетку или за счет механического введения комплекса внутрь клетки, например, микроинъекции.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок, который необходимо ввести в клетку, может быть интегрирована в хромосому или может представлять собой внехромосомно реплицирующуюся ДНК. В некоторых вариантах для обеспечения эффективной экспрессии гена белка с вводимой в клетку ДНК необходимо изменить последовательность этой ДНК в соответствии с типом клетки в целях оптимизации кодонов при экспрессии, обусловленное неравномерностью частот встречаемости синонимичных кодонов в кодирующих областях генома различных организмов. Оптимизация кодонов необходима для увеличения экспрессии в клетках животных, растений, грибов или микроорганизмов.

Для функционирования белка, имеющего последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, в эукариотической клетке необходимо, чтобы этот белок оказался в ядре этой клетки. Поэтому, в некоторых вариантах изобретения, для образования двунитевых разрывов в целевой ДНК используют белок, имеющий последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и который дополнительно модифицирован с одного или с обоих концов добавлением одного или нескольких сигналов ядерной локализации. Например, может быть использован сигнал ядерной локализации из вируса SV40. Для эффективной доставки в ядро сигнал ядерной локализации может быть отделен от основной последовательности белка спейсерной последовательностью, например, описанной в Shen B, et al. "Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting", Cell Res. 2013 May;23(5):720-3. Также, в других вариантах осуществления, может быть использован другой сигнал ядерной локализации, или альтернативный метод доставки указанного белка в ядро клетки.

Настоящее изобретение охватывает применение белка из организма P. pneumotropica, гомологичного ранее охарактеризованным белкам Cas9, для внесения двуцепочечных разрывов в молекулы ДНК в строго определенных положениях. Использование CRISPR нуклеаз для внесения направленных изменений в геном имеет ряд преимуществ. Во-первых, специфичность действия системы определяется последовательностью крРНК, что позволяет использовать один тип нуклеазы для всех локусов-мишеней. Во-вторых, методика позволяет доставить в клетку сразу несколько направляющих РНК, комплементарных разным генам-мишеням, что позволяет осуществлять единовременное изменение сразу нескольких генов.

PpCas9 – Cas нуклеаза, найденная в бактериях Pasteurella pneumotropica ATCC 35149, являющихся патогенами грызунов, обитающих в легких животных. Pasteurella pneumotropica (P. pneumotropica) CRISPR Cas9 система (далее CRISPR PpCas9) относится к IIC типу CRISPR Cas систем и состоит из CRISPR кассеты, несущей четыре прямых повтора (direct repeats, DR) последовательностью 5’ATTATAGCACTGCGAAATGAAAAAGGGAGCTACAAC3’ разделенных последовательностями уникальных спейсеров. Ни один из спейсеров системы не совпадает по последовательности с известными на сегодня бактериофагами или плазмидами, что не позволяет определить требуемый PpCas9 PAM биоинформатическим анализом. К CRISPR кассете прилегает ген эффекторного Cas9 белка PpCas9, а также гены белков Cas1 и Cas2, участвующих в адаптации, встраивании новых спейсеров. Рядом с Cas генами была обнаружена последовательность, частично комплементарная прямым повторам, складывающаяся в характерную вторичную структуру, - предполагаемая трейсерная РНК (tracrRNA) (Фиг. 1)

Знание характерной архитектуры РНК-Cas белкового комплекса систем IIC типа позволила предсказать направление транскрипции CRISPR кассеты: пре-крРНК транскрибируется в противоположном от Cas генов направлении (Фиг.1)

Таким образом, анализ последовательности локуса PpCas9 позволил предсказать последовательности трейсерной и направляющих РНК (Таблица 1).

Для проверки активности PpCas9 нуклеазы и определения требуемого PpCas9 PAM мотива, были проведены эксперименты по воссозданию реакции разрезания ДНК in vitro. Для определения PAM последовательности белка PpCas9 использовали in vitro разрезание двунитевых PAM библиотек. Для этого необходимо было получить все компоненты эффекторного комплекса PpCas9: направляющие РНК и нуклеазу в рекомбинантной форме. Определение последовательности направляющих РНК позволило синтезировать in vitro молекулы crRNA и tracrRNA. Синтез осуществляли с помощью набора NEB HiScribe T7 RNA synthesis. Двунитевые ДНК библиотеки представляли собой фрагменты размером 374 пар нуклеотидов (п.н.), содержащие последовательность протоспейсера, фланкированную рандомизированными семью нуклеотидами (5’-NNNNNNN-3’) c 3’ конца: 5’- Для разрезания этой мишени использовали направляющие РНК следующей последовательности:

tracrRNA:

5’GCGAAATGAAAAACGUUGUUACAAUAAGAGAUGAAUUUCUCGCAAAGCTCUGCCUCUUGAAAUUUCGGUUUCAAGAGGCAUCUUUUU

и crRNA:

5’ uaucuccuuucauugagcacGUUGUAGCUCCCUUUUUCAUUUCGC.

Жирным шрифтом выделена последовательность crRNA, комплементарная протоспейсеру (целевой ДНК последовательности).

Для получения рекомбинантного белка PpCas9 его ген был клонирован в плазмиду pET21a. В качестве кодирующей ген ДНК, использовалась ДНК, синтезированная в компании Integrated DNA Technologies (IDT). Последовательность была кодон-оптимизирована для исключения редких кодонов, встречающихся в геноме P. pneumotropica. Клетки E.coli Rosetta были трансформированы полученной плазмидой pET21a-6xHis-PpCas9.

500 мкл ночной культуры разводили в 500 мл среды LB, и растили клетки при температуре 37 ^оС до достижения оптической плотности 0.6 отн.ед. Синтез целевого белка индуцировали добавлением ИПТГ до концентрации 1 мМ, после чего клетки инкубировали при температуре 20 ^оC в течение 6 часов. Затем проводили центрифугирование клеток на скорости 5000 g в течение 30 минут, полученные осадки клеток замораживали при температуре -20 ^оС.

Осадки размораживали на льду в течение 30 минут, ресуспензировали в 15 мл лизисного буфера (Tris-HCl 50мМ pH 8, 500 мМ NaCl, β-меркаптоэтанол 1мМ, имидазол 10 мМ) с добавлением 15 мг лизоцима и снова инкубировали на льду в течение 30 минут. Затем клетки разрушали воздействием ультразвука в течение 30 минут и центрифугировали в течение 40 минут на скорости 16000 g. Полученный супернатант пропускали через фильтр 0,2 мкм и наносили на колонку HisTrap HP 1 mL (GE Healthcare) на скорости 1 мл/мин.

Хроматографию проводили при помощи FPLC хроматографа AKTA (GE Healthcare) на скорости 1 мл/мин. Колонку с нанесенным белком промывали 20 мл лизисного буфера с добавлением 30 мМ имидазола, после чего белок смывали лизисным буфером с добавлением 300 мМ имидазола.

Затем, фракцию белка, полученную в ходе афинной хроматографии, пропускали через гель-фильтрационную колонку Superdex 200 10/300 GL (24 мл), уравновешенную следующим буфером: Tris-HCl 50 мМ pH 8, 500 мМ NaCl, 1 мМ DTT. При помощи концентратора Аmicon (с фильтром на 30 кДа) фракции, соответствующие мономерной форме белка PpCas9, сконцентрировали до 3 мг/мл, после чего очищенный белок хранили при температуре -80 ^оС в буфере, содержащем 10% глицерин.

In vitro реакцию порезки линейных PAM библиотек проводили в объёме 20 мкл в следующих условиях. Реакционная смесь состояла из: 1X CutSmart буфера (NEB), 5 мМ DTT, 100 нМ PAM-библиотеки, 2 мкМ трРНК/крРНК, 400 нМ белка PpCas9. В качестве контроля аналогичным образом были приготовлены пробы, не содержащие РНК. Пробы инкубировали при различных температурах и анализировали методом гель-электрофореза в 2% агарозном геле. В случае правильного узнавания и специфического разрезания ДНК белком PpCas9 должны формироваться два фрагмента ДНК длиной порядка 326 и 48 пар оснований (см. Фиг. 2).

Результаты опыта показали, что PpCas9 обладает нуклеазной активностью и разрезает часть фрагментов PAM библиотеки. Градиент температур (Фиг. 3) показал, что белок активен в диапазоне температур 35 – 45 °С. В дальнейшем в работе в качестве рабочей использовалась температура 42 °С.

Реакцию разрезания библиотеки повторяли в подобранных условиях. Продукты реакции наносили на 1.5% агарозный гель и подвергали электрофорезу. Непорезанные фрагменты ДНК длиной 374 п.н. экстрагировали из геля и подготавливали для высокоэффективного секвенирования с помощью набора NEB NextUltra II. Образцы секвенировали на платформе Illumina и далее проводили анализ последовательностей биоформатическими методами: определяли разницу в представленности нуклеотидов в отдельных позициях PAM (NNNNNNN) в сравнении с контрольным образцом с использованием подхода, описанного в (Maxwell CS, et al., A detailed cell-free transcription-translation-based assay to decipher CRISPR protospacer-adjacent motifs. Methods. 2018 Jul 1;143:48-57). Кроме того, для анализа результатов построили PAM лого (Фиг. 4).

Оба подхода к анализу данных (Фиг. 4) указывают на значимость 5, 6 и 7 позиций PAM. Таким образом, в результате in vitro анализа удалось установить предположительную PAM последовательность для PpCas9: NNNNATT. Однако эта последовательность является лишь предположительной в силу неточности результатов, получаемых скрининговыми подходами к определению PAM.

В связи с этим для уточнения последовательности была произведена проверка значимости отдельных позиций последовательности PAM. Для этого проводили реакции in vitro разрезания ДНК фрагментов, содержащих ДНК-мишень 5’- atctcctttcattgagcac-3’, фланкированную PAM последовательностью CAACATT (или ее производных): 5’-

Все реакции разрезания ДНК проводили в следующих условиях:

1xCutSmart буфер

400 нM PpCas9

20 нM ДНК

2 мкM crRNA

2 мкM tracrRNA

Время инкубации - 30 минут, температура проведения реакции - 42 °С.

Замена первой позиции PAM на все четыре возможные варианта нуклеотидов не повлияла на эффективность работы белка (Фиг. 5).

Предсказанная значимость пятой и шестой была подтверждена экспериментально путем однонуклеотидных замен (пурин на пиримидин и наоборот) в каждой из позиций PAM. При заменах в пятой и шестой позициях белок практически переставал работать. При замене в седьмой позиции эффективность работы PpCas9 снижалась в два раза, что отражает сниженные требования к нуклеотиду в этой позиции (Фиг. 6). Таким образом, согласно полученным результатам in vitro PAM скрининга нуклеазы PpCas9, в пятой позиции РАМ наиболее вероятными нуклеотидами являются аденин или гуанин, что удалось подтвердить экспериментально (Фиг. 7). Замена А на G никак не снижала эффективность разрезания фрагмента.

Согласно результатам in vitro скрининга фрагменты с “T” либо с “C” в седьмой позиции должны распознаваться более эффективно. Для окончательной проверки значимости нуклеотидов в этой позиции были проведены дополнительные эксперименты. Результаты проведенных in vitro тестов показали, что при замене нуклеотида “Т” в седьмой позиции на A или G эффективность разрезания снижается на 40-50% (Фиг. 8). Таким образом, седьмая позиция PAM является менее консервативной в сравнении с пятой и шестой: пурины в седьмом положении лишь снижают эффективность узнавания, но не препятствуют белку PpCas9 вносить двунитевые разрывы в ДНК.

В результате проведенных исследований удалось сделать следующий вывод: PAM, распознаваемый нуклеазой PpCas9, соответствует следующей формуле 5’- NNNN(A/G)T-3’. Последовательности NNNNRTY (NNNN(A/G)-T-(T/C)) распознаются более эффективно чем NNNNRTR (NNNN-(A/G)-T-(A/G)).

Нижеследующие примеры осуществления способа приведены в целях раскрытия характеристик настоящего изобретения и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения.

Пример 1. Тестирование активности белка PpCas9 в разрезании различных ДНК мишеней.

Для того, чтобы проверить способность PpCas9 узнавать различные последовательности ДНК, фланкированные 5’-NNNN(A/G)T-3’ последовательностью, были проведены эксперименты по in vitro разрезанию ДНК-мишеней из последовательности гена grin2b человека (см. Таблицу 2).

Таблица 2. ДНК-мишени гена grin2b человека.

последовательность PAM           TATCTCCTTTCATTGAGCAC C A A A C C C CAGCTGAAGTAATGTTAGAG C C A C A T T AATAAGAAAAACATTATTAT C A C C A T T GGGGCTATAAGTACACAAGC C C T G C A T CGTTCTCAGAAGAGCCCCCC C A G C A T T CCCACGAGAAAGATGATTTC C A C C A T C

В реакции разрезания в качестве мишени использовался ПЦР фрагмент гена grin2b, несущий сайты узнавания (Таблица 2), предположительно распознаваемыми PpCas9 в соответствии с PAM консенсусом 5’-NNNN(A/G)T-3’. Для узнавания этих последовательностей были синтезированы крРНК, направляющие PpCas9 на данные сайты.

Реакции разрезания проводились в подобранных для PpCas9 условиях, результат представлен на Фиг. 9. Из Фиг. 9 видно, что фермент PpCas9 успешно порезал три из четырех мишеней с подходящим PAM.

Мишень на шестой дорожке имела PAM последовательность CAGCATT, которая согласно предсказаниям на основании результатов «depletion analysis» должна эффективно распознаваться белком. Однако в данном эксперименте узнавание данного фрагмента не произошло.

Поэтому была произведена дополнительная проверка PAM CAGCATT на другой мишени-протоспейсере, ограниченной таким же PAM (Фиг. 10). В этом случае PAM эффективно распознавался, что приводило к порезке ДНК. Таким образом, белок имеет некие дополнительные предпочтения к последовательности ДНК мишени, возможно связанные со вторичной структурой ДНК.

Таким образом, проведенные исследовательские испытания показали наличие нуклеазной активности у PpCas9, а также позволили определить его PAM последовательность и верифицировать последовательности направляющих РНК.

PpCas9 рибонуклеопротеиновый комплекс специфически вносит разрывы в мишени, ограниченные PAM 5’ NNNN(A/G)T 3’ c 5’ конца протоспейсера. Схема PpCas9-РНК комплекса представлена на Фиг. 11.

Пример 2. Использование гибридной направляющей РНК для разрезания ДНК мишени.

sgRNA - форма направляющих РНК, которая представляет собой слитые воедино tracrRNA (трейсерная РНК) и crRNA. Для подбора отимальной sgRNA были сконструированы три варианта этой последовательности, отличающиеся длиной tracrRNA – crRNA дуплекса. РНК синтезировали in vitro и проводили с ними эксперименты по разрезанию ДНК -мишени (Фиг. 12)

В качестве гибридных РНК были использованы следующие РНК последовательности:

1 - sgRNA1 25DR: UAUCUCCUUUCAUUGAGCACGUUGUAGCUCCCUUUUUCAUUUCGCGAAAGCGAAAUGAAAAACGUUGUUACAAUAAGAGAUGAAUUUCUCGCAAAGCTCTGCCUCUUGAAAUUUCGGUUUCAAGAGGCAUCUUUUU

2 - sgRNA2 36DR

UAUCUCCUUUCAUUGAGCACGUUGUAGCUCCCUUUUUUCAUUUCGCAGUGCUAUAAUGAAAAUUAUAGCACUGCGAAAUGAAAAACGUUGUUACAAUAAGAGAUGAAUUUCUCGCAAAGCUCUGCCUCUUGAAAUUUCGGUUUCAAGAGGCAUCUUUUU

Жирным шрифтом обозначена 20-нуклеотидная последовательность, обеспечивающая спаривание с ДНК -мишенью (вариабельная часть sgRNA). Кроме того, в эксперименте делали контрольную пробу без  РНК, а также положительный контроль - порезка мишени с помощью crRNA+trRNA.

В качестве ДНК мишени использовалась последовательность, содержащая сайт узнавания 5’ tatctcctttcattgagcac 3’ с соответсвующим консенсусу PAMCAACATT:  5’-

Жирным шрифтом обозначен сайт узнавания, заглавными буквами PAM.

Реакцию проводили в следующих условиях: концентрация ДНК последовательности, содержащей PAM (CAACATT) – 20 нM, концентрация белка – 400 нM, концентрация РНК - 2 мкM; время инкубирования - 30 минут, температура инкубирования - 37 °С.

Подобранные sgRNA1 и sgRNA2 оказались так же эффективны, как и нативные последовательности tracrRNA и crRNA: разрезание произошло в более 80% ДНК-мишенях (Фиг. 12).

Эти варианты гибридной РНК могут быть использованы для разрезания любой другой целевой ДНК при изменении последовательности, непосредственно спаривающейся с ДНК -мишенью.

Пример 3. Белки Cas9 из близкородственных организмов, относящихся к P. pneumotropica.

На сегодняшний день в P. pneumotropica не охарактеризовано ни одного фермента системы CRISPR-Cas9. Сравнимый по размерам белок Cas9 из Staphylococcus aureus идентичен PpCas9 на 28 % (Фиг. 13, степень идентичности была рассчитана по программе BLASTp, default parameters). Похожая степень идентичности существует и для других известных белков Cas9 (не показано).

Таким образом, белок PpCas9 существенно отличается по аминокислотной последовательности от других Cas9 белков, изученных на сегодняшний день.

Специалисту в области генетической инженерии очевидно, что полученный и охарактеризованный в данном Описании вариант последовательности белка PpCas9 может быть изменен без изменения функции самого белка (например, направленным мутагенезом аминокислотных остатков, напрямую не влияющих на функциональную активность (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989), CSH Press, pp. 15.3-15.108)). В частности, специалисту известно, что могут быть изменены неконсервативные аминокислотные остатки, не затрагивающие остатки, определяющие функциональность белка (определяющие его функцию или структуру). Примерами таких изменений могут служить замены неконсервативных аминокислотных остатков на гомологичные. Некоторые из участков, содержащих неконсервативные аминокислотные остатки, приведены на Фиг. 12. В некоторых вариантах осуществления изобретения возможно использование белка, содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5’-NNNN(A/G)T-3’ в указанной молекуле ДНК. Гомологичные белки могут быть получены путем мутагенеза (например, сайт-направленного или ПЦР-опосредуемого мутагенеза) соответствующих молекул нуклеиновых кислот с последующим тестированием кодируемого модифицированного белка Cas9 на сохранение его функций в соответствии с описанными здесь функциональными анализами.

Пример 4. Описанная в настоящем изобретении система PpCas9 в комплексе с направляющими РНК может быть использована для изменения последовательности геномной ДНК многоклеточного организма, в том числе эукариотического. Для введения система PpCas9 в комплексе с направляющими РНК в клетки этого организма (во все клетки или в часть клеток) могут быть применены различные подходы, известные специалистам. Например, методы доставки CRISPR-Cas9 систем в клетки организмов раскрыты в источниках (Liu C et al., Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications. J Control Release. 2017 Nov 28;266:17-26; Lino CA et al., Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches. Drug Deliv. 2018 Nov;25(1):1234-1257), и в источниках, раскрытых внутри этих источников.

Для эффективной экспрессии нуклеазы PpCas9 в эукариотических клетках будет желательно провести оптимизацию кодонов для аминокислотной последовательности белка PpCas9 методами, известными специалистам (например, IDT codon optimization tool).

Для эффективной работы нуклеазы PpCas9 в эукариотических клетках необходимо обеспечить импорт этого белка внутрь ядра эукариотической клетки. Для этого можно использовать сигнал ядерной локализации из Т-антигена вируса SV40 (Lanford et al., Cell, 1986, 46: 575–582), соединённый с последовательностью PpCas9 с помощью спейсерной последовательности, описанной в Shen B, et al. "Generation of gene-modified mice via Cas9/RNA-mediated gene targeting", Cell Res. 2013 May;23(5):720-3 или без нее. Таким образом, полная аминокислотная последовательность нуклеазы, транспортируемой внутрь ядра эукариотической клетки, будет представлять собой следующую последовательность: MAPKKKRKVGIHGVPAA-PpCas9-KRPAATKKAGQAKKKK (далее PpCas9 NLS). Для доставки белка с приведенной выше аминокислотной последовательностью, могут быть использованы по меньшей мере два подхода.

Доставка в виде гена осуществляется путем создания плазмиды, несущей ген PpCas9 NLS под регуляцией промотора (например, CMV промотора) и последовательности, кодирующей направляющие РНК под регуляцией U6 промотора. В качестве ДНК- мишеней используются ДНК последовательности фланкированные 5’- NNNN(G/A)T -3’, например, последовательности гена grin2b человека:

5’-CAGCTGAAGTAATGTTAGAG-3’

Таким образом, кассета для экспрессии sgРНК выглядит следующим образом:

Жирным шрифтом выделена последовательность U6 промотора, далее идет последовательность, необходимая для узнавания целевой ДНК, а далее идет последовательность, образующая структуру sgRNA, которая выделена красным.

Плазмидную ДНК очищают и трансфицируют в клетки человека HEK293 c помощью реагента Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific). Клетки инкубируют в течение 72 часов, после чего из них выделяется геномная ДНК с помощью колонок для очистки геномной ДНК (Thermo Fisher Scientific). Целевой ДНК сайт анализируется с помощью секвенирования на платформе Illumina с целью определения числа вставок-делеций в ДНК, происходящих в целевом сайте по причине направленного двунитевого разрыва и последующей его репарации.

Для амплификации целевых фрагментов используют праймеры, фланкирующие предположительное место внесения разрыва.

После амплификации пробы готовятся по протоколу реагента Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB) для подготовки образцов к высокопроизводительному секвенированию. Затем проводится секвенирование на платформе Illumina 300cycles, прямое прочтение. Результаты секвенирования анализируются биоинформатическими методами. В качестве детекции разрезания принимается вставка или делеция нескольких нуклеотидов в целевой последовательности ДНК.

Доставка в виде рибонуклеинового комплекса осуществляется путем инкубации рекомбинантной формы PpCas9 NLS c направляющими РНК в CutSmart буфере (NEB). Рекомбинантный белок получают из бактериальных клеток-продуцентов, очищая его с помощью аффинной хроматографии (NiNTA, Qiagen) разделением по размеру (Superdex 200). 

Белок смешивают с РНК в соотношении 1:2 (PpCas9 NLS : sgRNA), инкубируют в течение 10 минут на комнатной температуре, затем смесь трансфицируют в клетки.

Далее проводится анализ экстрагированной из них ДНК на предмет вставок-делеций в целевом ДНК сайте (как описано выше).

Охарактеризованная в настоящем изобретении нуклеаза PpCas9 из бактерии Pasteurella pneumotropica имеет ряд преимуществ относительно ранее охарактеризованных Cas9 белков.

PpCas9 обладает коротким, двухбуквенным, отличным от других известных Cas нуклеаз PAM мотивом, необходимым для функционирования системы. В изобретении было показано, что для функционирования PpCas9 достаточно присутствия короткого PAM мотива (RT), распложенного в 4 нуклеотидах от протоспейсера.

Известные на сегодняшний день большинство Cas нуклеаз, способных вносить двунитевые разрывы в ДНК, имеют сложные многобуквенные PAM последовательности, ограничивающие выбор последовательностей, пригодных для разрезания. Среди изученных Cas нуклеаз, распознающих короткие PAM, только PpCas9 может распознавать последовательности, фланкированные RT мотивом.

Второе преимущество PpCas9 – малый размер белка (1055 а.о). На сегодняшний день это единственный изученный малоразмерный белок, обладающий двухбуквенной RT PAM последовательностью.

PpСas9 – новая, малоразмерная Cas нуклеаза, имеющая короткий, простой в использовании PAM, отличающийся от известных на сегодняшний день PAM последовательностей других нуклеаз. Белок PpCas9 разрезает с высокой эффективностью различные ДНК-мишени, в том числе и при 37 °С, и может стать основой нового инструмента геномного редактирования.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные случаи приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть, понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения. 

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий»

<120> СРЕДСТВО РАЗРЕЗАНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ CAS9 БЕЛКА ИЗ БАКТЕРИИ PASTEURELLA PNEUMOTROPICA

<130> 1

<160> 2

<210> 1

<211> 1055

<212> PRT

<213> Pasteurella pneumotropica

<220>

<223> белок, гомологичный Cas9

<400> 1

Met Gln Asn Asn Pro Leu Asn Tyr Ile Leu Gly Leu Asp Leu Gly Ile

1 5 10 15

Ala Ser Ile Gly Trp Ala Val Val Glu Ile Asp Glu Glu Ser Ser Pro

20 25 30

Ile Arg Leu Ile Asp Val Gly Val Arg Thr Phe Glu Arg Ala Glu Val

35 40 45

Ala Lys Thr Gly Glu Ser Leu Ala Leu Ser Arg Arg Leu Ala Arg Ser

50 55 60

Ser Arg Arg Leu Ile Lys Arg Arg Ala Glu Arg Leu Lys Lys Ala Lys

65 70 75 80

Arg Leu Leu Lys Ala Glu Lys Ile Leu His Ser Ile Asp Glu Lys Leu

85 90 95

Pro Ile Asn Val Trp Gln Leu Arg Val Lys Gly Leu Lys Glu Lys Leu

100 105 110

Glu Arg Gln Glu Trp Ala Ala Val Leu Leu His Leu Ser Lys His Arg

115 120 125

Gly Tyr Leu Ser Gln Arg Lys Asn Glu Gly Lys Ser Asp Asn Lys Glu

130 135 140

Leu Gly Ala Leu Leu Ser Gly Ile Ala Ser Asn His Gln Met Leu Gln

145 150 155 160

Ser Ser Glu Tyr Arg Thr Pro Ala Glu Ile Ala Val Lys Lys Phe Gln

165 170 175

Val Glu Glu Gly His Ile Arg Asn Gln Arg Gly Ser Tyr Thr His Thr

180 185 190

Phe Ser Arg Leu Asp Leu Leu Ala Glu Met Glu Leu Leu Phe Gln Arg

195 200 205

Gln Ala Glu Leu Gly Asn Ser Tyr Thr Ser Thr Thr Leu Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Thr Ala Leu Leu Met Trp Gln Lys Pro Ala Leu Ala Gly Asp Ala

225 230 235 240

Ile Leu Lys Met Leu Gly Lys Cys Thr Phe Glu Pro Ser Glu Tyr Lys

245 250 255

Ala Ala Lys Asn Ser Tyr Ser Ala Glu Arg Phe Val Trp Leu Thr Lys

260 265 270

Leu Asn Asn Leu Arg Ile Leu Glu Asn Gly Thr Glu Arg Ala Leu Asn

275 280 285

Asp Asn Glu Arg Phe Ala Leu Leu Glu Gln Pro Tyr Glu Lys Ser Lys

290 295 300

Leu Thr Tyr Ala Gln Val Arg Ala Met Leu Ala Leu Ser Asp Asn Ala

305 310 315 320

Ile Phe Lys Gly Val Arg Tyr Leu Gly Glu Asp Lys Lys Thr Val Glu

325 330 335

Ser Lys Thr Thr Leu Ile Glu Met Lys Phe Tyr His Gln Ile Arg Lys

340 345 350

Thr Leu Gly Ser Ala Glu Leu Lys Lys Glu Trp Asn Glu Leu Lys Gly

355 360 365

Asn Ser Asp Leu Leu Asp Glu Ile Gly Thr Ala Phe Ser Leu Tyr Lys

370 375 380

Thr Asp Asp Asp Ile Cys Arg Tyr Leu Glu Gly Lys Leu Pro Glu Arg

385 390 395 400

Val Leu Asn Ala Leu Leu Glu Asn Leu Asn Phe Asp Lys Phe Ile Gln

405 410 415

Leu Ser Leu Lys Ala Leu His Gln Ile Leu Pro Leu Met Leu Gln Gly

420 425 430

Gln Arg Tyr Asp Glu Ala Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp His Tyr Gly

435 440 445

Lys Lys Ser Thr Glu Thr Thr Arg Leu Leu Pro Thr Ile Pro Ala Asp

450 455 460

Glu Ile Arg Asn Pro Val Val Leu Arg Thr Leu Thr Gln Ala Arg Lys

465 470 475 480

Val Ile Asn Ala Val Val Arg Leu Tyr Gly Ser Pro Ala Arg Ile His

485 490 495

Ile Glu Thr Ala Arg Glu Val Gly Lys Ser Tyr Gln Asp Arg Lys Lys

500 505 510

Leu Glu Lys Gln Gln Glu Asp Asn Arg Lys Gln Arg Glu Ser Ala Val

515 520 525

Lys Lys Phe Lys Glu Met Phe Pro His Phe Val Gly Glu Pro Lys Gly

530 535 540

Lys Asp Ile Leu Lys Met Arg Leu Tyr Glu Leu Gln Gln Ala Lys Cys

545 550 555 560

Leu Tyr Ser Gly Lys Ser Leu Glu Leu His Arg Leu Leu Glu Lys Gly

565 570 575

Tyr Val Glu Val Asp His Ala Leu Pro Phe Ser Arg Thr Trp Asp Asp

580 585 590

Ser Phe Asn Asn Lys Val Leu Val Leu Ala Asn Glu Asn Gln Asn Lys

595 600 605

Gly Asn Leu Thr Pro Tyr Glu Trp Leu Asp Gly Lys Asn Asn Ser Glu

610 615 620

Arg Trp Gln His Phe Val Val Arg Val Gln Thr Ser Gly Phe Ser Tyr

625 630 635 640

Ala Lys Lys Gln Arg Ile Leu Asn His Lys Leu Asp Glu Lys Gly Phe

645 650 655

Ile Glu Arg Asn Leu Asn Asp Thr Arg Tyr Val Ala Arg Phe Leu Cys

660 665 670

Asn Phe Ile Ala Asp Asn Met Leu Leu Val Gly Lys Gly Lys Arg Asn

675 680 685

Val Phe Ala Ser Asn Gly Gln Ile Thr Ala Leu Leu Arg His Arg Trp

690 695 700

Gly Leu Gln Lys Val Arg Glu Gln Asn Asp Arg His His Ala Leu Asp

705 710 715 720

Ala Val Val Val Ala Cys Ser Thr Val Ala Met Gln Gln Lys Ile Thr

725 730 735

Arg Phe Val Arg Tyr Asn Glu Gly Asn Val Phe Ser Gly Glu Arg Ile

740 745 750

Asp Arg Glu Thr Gly Glu Ile Ile Pro Leu His Phe Pro Ser Pro Trp

755 760 765

Ala Phe Phe Lys Glu Asn Val Glu Ile Arg Ile Phe Ser Glu Asn Pro

770 775 780

Lys Leu Glu Leu Glu Asn Arg Leu Pro Asp Tyr Pro Gln Tyr Asn His

785 790 795 800

Glu Trp Val Gln Pro Leu Phe Val Ser Arg Met Pro Thr Arg Lys Met

805 810 815

Thr Gly Gln Gly His Met Glu Thr Val Lys Ser Ala Lys Arg Leu Asn

820 825 830

Glu Gly Leu Ser Val Leu Lys Val Pro Leu Thr Gln Leu Lys Leu Ser

835 840 845

Asp Leu Glu Arg Met Val Asn Arg Asp Arg Glu Ile Ala Leu Tyr Glu

850 855 860

Ser Leu Lys Ala Arg Leu Glu Gln Phe Gly Asn Asp Pro Ala Lys Ala

865 870 875 880

Phe Ala Glu Pro Phe Tyr Lys Lys Gly Gly Ala Leu Val Lys Ala Val

885 890 895

Arg Leu Glu Gln Thr Gln Lys Ser Gly Val Leu Val Arg Asp Gly Asn

900 905 910

Gly Val Ala Asp Asn Ala Ser Met Val Arg Val Asp Val Phe Thr Lys

915 920 925

Gly Gly Lys Tyr Phe Leu Val Pro Ile Tyr Thr Trp Gln Val Ala Lys

930 935 940

Gly Ile Leu Pro Asn Arg Ala Ala Thr Gln Gly Lys Asp Glu Asn Asp

945 950 955 960

Trp Asp Ile Met Asp Glu Met Ala Thr Phe Gln Phe Ser Leu Cys Gln

965 970 975

Asn Asp Leu Ile Lys Leu Val Thr Lys Lys Lys Thr Ile Phe Gly Tyr

980 985 990

Phe Asn Gly Leu Asn Arg Ala Thr Ser Asn Ile Asn Ile Lys Glu His

995 1000 1005

Asp Leu Asp Lys Ser Lys Gly Lys Leu Gly Ile Tyr Leu Glu Val Gly

1010 1015 1020

Val Lys Leu Ala Ile Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Val Asp Glu Leu Gly

1025 1030 1035 1040

Lys Asn Ile Arg Pro Cys Arg Pro Thr Lys Arg Gln His Val Arg

1045 1050 1055

<210> 2

<211> 3168

<212> DNA

<213> Pasteurella pneumotropica

<220>

<223> белок, гомологичный Cas9

<400> 2

atgcaaaata atccattaaa ttacatttta gggttagatt taggcattgc ttctattggt 60

tgggcggttg tggaaattga tgaggagagt tcacctattc gcttaattga tgtgggcgtc 120

cgtacatttg aacgggctga agtcgctaaa accggcgaaa gtttagcatt gtctcgtcgt 180

ttagctcgtt catcacggcg attaattaaa cgccgagcag agcgattaaa aaaagcaaaa 240

cgtttattaa aagcagaaaa gattttacat tctattgatg aaaaattacc cattaatgtt 300

tggcagcttc gagtaaaagg attgaaggaa aaactcgaac gtcaggagtg ggcagcggtt 360

ttattacatt tgtcaaagca tcgtggctat ttatcacaac gtaaaaatga gggtaaaagt 420

gataataaag agctgggggc attactttca ggtatcgcaa gtaaccacca aatgttgcaa 480

tcctccgaat atcgtacccc tgcagaaatt gcagtcaaaa aatttcaagt agaagaagga 540

catattcgta atcaacgtgg atcttatacc cataccttta gccgtttgga tttgttggca 600

gaaatggaat tattatttca acgccaagct gagttaggca attcttacac gtccaccaca 660

ttattagaaa atttgacggc gttactaatg tggcaaaagc cagctcttgc gggtgatgcg 720

attttaaaaa tgttgggcaa gtgtaccttc gaacccagcg aatataaagc cgcaaaaaat 780

agttattctg ctgaacgttt tgtgtggtta accaagctga ataatttacg cattttagaa 840

aatggcacgg aaagagcttt aaatgacaat gaacgttttg ctttgcttga gcaaccgtat 900

gagaaatcaa aattaactta tgctcaagtg agagcaatgc ttgcgttatc tgataatgct 960

attttcaaag gggttcgtta tttaggcgaa gataaaaaaa cagtagagag caaaactacg 1020

ttgatagaaa tgaagtttta tcatcaaatc cgcaaaacat taggcagtgc agaattaaaa 1080

aaggaatgga atgagttaaa aggcaattcc gatttattag atgagattgg cacggcattt 1140

tcgttgtata aaacggatga tgatatttgc cgttatttag agggaaaact accagaaagg 1200

gtattaaatg cgttattgga aaatttaaat ttcgataaat ttattcaact ttcacttaaa 1260

gccttacacc aaattttacc attgatgctg caagggcaac gttatgatga ggcggtttct 1320

gcgatttatg gtgatcatta tggtaaaaaa tcgacagaaa caacccgctt gttgccgact 1380

attcctgccg atgaaatccg aaatcctgtg gtattacgca ccctgaccca agcccgtaaa 1440

gtgatcaatg cggtggtgcg gttatatggt tcgcctgccc gtattcatat tgaaacagcg 1500

agagaagtcg gcaaatctta ccaagatcgt aaaaaacttg aaaaacagca agaagataat 1560

cgtaagcaac gtgaaagtgc ggtcaaaaaa tttaaagaaa tgtttccgca ttttgtgggg 1620

gagccgaaag gtaaagatat tttaaaaatg cgattgtatg agttacaaca agcgaaatgt 1680

ttatattctg gaaaatcttt agaacttcat cgtttgcttg agaaggggta tgtagaagtg 1740

gatcacgctt tgccattttc tcgcacgtgg gatgatagct ttaataataa agtactggtg 1800

cttgccaacg agaaccaaaa taaaggcaat ttaacgcctt atgaatggtt agatggtaaa 1860

aataacagtg agcgttggca acattttgtt gtacgagtac aaaccagcgg tttctcttat 1920

gctaaaaaac aacgcatttt gaaccataaa ttggatgaaa aagggtttat cgaacgtaat 1980

ttaaacgata ctcgctatgt agctcgtttc ttatgtaact ttattgccga taatatgttg 2040

ttggttggta aaggcaagcg aaacgtgttt gcttcaaacg ggcaaatcac ggcgttattg 2100

cggcatcgtt ggggcttaca aaaagtgcgt gaacagaatg atcgccacca cgcactggac 2160

gcggttgtgg tggcttgctc tactgtggca atgcaacaaa aaatcactcg atttgtgaga 2220

tataacgaag gaaatgtctt tagcggtgaa cgtatcgatc gtgaaactgg cgagattatt 2280

ccattacatt ttccaagccc ttgggctttt ttcaaagaga atgtggaaat tcgcattttt 2340

agtgaaaatc caaaattgga attagaaaat cgcctgcctg attatccgca atataatcac 2400

gaatgggtgc aaccattgtt tgtttcgaga atgccaaccc gaaaaatgac agggcaaggg 2460

catatggaaa cggtaaaatc cgcaaaacga ttaaatgaag gtttaagtgt gttaaaagtc 2520

cctttaacac aacttaaatt gagtgattta gaacgaatgg ttaatcgtga tcgtgaaatt 2580

gcattgtatg aatccttaaa agcacgttta gagcaatttg gtaacgaccc agccaaagcc 2640

tttgccgaac cattctataa aaagggtggg gcattagtca aagcagtccg attggaacaa 2700

acacaaaaat cgggggtatt agtacgtgat ggtaacggtg ttgcggataa tgcttcaatg 2760

gtacgggttg atgtttttac taaaggtgga aaatatttct tagtgccgat ttatacttgg 2820

caggtagcga aagggatttt accgaatagg gctgcgacac aaggtaaaga tgaaaatgat 2880

tgggatatta tggatgaaat ggctactttc caattttctc tatgtcaaaa tgatctaatt 2940

aaattagtta ccaaaaagaa aacaatcttt ggatatttta atggattaaa tagagctact 3000

agcaatataa atattaaaga gcatgatcta gataagtcta aagggaaatt aggtatttac 3060

ttagaagttg gtgtaaaact agctatttcc cttgaaaagt accaagtcga cgaactcggc 3120

aaaaatatcc gtccttgtcg tccgactaaa cgacagcacg tgcgttaa 3168

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Описано применение белка, способного образовывать двунитевой разрыв в последовательности ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3', содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5'-NNNN(A/G)T-3' в указанной молекуле ДНК. Кроме того, описан способ образования двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК одноклеточного или многоклеточного организма, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3'. Вводят в по меньшей мере одну клетку этого организма эффективное количество а) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и способного образовывать двунитевой разрыв в последовательности ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3', или нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и б) направляющей РНК, содержащей последовательность, образующую дуплекс с нуклеотидной последовательностью участка геномной ДНК организма, непосредственно примыкающей к нуклеотидной последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3', и взаимодействующей с указанным белком после образования дуплекса, или последовательности ДНК, кодирующей указанную направляющую РНК. При этом взаимодействие указанного белка с направляющей РНК и нуклеотидной последовательностью 5'-NNNN(A/G)T-3' приводит к образованию двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3’. Таким образом, достигается повышение универсальности доступных систем CRISPR-Cas9, что позволит использовать нуклеазы Cas9 из различных организмов для разрезания геномной или плазмидной ДНК в большем количестве специфических сайтов и при различных условиях. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 13 ил., 2 табл., 4 пр.

1. Применение белка, способного образовывать двунитевой разрыв в последовательности ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5'- NNNN(A/G)T-3', содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или содержащего аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 и имеет отличия по сравнению с SEQ ID NO: 1 только в неконсервативных аминокислотных остатках, для образования двунитевого разрыва в молекуле ДНК, расположенного непосредственно перед нуклеотидной последовательностью 5'-NNNN(A/G)T-3' в указанной молекуле ДНК.

2. Применение по п. 1, характеризующееся тем, что образование двунитевого разрыва в молекуле ДНК происходит при температуре от 35 до 45 °С.

3. Применение белка по п. 1, где белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

4. Способ образования двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК одноклеточного или многоклеточного организма, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3', включающий:

введение в по меньшей мере одну клетку этого организма эффективного количества а) белка, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 и способного образовывать двунитевой разрыв в последовательности ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3', или нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок, и б) направляющей РНК, содержащей последовательность, образующую дуплекс с нуклеотидной последовательностью участка геномной ДНК организма, непосредственно примыкающей к нуклеотидной последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3', и взаимодействующей с указанным белком после образования дуплекса, или последовательности ДНК, кодирующей указанную направляющую РНК;

при этом взаимодействие указанного белка с направляющей РНК и нуклеотидной последовательностью 5'-NNNN(A/G)T-3' приводит к образованию двунитевого разрыва в последовательности геномной ДНК, непосредственно примыкающей к последовательности 5'-NNNN(A/G)T-3'.

5. Способ по п. 4, дополнительно включающий введение экзогенной последовательности ДНК одновременно с направляющей РНК.