Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, к средствам молекулярной диагностики, а именно к дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Чума плотоядных - высококонтагиозное вирусное заболевание, поражающее многих диких и домашних плотоядных, приводящее к высокой заболеваемости и смертности у невосприимчивых хозяев [1]. Передача вирусных частиц происходит при контакте или вдыхании загрязненных жидкостей, хотя недавно сообщалось, что блохи являются переносчиками инфекции [2]. Проявление чумы плотоядных варьирует от легких до тяжелых симптомов в зависимости от иммунного статуса хозяина [3].
Возбудитель чумы плотоядных (ВЧП) животных относится к порядку Mononegavirales, семейству Paramyxoviridae, подсемейству Orthoparamyxoviridae, роду Morbillivirus, виду Canine Distemper virus (CDV) [4].
CDV представляет собой оболочечный несегментированный одноцепочечный РНК-содержащий вирус длиной около 15690 н.о. [5]. РНК вируса с отрицательным зарядом включает в себя семь генов CDVgp1-7, которые кодируют семь следующих белков: N-, P-, C-, М-, F-, H- и L-белки (РНК-зависимая РНК-полимераза) [6] соответственно.
Вирус чумы плотоядных имеет два типа гликопротеиновых шипов, гемагглютининовые (H) и слившиеся (F) белки на вирусной оболочке [1]. Хотя были обнаружены нейтрализующие антитела против обоих этих гликопротеидов вирусной оболочки, известно, что антитела к H-белку имеют решающее значение для защитного иммунитета против чумы плотоядных. На сегодняшний день эпитопы H-белка вируса чумы плотоядных не были нанесены на карту, но известно, что H-белок обладает наибольшей антигенной вариабельностью и поэтому, является подходящей мишенью для молекулярно-эпидемиологических исследований [2, 3]. Эпитопы H-белка были сопоставлены с другими Morbillivirus, включая вирус кори и чумы крупного рогатого скота, и был описан имунодоминантный эпитоп в сходном структурном расположении для этих двух вирусов, что позволяет предположить, что общие антигенные структуры H-белков у Morbillivirus схожи [4]. Следовательно, это потенциально может быть экстраполировано на вирус чумы плотоядных для оценки изменений, которые могут быть связаны с антигенными различиями, выявленными между штаммами. Размер H-гена составляет 1821 н.о. [5].
Основываясь на филогенетическом анализе, последовательность гена гемагглютинина (H) и их последовательности, вирус чумы плотоядных классифицируется на генетические линии, распределённые по всему миру в соответствии с географической структурой [6]. Условие для присвоения родословной гласит, что два штамма принадлежат к одной и той же линии, если они группируются вместе в филогенетическом древе и демонстрируют расхождение по аминокислоте H менее 4% [6]. Во всем мире идентифицировано по меньшей мере 12 четко определенных линий вируса чумы плотоядных, обозначенных как Америка-1 (вакцинные штаммы), Америка-2, Америка-3, Америка-4, Европа 1/Южная Америка 1, Европа 2/ Европа-дикая природа, Европа 3/Арктика, Азия 1, Азия 2, Южная Африка, Южная Америка 2 и 3 [7-16].
Система мер для борьбы с чумой плотоядных животных и ее профилактика предусматривает иммунизацию домашних животных [4]. Для этой цели применяют вакцинные препараты, которые включают в свой состав штамм «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных.
Учитывая, что вакцинные штаммы возбудителя чумы плотоядных применяются для производства инактивированных культуральных препаратов, но при этом отличаются друг от друга по иммунобиологическим показателям, необходимо на этапе контроля вируссодержащего материала использовать способы, которые могут быстро проводить дифференциацию вакцинного штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных животных от других штаммов ВЧП [5]. Данный этап крайне необходим при контроле качества сырья при изготовлении вакцинных препаратов и подтверждения использования требуемого штамма при изготовлении вакцин против чумы плотоядных животных в рамках крупномасштабного процесса.
Учитывая, что в настоящее время для изготовления вакцин широко применяется штамм «Рокборн» вируса чумы плотоядных животных, целесообразно провести разработку способа дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Штамм «Рокборн» вируса чумы плотоядных депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №28 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Методы молекулярно-биологического анализа находят широкое применение в диагностике различных инфекционных заболеваний, в том числе ВЧП. С помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов целевого участка гена возбудителя при наличии одной или нескольких уникальных замен можно проводить дифференциацию генетических форм вирусов друг от друга даже внутри одного вида [6-8].
Однонуклеотидный полиморфизм представляет собой различие последовательностей ДНК в одинаковых участках генома на один нуклеотид (аденин (A), тимин (T), гуанин (G) или цитозин (С)). Если в последовательности гена имеется участок с заменой одного нуклеотида на другой, например, TAСGCА и TAАGCА, то говорят о существовании двух аллелей данного гена - С-аллель и А-аллель.
Анализ максимальных значений температур плавления для различных штаммов вирусов и других микроорганизмов представляет собой исследование кривой плавления ампликонов, содержащих аллель-специфичные мутации, в широком диапазоне температур с узким шагом. Сочетание улучшенного инструментария количественной детекции ампликонов и флуоресцирующих красителей последнего поколения позволила выявлять генетические изменения в последовательностях нуклеиновых кислот путем контролируемого плавления двухцепочечных молекул кДНК [9-11].
Сущность представленного метода заключается в том, что после проведения ПЦР целевого участка гена с применением флуоресцирующего красителя смесь постепенно нагревают, и при достижении определённой температуры продукты реакции начинают разъединяться, флуорофор постепенно высвобождается, уровень флуоресценция (Fl), которая детектируется оптической системой термоциклера, снижается. Чувствительность анализа достигает одного нуклеотида по изменению пика температуры плавления кДНК, что позволяет достичь высокой общей точности разработанного способа.
Прототипным вариантом проведения дифференциации штамма «Рокборн» ВЧП от других штаммов возбудителя чумы плотоядных является секвенирование с помощью метода Фредерика Сенгера [9], однако он является очень дорогим, предполагает использование большого количества реактивов, дорогого оборудования, а также продолжительным по времени проводимого исследования.
Задачей настоящего изобретения является разработка чувствительного и специфичного, быстрого способа дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП с целью устранения вышеуказанных недостатков.
Данная задача решена благодаря разработке способа дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Сущность разработанного способа заключается в следующем:
1) создание дизайна высокоспецифичных олигонуклеотидных прямого и обратного праймеров для синтеза целевого фрагмента кДНК H-гена с мутациями, уникальными для штамма «Рокборн» ВЧП;
2) проведение реакций обратной транскрипции и ПЦР с применением SYBR Gold;
3) постепенное нагревание в широком диапазоне температур полученных ПЦР-продуктов.
При достижении пика температуры плавления двуцепочечная молекула кДНК ВЧП распадается на отдельные цепи, что вызывает яркий флуоресцентный сигнал, специфичный для красителя SYBR Gold. Для каждого варианта нуклеотидного состава характерна своя температура плавления. Анализируя кривые плавления ПЦР-продуктов, возможно проводить дифференциацию штамма «Рокборн» ВЧП от других штаммов возбудителя чумы плотоядных кошек.
Разработанный способ дает возможность: 1) сократить время проведения анализа до 3 ч; 2) применять SYBR Gold, который не ингибирует реакцию и характеризующийся яркой флуоресценцией после встраивания в ПЦР-продукты, что позволяет достичь высокую точность и чувствительность анализа; 3) увеличить чувствительность и специфичность анализа за счет использования высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров, рассчитанных для целевого участка кДНК участка H-гена ВЧП (размер ПЦР-продукта составляет 94 п.н.). Данная разработка позволит расширить арсенал средств для проведения контроля качества сырья при производстве вакцин против чумы плотоядных животных.
Технический результат изобретения заключается в том, что разработанный способ дает возможность:
1) повысить чувствительность и специфичность за счет применения высокоспецифичных праймеров:
CDV-DIFF-F с дизайном 5'- GGAGACCACCCTATTTGCTGT-3' и CDV-DIFF-R с дизайном 5'- GATACTTGGTGAAATCGAACTCC-3', рассчитанных для амплификации ПЦР-продукта размером 94 п.н.;
2) повысить достоверность проводимого анализа благодаря применению SYBR Gold;
3) с помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов H-гена ВЧП и температуре плавления ПЦР-продуктов провести дифференциацию штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Сущность изобретения отражена на графических изображениях:
Фиг. 1 - Карта нуклеотидных замен для участка H-гена ВЧП и дизайн прямого и обратного праймеров. Примечание: отражены нуклеотидные последовательности для следующих штаммов разных генотипов вируса чумы плотоядных: «Рокборн», «SA-3», «TW/05-CYY», «Europe-1/SA-1», «SA-2», «Asia-4», «America-2», «Africa-2», «Asia-1», «Arctic», «Asia-2», «America-1», «Asia-3», «CDV 36».
Фиг. 2 - Диаграмма максимумов температур плавления ПЦР-продуктов при анализе участка H-гена ВЧП.
Сущность изобретения пояснена в перечне последовательностей, в котором:
SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов H-гена кДНК штамма «Рокборн» ВЧП;
SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот, кодируемых последовательностью нуклеотидов H-гена кДНК штамма «Рокборн» ВЧП;
SEQ ID NO:3 представляет последовательность нуклеотидов прямого праймера CDV-DIFF-F;
SEQ ID NO:4 представляет последовательность нуклеотидов обратного праймера CDV-DIFF-R.
Заявляемый способ основан на проведении следующих этапов анализа:
1) экстрагирование РНК ВЧП из образца;
2) проведение обратной транскрипции и ПЦР специфического фрагмента кДНК генома ВЧП размером 94 п.н. с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров CDV-DIFF-F с дизайном 5'- GGAGACCACCCTATTTGCTGT-3' и CDV-DIFF-R с дизайном 5'- GATACTTGGTGAAATCGAACTCC-3' и SYBR Gold;
3) анализ однонуклеотидных полиморфизмов H-гена штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных животных с проведением дифференциации от других штаммов ВЧП.
По результатам анализа опубликованных в научной литературе данных, в настоящее время используется только прототипный способ дифференциации штаммов ВЧП с помощью секвенирования по Ф. Сенгеру [9], однако, как указано выше, он очень дорогостоящий, трудоемкий и продолжительный по времени проводимого исследования. При анализе публикаций способ дифференциации штамма «Рокборн» ВЧП от других штаммов возбудителя чумы плотоядных с помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов H-гена не представлен. Таким образом, сведений об аналогах предлагаемого способа авторами не обнаружено.
Разработанный способ дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП по сравнению с прототипом отличается экономической выгодой, легкостью и экспрессностью выполнения анализа, что позволяет быстро проводить анализ. Используемый SYBR Gold для обнаружения различных типов нуклеиновых кислот более чувствителен своих аналогов, в частности, чем бромистый этидий.
В отличие от прототипа разработанный способ позволяет провести анализ выравнивания множественных нуклеотидных последовательностей целевого участка кДНК генома ВЧП. Разработанный способ предусматривает проведение ПЦР специфического фрагмента H-гена с применением олигонуклеотидных высокоспецифичных праймеров для амплификации фрагмента размером 94 п.н.
Разработанный способ предусматривает проведение плавления ПЦР-продуктов с учетов пиков температур плавления двуцепочечных кДНК и применение SYBR Gold, а также детекцию результатов анализа с определением максимальных значений температур плавления для решения задачи по дифференциации штаммов штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП. Таким образом, разработан способ дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Обоснованием выбранного участка H-гена возбудителя ВЧП является наличие уникальных аллель-специфичных мутаций, характерных для штамма «Рокборн» ВЧП в сравнении с другими штаммами возбудителя чумы плотоядных, а именно:
в позиции 139 п.н. замена А на G,
в позиции 144 п.н. замена G на A,
в позиции 148 п.н. замена С на A,
в позиции 156 п.н. замена G на A,
в позиции 162 п.н. замена C на T (фиг. 1).
Ключевым элементом заявляемого способа является применение олигонуклеотидных праймеров CDV-DIFF-F с дизайном 5'- GGAGACCACCCTATTTGCTGT-3' и CDV-DIFF-R с дизайном 5'- GATACTTGGTGAAATCGAACTCC-3' и SYBR Gold для проведения дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров для дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП представлен в таблице 1. По результатам анализа длины, молекулярного веса и термодинамических показателей, представленных в таблице 2, видно, что олигонуклеотидные праймеры соответствуют требованиям [11] и могут быть использованы в дальнейших исследованиях.
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что новизна и изобретательский уровень заявляемого изобретения заключаются в применении высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров CDV-DIFF-F и CDV-DIFF-R, рассчитанных для амплификации целевого участка кДНК генома возбудителя ВЧП размером 94 п.н. и дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена на графическом материале - «Диаграмма максимумов температур плавления ПЦР-продуктов при анализе участка H-гена ВЧП» (фиг. 2).
На основном этапе исследования проводят выделение РНК из образцов с использованием набора «РНК-сорб» в соответствии с инструкцией производителя («Интерлабсервис», РФ).
На следующем этапе проводят обратную транскрипцию и ПЦР с применением высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров и SYBR Gold для исследования стандартного образца и проб. Стандартным образцом является культуральная суспензия штамма «Рокборн» ВЧП, которая изначально исследована с помощью секвенирования по Ф. Сенгеру для подтверждения наличия именно требуемого штамма в стандарте (n = 4). В качестве отрицательного контроля используют деионизированную воду без нуклеаз.
Для постановки реакции готовят смесь, которая включает в свой состав следующие компоненты: PCR buffer 10× - 2,5 мкл, хлорид магния 25 мМ - 3,0 мкл, олигонуклеотидные праймеры (50 пМ) - по 0,1 мкл, краситель SYBR Gold - 1 мкл, Taq ДНК-полимераза - 2 е.а. (0,2 мкл), MMLV-ревертаза - 2 е.а. (0,2 мкл), элюат кДНК - 5 мкл, деионизированная вода - 12,9 мкл. Итоговый объем смеси для проведения одной реакции составляет 25 мкл.
Постановку ПЦР осуществляют в детектирующем термоциклере Rotor Gene, или аналоге при температурных и временных параметрах, сведения о которых представлены в таблице 3.
Обратную транскрипцию проводят при температуре 42°С в течение 20 мин. Предварительную денатурацию проводят при температуре 98°С в течение 3 минут. ПЦР в режиме реального времени включает в себя 3 подэтапа: денатурацию, отжиг олигонуклеотидов, элонгацию. Денатурацию осуществляют при температуре 98°С в течение 5 секунд, отжиг олигонуклеотидов - при температуре 56°С в течение 15 секунд, элонгацию - при температуре 72°С в течение 15 секунд. Далее проводят плавление при температуре, начиная с 65 до 90°С. Увеличение температуры составляет - 0,1°С за каждый шаг. При этом после первого шага плавления требуется ждать 90 секунд при температуре первого шага. Для каждого последующего шага время ожидания составляет 2 секунды.
Исследование кривой плавления двуцепочечных фрагментов кДНК представленных выше генотипов возбудителя ВЧП для анализа данных и профилей плавления образцов выполняют с использованием программного обеспечения для сканирования с помощью детектирующего амплификатора. Проводят построение кривых плавления в виде параболы и детектируют пики температур плавления для полученных графиков. Выявляют, какие максимумы температур плавления характерны для штаммов ВЧП, что позволяет проводить дифференциацию штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Пример 1. Разработка способа дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП
Для определения показателей, позволяющих проводить дифференциацию штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП с помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов H-гена, осуществляли этапы работы, представленные ниже.
На первом этапе исследования проводили выделение нуклеиновой кислоты из вируссодержащего образца, как указано выше.
На следующем этапе осуществляли обратную транскрипцию и ПЦР для исследования проб в соответствии с описанием, представленным выше. Для постановки реакции готовили реакционную смесь, как отражено выше. Проведение анализа осуществляли, как отражено выше.
Исследование профилей плавления образцов выполняли с использованием программного обеспечения Rotor Gene. Проводили построение кривых плавления и детектировали максимумы температур плавления для полученных графиков. Тестировали кДНК возбудителя чумы плотоядных в 32 повторностях для каждого образца для получения результатов с высокой степенью достоверности следующих штаммов: «Рокборн», «SA-3», «TW/05-CYY», «Europe-1/SA-1», «SA-2», «Asia-4», «America-2», «Africa-2», «Asia-1», «Arctic», «Asia-2», «America-1», «Asia-3», «CDV 36».
Выявили, что данная температура для указанных штаммов составила: «Рокборн» - 72,33±0,01°С (n=32, p<0,001), а для «SA-3» и «CDV 36» - 73,59±0,01°С (n=32, p<0,001), для «TW/05-CYY», «Europe-1/SA-1», «SA-2», «Asia-4», «America-2», «Africa-2», «Asia-1», «Arctic», «Asia-2», «America-1», «Asia-3» - 74,47±0,01°С (n=32, p<0,001) (фиг. 2, табл. 4).
Следовательно, для каждого из исследуемых штаммов возбудителя ВЧП характерны значения пика температуры плавления, которые отличаются от данного параметра для исследуемого производственного штамма «Рокборн» ВЧП по анализируемому участку H-гена. Таким образом, разработан способ дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Пример 2. Исследование аналитической специфичности разработанного способа дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП
Специфичность анализа дифференциации штамма «Рокборн» ВЧП от других штаммов возбудителя чумы плотоядных кошек оценивали при исследовании суспензий вируса ВЧП штамма «Рокборн», а также штамма «РВ-97» вируса бешенства, штамма «Рич» возбудителя коронавирусного энтерита собак, штамма «Мира» возбудителя калицивироза кошек. Количество инфекционных доз вирусов в суспензиях составлял не менее 5,0 lg ТЦД50/см3 или 5,0 lg ККИД50/см3. Исследования проводили в 7 повторностях.
В качестве положительного контроля использовали суспензию ВЧП штамма «Рокборн». Отрицательным контролем служила деионизированная вода. Исследования проводили, как указано выше.
В результате исследования обнаружили, что для проб, не содержащих нуклеиновую кислоту возбудителя ВЧП штамма «Рокборн», и отрицательного контроля не формировались графики плавления и не были обнаружены пиковые значения при анализе высокого разрешения. При исследовании положительного контроля получены следующие значения температур плавления для штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных: 72,33±0,01°С (n = 7, p<0,005). Результаты анализа контролей подтверждают данные, отраженные в примере 1.
Таким образом, полученные данные свидетельствовали о 100%-ной специфичности разработанного способа дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП.
Пример 3. Определение диагностических показателей разработанного способа дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП
Для определения диагностической чувствительности разработанного способа анализировали 425 заведомо положительных проб суспензий возбудителя ВЧП штамма «Рокборн» с титрами инфекционной активности не ниже 5,0 lg ТЦД50/см3.
Проведение анализа осуществляли, как отражено выше. С помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что из 425 исследуемых проб ВЧП все определены в качестве положительных и подтверждено наличие именно штамма «Рокборн» ВЧП, который содержался в анализируемых суспензиях.
Для исследования специфичности метода тестировали 258 суспензий возбудителя чумы плотоядных, за исключением штамма «Рокборн» ВЧП. В результате исследования с помощью разработанного способа (предлагаемое изобретение) определили, что все 258 проб содержали геном возбудителя ВЧП, но не геном штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных. Пользуясь представленными выше статистическими методами анализа определили, что в 95%-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,14-100,00%, диагностическая специфичность (DSp) - 98,58-100,0%, k-критерий - 1,000; общая точность (DAc) - 99,46-100,00%.
Основными преимуществами предлагаемого изобретения является возможность проводить за короткий промежуток времени (не более 3 ч) дифференциацию штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП. Выявили, что в целевом участке генома кДНК возбудителя чумы плотоядных имеется 5 аллель-специфичных мутаций по сравнению с другими штаммами, а именно, в позициях в позиции 139, 144, 148, 156, 162 п.н., уникальные для штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных. Это позволило использовать высокоспецифичные олигонуклеотидные праймеры, рассчитанные для амплификации целевого участка кДНК H-гена возбудителя чумы плотоядных размером 94 п.н. и с помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов данного участка нуклеиновой кислоты проводить дифференциацию. Разработанный способ характеризуется 100%-ной аналитической специфичностью.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Способ дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП»
1. Murray K, Selleck P, Hooper P, Hyatt A, Gould A, Gleeson L, Westbury H, Hiley L, Selvey L, Rodwell B, Ketterer P. A morbillivirus that caused fatal disease in horses and humans. Science. 1995;286:94-7.
2. Bolt G, Jensen TD, Gottschalck E, Arctander P, Appel MJ, Buckland R, Blixenkrone-Moller M. Genetic diversity of the attachment (H) protein gene of current field isolates of canine distemper virus. J. Gen. Virol. 1997;78:367-72.
3. Carpenter MA, Appel MJ, Roelke-Parker ME, Munson L, Hofer H, East M, O'Brien SJ. Genetic characterization of canine distemper virus in Serengeti carnivores. Vet Immunol Immunopathol. 1998;65:259-66.
4. Sugiyama M, Ito N, Minamoto N, Tanaka S. Identification of immunodominant neutralizing epitopes on the hemagglutinin protein of rinderpest virus. J Virol. 2002;76:1691-6.
5. Anis E, Holford AL, Galyon GD, Wilkes RP. Antigenic analysis of genetic variants of canine distemper virus. Vet Microbiol. 2018; https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2018.03.014
6. Martella V, Elia G, Lucente M, Decaro N, Lorusso E, Banyai K, Blixenkrone-Moller M, Lan N, Yamaguchi R, Cirone F, Carmichael L, Buonavoglia C. Heterogeneity within the hemagglutinin genes of canine distemper virus (CDV) strains detected in Italy. Vet Microbiol. 2006;116:301-9.
7. Blixenkrone-Moller M, Svansson,V, Appel M, Krogsrud J, Have P, Orvell C. Antigenic relationships between field isolates of morbilliviruses from different carnivores. Arch Virol 1992; 123: 279-294.
8. Budaszewski RD, Pinto LD, Weber MN, Caldart ET, Alves CD, Martella V, Ikuta N, Lunge, V.R., Canal, CW. Genotyping of canine distemper virus strains circulating in Brazil from 2008 to 2012. Virus Res 2014; 180: 76-83. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2013.12.024
9. Estrada-Rivadeneyra D. Sanger sequencing. FEBS J. 2017 Dec;284(24):4174. doi: 10.1111/febs.14319. Epub 2017 Nov 24. PMID: 29171728.
10. Haas L, Martens W, Greiser-Wilke I, Mamaev L, Butina T, Maack D, Barrett T. Analysis of the haemagglutinin gene of current wildtype canine distemper virus isolates from Germany. Virus Res. 1997;48:165-71.
11. Harder TC, Kenter M, Vos H, Siebelink K, Huisman W, van Amerongen G, Orvell C, Barrett T, Appel MJ, Osterhaus AD. Canine distemper virus from diseased large felids: biological properties and phylogenetic relationships. J Gen Virol. 1996;77:397-405.
12. Iwatsuki K, Tokiyoshi S, Hirayama N, Nakamura K, Ohashi K, Wakasa C, Mikami T, Kai C. Antigenic differences in the H proteins of canine distemper viruses. Vet Microbiol. 2000;71:281-6.
13. Panzera Y, Calderon MG, Sarute N, Guasco S, Cardeillac A, Bonilla B, Hernandez M, Francia L, Bedo G, La Torre J, Perez R. Evidence of two co-circulating genetic lineages of canine distemper virus in South America. Virus Res. 2012;163:401-4. https://doi.org/10.1016/j.virusres.2011.10.008
14. Riley MC, Wilkes RP. Sequencing of emerging canine distemper virus strain reveals new distinct genetic lineage in the United States associated with disease in wildlife and domestic canine populations. Virol J. 2015;12:219.
15. Woma TY, van Vuuren M, Bosman AM, Quan M, Oosthuizen M. Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of current wild-type canine distemper viruses from South Africa: lineage Africa. Vet Microbiol. 2010;143:126-32. https://doi.org/10.1016/j.vetmic.2009.11.013
16. Pardo ID, Johnson GC, Kleiboeker SB. Phylogenetic characterization of canine distemper viruses detected in naturally infected dogs in North America. J Clin Microbiol. 2005 Oct;43(10):5009-17. doi: 10.1128/JCM.43.10.5009-5017.2005. PMID: 16207955; PMCID: PMC1248462.
Таблица 1
Дизайн специфичных олигонуклеотидных праймеров для дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП (предлагаемое изобретение)
Таблица 2
Физические, термодинамические параметры и температура плавления олигонуклеотидных праймеров для дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП (предлагаемое изобретение)
- метод с учетом концентрации ионов в растворе
Примечание: термодинамические параметры олигонуклеотидных праймеров рассчитаны при условии:
концентрация NaCl 1 М,
температура 25°С,
водородный показатель (рН) 7,0.
Таблица 3
Временные и температурные режимы обратной транскрипции и ПЦР в режиме реального времени дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП (предлагаемое изобретение)
Примечание: градиент температур составлен на этапе плавления с шагом 0,1°С,
* - детекция сигнала.
Таблица 4
Средние показания температур плавления, при которых достигались пиковые значения для исследуемых ампликонов штаммов ВЧП (предлагаемое изобретение)
(n = 32, p<0,001)
ампликона при использовании разработанного способа, °С
Примечание: анализ проводили на приборе Rotor Gene, отражены средние значения пиков температур и среднеквадратичное отклонение.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="CDV Rockborn.xml"
softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"
productionDate="2024-08-22">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-08-22</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>580</ApplicantFileReference>
<EarliestPriorityApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2024-08-22</FilingDate>
</EarliestPriorityApplicationIdentification>
<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ "Федеральный центр охраны
здоровья животных" (ФГБУ "ВНИИЗЖ")</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin> Federal State-Financed Institution Federal
Centre for Animal Health (FGBI ARRIAH)</ApplicantNameLatin>
<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим
Игоревич</InventorName>
<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ дифференциации штамма
«Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов
ВЧП</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>1821</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..1821</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q1">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>atgctctcctaccaagacaaggtgggtgccttctataaagataatgcaa
gagctaattcatccaagctgtccttagtgacagaagagcaagggggcaggagaccaccctatttgctgtt
tgtccttctcatcctactggttggaatcatggccttacttgctatcactggagttcgatttcaccaagta
tcaactagcaatatggaatttagcagattgctgaaagaggatatggagaaatcagaggccgtacatcacc
aagtcatagatgtcttgacaccgctcttcaaaattattggagatgagattgggttacggttgccacaaaa
actaaacgagatcaaacaatttatccttcaaaagacaaacttcttcaatccgaacagggaattcgacttc
cgcgatctccactggtgcattaacccacctagtaagatcaaggtgaatttaactaattactgcgatacaa
ttgggctcagaaaatctattgcatcggcagcaaatcccatccttttatcagcactctccagaggcagagg
tgacatattcccaccatacagatgcagtggagctactacttcagtaggcagatttttccccctatcagta
tcattgtccatgtctttgatctcaagaacatcagagataatcaatatgctaaccgctatctcagacggag
tgtatggtaaaacttatttgctagtgcctgattatattgaaggggagttcgacacgcaaaagattcgagt
ctttgagatagggttcatcaaacggtggctgaatgacatgccattactccagacaaccaactatatggtc
ctcccggagaattccaaagccaaggtatgtactatagcagtgggcgagttgacactggcttccttgtgtg
tagatgagagcaccgtattgttatatcatgacagcaatggttcacaagatggtattctagtagtgacgct
gggaatatttggggcaacacctatggatcaagttgaagaggtgatacctgtcgctcacccatcagtagaa
aaaatacatataacaaatcaccgtgggttcataaaagattcaatagcaacctggatggtgcctgcattgg
tctctgagaaacaagaggaacaaaaaaattgtctggagtcggcttgtcaaagaaaatcctaccctatgtg
caaccaaacgtcatgggaaccctttggaggaggacagttgccatcttatgggcggttgacattacctcta
gatccaagtattgaccttcaacttaacatatcgtttacatacggtccggttatactgaatggagacggta
tggattattatgaaagcccacttttggactccggatggcttaccattcctcccaagaacggaacagtcct
tggattgataaacaaagcaagtagaggagaccagttcactgtaatcccccatgtgttgacatttgcgccc
agggaatcaagtggaaattgttatttacctattcaaacattccagattatggataaagatgtccttactg
agtccaatttagtggtgttgcctacacagaattttagatatgtcatagcaacatatgatatatcccggga
cgatcatgcgattgtttattatgtttatgacccaatccggaagatttcttttacgtacccatttagacta
actaccaagggtagacctgatttcctaaggattgaatgttttgtgtgggatgacgatttgtggtgtcacc
aattttaccgattcgaggctgacatcaccaactttacaaccagtgttgagaatttagtccgtataagatt
ctcatgtaaccgttcaaaacct</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>607</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..607</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>MLSYQDKVGAFYKDNARANSSKLSLVTEEQGGRRPPYLLFVLLILLVGI
MALLAITGVRFHQVSTSNMEFSRLLKEDMEKSEAVHHQVIDVLTPLFKIIGDEIGLRLPQKLNEIKQFIL
QKTNFFNPNREFDFRDLHWCINPPSKIKVNLTNYCDTIGLRKSIASAANPILLSALSRGRGDIFPPYRCS
GATTSVGRFFPLSVSLSMSLISRTSEIINMLTAISDGVYGKTYLLVPDYIEGEFDTQKIRVFEIGFIKRW
LNDMPLLQTTNYMVLPENSKAKVCTIAVGELTLASLCVDESTVLLYHDSNGSQDGILVVTLGIFGATPMD
QVEEVIPVAHPSVEKIHITNHRGFIKDSIATWMVPALVSEKQEEQKNCLESACQRKSYPMCNQTSWEPFG
GGQLPSYGRLTLPLDPSIDLQLNISFTYGPVILNGDGMDYYESPLLDSGWLTIPPKNGTVLGLINKASRG
DQFTVIPHVLTFAPRESSGNCYLPIQTFQIMDKDVLTESNLVVLPTQNFRYVIATYDISRDDHAIVYYVY
DPIRKISFTYPFRLTTKGRPDFLRIECFVWDDDLWCHQFYRFEADITNFTTSVENLVRIRFSCNRSKP</
INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ggagaccaccctatttgctgt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q5">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>CDV</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>gatacttggtgaaatcgaactcc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Изобретение относится к области вирусологии. Описан способ дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП, включающий экстрагирование РНК ВЧП из образца и проведение обратной транскрипции и ПЦР специфического фрагмента кДНК генома ВЧП. Затем проводят анализ однонуклеотидных полиморфизмов H-гена с проведением дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных животных по пику температуры плавления. Технический результат заключается в возможности проведения дифференциации штамма «Рокборн» возбудителя чумы плотоядных от других штаммов ВЧП с помощью анализа однонуклеотидных полиморфизмов H-гена ВЧП и температуре плавления ПЦР-продуктов с высокими чувствительностью, специфичностью и достоверностью. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 3 пр.
1. Способ дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных от других штаммов ВЧП, содержащий следующие этапы:
- экстрагирование РНК ВЧП из образца;
- проведение обратной транскрипции и ПЦР специфического фрагмента кДНК генома ВЧП размером 94 п.н. с применением SEQ ID NO:3 и SEQ ID NO:4 и SYBR Gold;
- анализ однонуклеотидных полиморфизмов H-гена с проведением дифференциации штамма «Рокборн» вируса чумы плотоядных животных по пику температуры плавления, предполагающим, что максимум температуры плавления фрагмента кДНК штамма «Рокборн» оставляет 72,33±0,01°С, для других штаммов ВЧП составляет 74,47±0,01°С.
2. Способ по п. 1, где аналитическая специфичность составляет 100%, диагностическая чувствительность в 95%-ном доверительном интервале – 99,14-100,00%, диагностическая специфичность – 98,58-100,0%.
3. Способ по п. 1, где время проведения анализа сокращается до 3 ч.
| Ассоциированная вакцина против чумы плотоядных, парвовирусного и коронавирусного энтеритов, аденовирусной инфекции собак | 2022 |
|
RU2806164C1 |
| СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ ОСНОВНОГО И НЕОСНОВНЫХ ПОДВИДОВ И ВОЗБУДИТЕЛЯ ПСЕВДОТУБЕРКУЛЕЗА МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ | 2010 |
|
RU2425891C1 |
| CN 103667537 B, 18.03.2015. | |||
