ЛЕКАРСТВЕННЫЕ КОНЪЮГАТЫ ИЗ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АГЕНТОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХ cMET, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/30 A61K39/395 A61P35/00 C12P21/08 

Область техники, к которой относится изобретение

Варианты осуществления изобретения относятся к агентам, связывающим cMET, которые конъюгированы с пирролобензодиазепиновыми токсинами, к их композиции и к их применению.

Предшествующий уровень техники

Белок cMET, иногда называемый MET или рецептором фактора роста гепатоцитов (HGFR), представляет собой белок, который у человека кодируется геном MET (протоонкоген MET, рецепторная тирозинкиназа). cMET представляет собой однопроходный рецептор клеточной поверхности, который обладает тирозинкиназной активностью. Первичный одноцепочечный белок-предшественник продукта трансляции МЕТ посттрансляционно расщепляется с образованием альфа- и бета-субъединиц, которые связаны дисульфидной связью, с образованием рецептора cMET на поверхности зрелой клетки. cMET экспрессируется на клетках эпителиального происхождения, а также стволовых клетках, клетках-предшественниках и других типах клеток (например, различных типах раковых клеток). Фактор роста гепатоцитов/рассеивающий фактор (HGF/SF) и его изоформы сплайсинга (NK1, NK2) были идентифицированы как лиганды cMET.

Считается, что cMET необходим для нормального эмбрионального развития, органогенеза и заживления ран. Аномальная экспрессия и/или активность cMET связаны с некоторыми неопластическими заболеваниями и видами рака (например, раком почки, печени, желудка, молочной железы и опухолями головного мозга), где cMET участвует в росте опухоли, ангиогенезе и метастазировании. Сверхэкспрессия cMET, а также его аутокринная активация путем совместной экспрессии его лиганда также вовлечены в онкогенез.

В настоящей заявке представлены новые анти-cMET связывающие агенты (например, моноклональные антитела), которые конъюгированы с цитотоксической нагрузкой, их фармацевтические композиции и способы их применения.

Изложение сущности изобретения

В некоторых аспектах в настоящей заявке представлен конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, содержащий связывающий агент и полезную нагрузку, где полезная нагрузка включает пирролобензодиазепиновый токсин, а связывающий агент специфически связывается с фактором мезенхимально-эпителиального перехода (cMET). В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит связывающую группу, где пирролобензодиазепиновый токсин ковалентно связан со связывающей группой, а связывающая группа ковалентно связана со связывающим агентом. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент представляет собой моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть.

В некоторых аспектах в настоящей заявке представлен конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, содержащий связывающий агент и нагрузку, где связывающий агент включает: (i) две или более из CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, которые являются полипептидными последовательностями гипервариабельной области легкой цепи (CDR-L), где CDR-L1 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15, CDR-L2 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16-25, а CDR-L3 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 26-36, а (ii) две или более из CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, которые представляют собой полипептидные последовательности гипервариабельной области тяжелой цепи (CDR-H), где CDR-H1 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 50-61, CDR-H2 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 62-78, и CDR-H3 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 79-93, а полезная нагрузка включает пирролобензодиазепиновый токсин и связывающую группу; где пирролобензодиазепиновый токсин ковалентно связан со связывающей группой, связывающая группа ковалентно связана со связывающим агентом, а связывающий агент специфически связывается с внеклеточным доменом фактора мезенхимально-эпителиального перехода (cMET).

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепиновый токсин имеет структуру химической формулы I:

[Хим. 1]

, (I)

где

Z₁ и Z₂ оба представляют собой N;

Z₃ и Z₄ оба представляют собой C;

[Хим. 2]

двойные линии с пунктиром представляют собой одинарную связь или двойную связь;

n составляет от 1 до 12;

каждый из R₃ и R₄ независимо представляет собой H или C_1-4 алкоксил, а

каждый из R₁ и R₂ независимо выбран из группы, состоящей из H, C_1-5 алкила, C_3-6 циклоалкила, C_2-5 алкенила и фенила, при необходимости замещенного R₅,

где

R₅ выбран из группы, состоящей из -NH₂, -NHR₆ и пиперазинила, замещенного R₇, имеющего структуру

[Хим. 3]

,

R₆ содержит связывающую группу, и

R₇ представляет собой H или C_1-5 алкил;

X₁ отсутствует, является защитной группой или включает связывающую группу;

X₂ отсутствует, является защитной группой или содержит связывающую группу;

только один из X₁, X₂, R₁ и R₂ содержит связывающую группу, а

каждый из Y₁ и Y₂ независимо отсутствует, является ОН или SO3H;

при условии, что:

[Хим. 4]

(i) когда Х₁ включает связывающую группу, представляет собой N-С,

(ii) когда Х₂ включает связывающую группу, представляет собой N-С,

(iii) когда Х₁ включает защитную группу, представляет собой N-С, и

(iv) когда Х2 включает защитную группу, представляет собой N-С.

где фрагмент указан как отсутствующий в случае его отсутствия или присутствия одного или нескольких атомов водорода для достижения необходимой валентности.

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина из структуры химической формулы I n равен 3 или 5. В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина из структуры химической формулы I оба из R₃ и R₄ представляют собой -O-CH₃. В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина из структуры химической формулы I оба из R₁ и R₂ представляют собой метил, или оба из R₁ и R₂ представляют собой -CH=CH-CH₃. В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина из структуры химической формулы I R₂ представляет собой циклопропил. В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина из структуры химической формулы I R₂ представляет собой фенил, замещенный 4-метилпиперазин-1-илом, или фенил, замещенный R₅, где R₅ представляет собой -NHR₆, а R₆ содержит связывающую группу.

[Хим. 5]

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина структуры химической формулы I Х₁ отсутствует, Y₁ отсутствует, представляет собой N=C; Х₂ отсутствует, Y₂ отсутствует, а представляет собой N=C. В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина структуры химической формулы I Х₁ содержит связывающую группу, Y₁ представляет собой ОН, представляет собой N=C, Х₂ отсутствует, и Y₂ отсутствует. В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина структуры химической формулы I Х₁ содержит связывающую группу, Y₁ представляет собой ОН, представляет собой N-C, Х₂ является защитной группой, Y₂ представляет собой ОН.

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина из структуры химической формулы I связывающая группа присоединена к пирролобензодиазепиновому токсину посредством карбаматной группы или амидной группы.

В некоторых вариантах осуществления связывающая группа содержит структуру химической формулы A:

[Хим. 6]

,

где звездочка указывает точку присоединения к пирролобензодиазепиновому токсину; волнистой линией обозначена точка присоединения к связывающему агенту; m составляет от 1 до 20; q составляет от 1 до 10, а E является соединительной группой. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы A m равен 4 или 8, а q равен 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления m равен 8, и q равен 2.

В некоторых вариантах осуществления связывающая группа имеет структуру химической формулы B:

[Хим. 7]

,

где звездочка указывает точку присоединения к пирролобензодиазепиновому токсину; волнистой линией обозначена точка присоединения к связывающему агенту; E содержит соединительную группу; v составляет от 0 до 10, а u равен 0 или 1; где в случае, если u равен 1, t составляет от 1 до 10. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы из химической формулы B v равен 1. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы из химической формулы B u равен 1, а t равен 8. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы из химической формулы B u равен 0, а v равен 4.

В некоторых вариантах осуществления связывающей группы из химических формул A и B связывающий агент соединен с E тиоэфирной связью, образованной между цистеиновым тиольным остатком связывающего агента и E. В некоторых вариантах осуществления E содержит структуру из химической формулы C:

[Хим. 8]

,

где волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту, а двойная звездочка указывает точку присоединения к связывающей группе.

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепинового токсина из структуры химической формулы I защитная группа имеет следующую структуру (D):

[Хим. 9]

,

где звездочка указывает точку присоединения к пирролобензодиазепиновому токсину, а w равен от 1 до 5. В некоторых вариантах осуществления w равен 2. В некоторых вариантах осуществления защитная группа представляет собой отщепляемую защитную группу.

В определенных аспектах в настоящей заявке представлен конъюгат связывающего агента с лекарственным средством, содержащий связывающий агент и нагрузку, где связывающий агент специфически связывается с внеклеточным доменом фактора мезенхимально-эпителиального перехода (cMET), полезная нагрузка ковалентно связана со связывающим агентом, и полезная нагрузка содержит структуру, выбранную из группы, состоящей из химических формул II, III, V, VI и VII, где химическая формула II включает структуру:

[Хим. 10]

,

где m равен 8, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту;

химическая формула III включает структуру:

[Хим. 11]

,

где m равен 8, p равен 2 или 3, X₂ представляет собой защитную группу, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту;

химическая формула V включает структуру:

[Хим. 12]

,

где m равен 8, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту;

химическая формула VI включает структуру:

[Хим. 13]

,

где t равен 8, v равен 1, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту;

и химическая формула VII включает структуру:

[Хим. 14]

,

где волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту.

В некоторых вариантах осуществления защитная группа X₂ имеет следующую структуру (D):

[Хим. 15]

,

где звездочка указывает точку прикрепления к нагрузке, а w равен от 1 до 5.

В некоторых аспектах, представленных в настоящей заявке, обеспечивается конъюгат связывающего агента с лекарственным средством, содержащий моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, и полезную нагрузку, где моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть содержит CDR-L1, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14; CDR-L2, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23 и 25; CDR-L3, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33 и 35; CDR-H1, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 и 59; CDR-H2 выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 73 и 75, а CDR-H3, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 91 и 93.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент из конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, описанного в настоящей заявке, включает CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10 или 14; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 25; CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, а CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент из конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, описанного в настоящей заявке, включает CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или 15; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24; CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34; CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 или 78, а CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37-44. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит последовательность вариабельной легкой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности или 100% идентичности последовательности с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 45-49. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с любой одной или SEQ ID NO: 37-49, где последовательность вариабельной области легкой цепи имеет от одной до десяти или от одной до пяти аминокислотных модификаций, выбранных из добавления аминокислоты, делеции аминокислоты и замены аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 94-103. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности или 100% идентичности последовательности с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 104-108. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 94-108, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи имеет от одной до десяти, или от одной до пяти аминокислотных модификаций, выбранных из добавления аминокислоты, делеции аминокислоты и замены аминокислоты.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит последовательность вариабельной области легкой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с любой из SEQ ID NO: 37-49, и последовательность вариабельной области тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательности с любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 94-108.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть являются химерными или гуманизированными. Например, в некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько гуманизированных или человеческих каркасных областей и/или одну или несколько мышиных каркасных областей.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть содержит тяжелую цепь и легкую цепь, каждая из которых имеет CDR, которые идентичны соответствующим CDR тяжелой цепи и легкой цепи антитела, продуцируемого гибридомной клеточной линией F6B1P3D12, депонированной в ATCC 20 марта 2019.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывается с cMET или его частью, включает антигенсвязывающую часть антитела или одноцепочечного антитела. Например, в некоторых вариантах осуществления связывающий агент из конъюгата связывающего агента и лекарственного средства включает Fab, Fab', F(ab')2, Fv или scFV фрагмент антитела.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с cMET млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с cMET человека, cMET обезьяны и/или cMET крысы. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с внеклеточным доменом сМЕТ дикого типа или варианта cMET. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывается с cMET, представляет собой связывающий агент, который индуцирует интернализацию и/или деградацию cMET в раковой клетке человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывается с cMET, представляет собой связывающий агент, который не является агонистом cMET. Соответственно, связывающий cMET агент, который не является агонистом cMET, является связывающим агентом, который при связывании с cMET на клеточной поверхности по существу не индуцирует передачу сигналов через cMET клеточной поверхности.

В некоторых аспектах в настоящей заявке представлена фармацевтическая композиция, содержащая описанный здесь конъюгат связывающего агента и лекарственного средства и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель, добавку или носитель.

В определенных аспектах в настоящей заявке представлен способ лечения субъекта, страдающего неопластическим заболеванием или раком, включающий применение терапевтически эффективного количества конъюгата связывающего агента с лекарственным средством, описанного в настоящей заявке, у субъекта с наличием или подозрением на наличие неопластического заболевания или рака. В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента с лекарственным средством блокирует, ингибирует, ослабляет, отменяет или подавляет рост, жизнеспособность или метастазирование рака. В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента с лекарственным средством вызывает гибель, некроз или апоптоз части рака или всего рака. В некоторых вариантах осуществления неопластическое заболевание или рак включает карциному, саркому, нейробластому, глиобластому, миелому, лимфому, меланому или солидную опухоль, или опухоль мягких тканей. В некоторых вариантах осуществления неопластическое заболевание или рак включает рак мочевого пузыря, рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы (например, экзокринный рак поджелудочной железы и нейроэндокринный рак поджелудочной железы), рак пищевода, рак печени, гепатоцеллюлярный рак, гипофарингеальный рак, рак легкого, аденокарциному, рак яичника или рак почки. В некоторых вариантах осуществления неопластическое заболевание или рак включает аденокарциному поджелудочной железы, колоректальную аденокарциному, злокачественную опухоль тонкой кишки, холангиокарциному, немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ), карциному щитовидной железы, рак пищевода или пищеводно-желудочного перехода (ПЖП), аденокарциному желудка, печеночно-клеточную карциному, плоскоклеточную карциному головы и шеи, злокачественную опухоль женских половых путей, карциному молочной железы, мелкоклеточную карциному легкого, карциному поверхностного эпителия яичника, ретроперитонеальную или перитонеальную саркому, аденокарциному простаты, нейроэндокринную опухоль, желудочно-кишечную стромальную опухоль, глиобластому или неэпителиальный рак яичника. В некоторых вариантах осуществления рак, который можно лечить описанным в настоящей заявке способом, представляет собой рак, содержащий клетку (например, злокачественную или неопластическую клетку), которая экспрессирует полипептид cMET (например, cMET, например, экспрессируемый на поверхности клетки).

Некоторые аспекты технологии изложены далее в нижеследующем описании, примерах, формуле изобретения и чертежах.

Краткое описание чертежей

Чертежи иллюстрируют варианты осуществления технологии и не являются ограничивающими. Для ясности и простоты иллюстрации чертежи не выполнены в масштабе, и в некоторых случаях различные аспекты могут быть показаны в преувеличении или увеличении, чтобы облегчить понимание конкретных вариантов осуществления.

На фиг. 1 показано краткое изложение рабочего процесса, используемого для создания моноклональных антител (приеденных в качестве примера связывающих агентов), которые специфически связываются с cMET. Наилучшее моноклональное антитело P3D12 было получено от мышей, иммунизированных рекомбинантным интактным внеклеточным доменом cMET, слитым с Fc человека.

На фиг. 2 показана схема иммунизации, используемая для создания моноклональных антител (примерных связывающих агентов), которые специфически связываются с cMET. Первоначально мышей иммунизировали путем интраперитонеальной инъекции (и.п.) 100 мкг слитого белка cMET-Fc человека (cMET-Fc) или от 50 до 100 мкг конъюгированного с KLH пептида cMET в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ), как указано. cMET-Fc включает внеклеточный домен cMET человека, слитый с Fc-частью антитела. Пептиды cMET были стратегически выбраны из части внеклеточного домена cMET. Иммунизированные мыши получали одну или несколько бустерных иммунизаций, содержащих 25 или 50 мкг cMET-Fc или пептида в неполном адъюванте Фрейнда (НАФ), как указано. Некоторым мышам проводили повторную иммунизацию в нескольких местах (RIMMS). Иммунизация включала гибриды Met-Fc, традиционные пептиды и RIMMS. Селезенки иммунизированных мышей были получены и слиты с подходящим партнером гибридизации. Было получено и проанализировано более 20 000 клонов гибридомы.

На фиг. 3 показана трехмерная структура домена MET SEMA, связанного с Fab агонистического антитела Met-mAb (5D5 Fab), и бета-субъединицы HGF (HGFβ или HGFb). Нижняя стрелка указывает положение части cMET, используемой для конструирования пептида 3.

На фиг. 4 показаны результаты характеризации типичного гибрида (ГИБРИД 6B1, чашка 3). Гибридомы анти-cMET были отобраны, частично, на предмет наличия специфического связывания с cMET, как было определено с помощью ИФА (см. столбец, обозначенный «ИФА со связыванием МЕТ, ОП450нм»), и на способность индуцировать интернализацию cMET в линиях раковых клеток человека, при анализе посредством проточной цитометрии (см. столбец «FACS, среднее геометрическое»). Среднее геометрическое значение FACS ниже отрицательного контроля указывает на интернализацию cMET. Стрелкой показана наилучшая гибридома F6B1P3D12.

На фиг. 5 показаны результаты анализа деградации МЕТ. Антитела против cMET, выделенные из указанных лунок (ось x), были протестированы и отобраны по их способности индуцировать деградацию cMET на линиях раковых клеток человека, как измерено количественным определением белка cMET в мезомасштабах (MSD). Относительные значения деградации MЕТ указаны на оси Y как % от контроля (процент от контроля). Значения ниже 100% контроля (уровень отрицательного контроля) указывают на интернализацию и деградацию cMET. Деградация указывает не только на интернализацию, но и на лизосомный транспорт, важное свойство конъюгата антитело-лекарство. Стрелкой показаны результаты для ведущей гибридомы F6B1P3D12.

На фиг. 6 показаны результаты анализа фосфо-ERK (анализ P-ERK), который измеряет агонистическую активность антител против cMET путем косвенного измерения фосфорилирования ERK (внеклеточно регулируемой киназы), индуцированного связыванием антитела против cMET с cMET на поверхности клетки. Показано количество фосфорилированной ERK (как % от контроля, ось Y), обнаруженной в клеточных лизатах после обработки жизнеспособных клеток антителом против cMET. Антитела против cMET, полученные из различных гибридом против cMET (ось Х), тестировали при 6 мкг/мл или 30 мкг/мл (как указано на оси Х) и отбирали в соответствии с их неспособностью индуцировать значительное фосфорилирование ERK (т.е. их способностью не вызывать пролиферацию, т.е. отсутствием агонистической активности). Наилучшее моноклональное антитело (mAb) P3D12 указано стрелкой.

На фиг. 7 показаны результаты шести моноклональных антител (mAb) к cMET, которые были проанализированы с помощью ИФА на связывание с cMET человека, обезьяны (макаки-крабоеда, «Cyno»), собаки, крысы и мыши. Все моноклональные антитела связывали cMET человека и обезьяны. P3D12 продемонстрировало значительную перекрестную реактивность с крысиным cMET. На оси Х указаны различные концентрации каждого антитела. Связанные относительные количества указаны на оси Y(ОП450 нм). На фиг. 7-1 представлены результаты для трех моноклональных антител.

На фиг. 7-2 представлены результаты для трех других моноклональных антител.

На фиг. 8A показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей легкой цепи девяти мышиных моноклональных антител против cMET, названия которых указаны слева от каждой последовательности. SEQ ID NO: указаны справа от каждой последовательности. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи LC F6B1P1E2 и F6BP3E2 идентичны на 100%. Кроме того, аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи LC F6B1P3D12 и F6B1P3E9 идентичны на 100%.

На фиг. 8B показано выравнивание аминокислотных последовательностей вариабельных областей тяжелой цепи девяти мышиных моноклональных антител против cMET, названия которых указаны слева от каждой последовательности. SEQ ID NO: указаны справа от каждой последовательности. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи F6B1P3D12H7913 и F6B1P3E9 идентичны на 100%. Кроме того, аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи F6B1P1E2H7819 и F6BP3E2 идентичны на 100%.

На фиг. 9A и 9B показаны результаты модели ксенотрансплантата на мышах in vivo, оценивающей эффективность указанных конъюгатов антитела против cMET и лекарственного средства (ADC) с использованием модели опухоли MKN45 (cMET + модель рака желудка) на бестимусных мышах. У животных однократно применяли ADC в дозе 2,5 мг/кг (9A) или 5,0 мг/кг (9B). Эффективность каждого конъюгированного с лекарственным средством анти-cMET связывающего агента сравнивали с ФБР или неродственным ненаправленным моноклональным антителом (IgG-ADC). Объем опухоли (ось Y) измеряли в различные моменты времени после инокуляции (ось Y, дни (после инокуляции)). Подавление роста опухоли указывает на положительную эффективность. Связывающие агенты против cMET и нецелевое контрольное моноклональное антитело (IgG) конъюгировали с монометилауристатином F (MMAF).

На фиг. 10 показаны результаты анализа фосфо-ERK (анализа P-ERK), который измеряет агонистическую активность антител против cMET путем непрямого измерения фосфорилирования ERK, индуцированного связыванием антитела против cMET с cMET на поверхности клетки. Показано количество фосфорилированной ERK (показано как % от контроля, ось Y), обнаруженное в клеточных лизатах после обработки жизнеспособных клеток антителом против cMET. Константные области тяжелой и легкой цепей изолированного мышиного моноклонального антитела, обозначенного как P3D12, были заменены константными областями антитела человеческого IgG1 (P3D12 (hIgG1)) или человеческого IgG2 (P3D12 (hIgG2)), как указано на оси Х. Каждое антитело тестировали при 0,00064 мг/мл; 0,0032 мг/мл; 0,016 мг/мл; 0,08 мг/мл; 0,4 мг/мл; 2 мг/мл, 10 мг/мл и 50 мг/мл, как указано на оси Х. «Контроль» указывает на необработанный отрицательный контроль. HGF (EC90) является положительным контролем и указывает на клетки, обработанные фактором роста гепатоцитов (HGF), натуральным лигандом рецептора cMET. Эти данные показывают, что человеческий IgG2 изотип не проявляет обнаруживаемой агонистической активности.

На фиг. 11 показаны результаты анализа деградации МЕТ. Деградация является мерой интернализации рецептора cMET при связывании антитела. Химерные антитела против cMET были протестированы на их способность индуцировать деградацию cMET на линиях раковых клеток человека, при анализе путем количественного определения белка cMET в мезомасштабе (MSD). Относительные значения деградации Met указаны на оси Y как % контроля (процент от контроля). Значения ниже 100% от контроля указывают на интернализацию и деградацию cMET. Химерные антитела были получены путем замены константных областей тяжелой и легкой цепей выделенного мышиного моноклонального антитела, обозначенного как P3D12 (P3D12 (мышиный)), на константные области антитела человеческого IgG1 (P3D12 (hIgG1)) или человеческого IgG2 (P3D12 (hIgG2)), как указано на оси Х. Каждое антитело тестировали при концентрации 0,00064 мг/мл; 0,0032 мг/мл; 0,016 мг/мл; 0,08 мг/мл; 0,4 мг/мл; 2 мг/мл; 10 мг/мл и 50 мг/мл, как указано на оси Х. Химерные антитела cMET P3D12 показали аналогичную активность в отношении интернализации/деградации, что и исходное мышиное антитело P3D12.

На фиг. 12 показана структурная схема разработки процесса для тестирования и отбора наилучших моноклональных связывающих агентов против cMET.

На фиг. 13 показано выравнивание пяти вариабельных областей гуманизированной легкой цепи гуманизированных версий мышиного клона P3D12 против cMET, названия и SEQ ID NO: указаны слева от каждой последовательности. Для гуманизации мышиных mAb против cMET использовали пять независимых способов. Два способа дали одинаковый результат, поэтому показаны четыре разные легкие цепи.

На фиг. 14 показано выравнивание пяти вариабельных областей гуманизированной тяжелой цепи гуманизированных версий мышиного клона P3D12; названия и SEQ ID NO: указаны слева от каждой последовательности. Для гуманизации мышиных mAb против cMET использовали пять независимых способа. Два способа дали одинаковый результат, поэтому имеется четыре разных легких цепи (см. фиг. 13) и четыре разных тяжелых цепи, которые могут формировать комбинацию из 16 различных связывающих агентов.

На фиг. 15 показаны результаты на мышиной модели с ксенотрансплантатом in vivo, тестирующей эффективность указанных конъюгатов гуманизированного анти-cMET-антитела и лекарственного средства (ADC) при 2,5 мг/кг (2,5 mpk) или 5 мг/кг (5 mpk), как продемонстрировано с использованием модели опухоли MKN45 (сМЕТ + модель рака желудка). У животных применяли один раз указанные ADC в дозе 2,5 или 5,0 мг/кг. Эффективность каждого связывающего анти-cMET агента сравнивали с ФБР или нецелевым моноклональным антителом Ритуксимаб (Retux), которое представляет собой противораковое моноклональное антитело, нацеленное на CD20, который в основном обнаруживается на поверхности В-клеток иммунной системы. Объем опухоли (ось Y) измеряли в различные моменты времени (ось Y) после инокуляции. Подавление роста опухоли указывает на положительную эффективность. Агенты, связывающие cMET, конъюгировали с монометилауристатином F (MMAF).

На фиг. 16 показано связывание анти-cMET моноклонального связывающего агента hD12, который имеет вариабельную область тяжелой и легкой цепи SEQ ID NOs 108 и 47 и константную область человеческого IgG2, и антитела отрицательного контроля (Деносумаба), которое не связывает cMET, с cMET-Fc и мутантным cMET (E168D) Fc рекомбинантными слитыми белками. Мутация E168D - это соматическая мутация, обнаруживаемая при мелкоклеточном раке легкого (МКРЛ). Мутация расположена в домене Sema и приводит к конститутивной активации рецептора cMET. Количество соматических мутаций cMET является очень низким. E168D встречается у 0,8-3% пациентов с МКРЛ. ИФА на связывание выполняли с внеклеточными доменами cMET человека или E168D cMET, слитыми с Fc человеческого IgG1. Белки cMET наносили на планшет в течение ночи, и образцы титровали и определяли с помощью козьего антитела против человеческого IgG (H+L)-HRP. EC50 определяли с использованием сигмоидальной подгонки зависимости реакции от дозы.

Фиг. 17A показывает результаты анализа связывания cMET на основе ИФА. Вкратце, пять типичных конъюгатов антитела и лекарственного средства (т.е. hD12-VI, hD12-II, hD12-VII, hD12-IV и hD12-XI (см. номенклатуру антител, объясненную в примере 3)) были протестированы при возрастающих концентрациях (ось Х, концентрация конъюгата антитела и лекарственного средства (мг/мл)) на их способность связывать соединенный с планшетом человеческий cMET. Относительная сила связывания указывается люминесценцией (ось Y). Антитело отрицательного контроля (Деносумаб), которое не связывает cMET, было конъюгировано с каждой из пяти различных полезных нагрузок (т.е. нагрузок химической формулы VI, II, IV, VII и XI, обозначенных как Деносумаб-VI, Деносумаб-II, Деносумаб-IV, Деносумаб-VII и Деносумаб-XI, соответственно) и протестировано в качестве отрицательного контроля. Фигура 17B показывает значения IC50 для каждого из антител, протестированных на фиг. 17A.

На фиг. 18A-18D показаны результаты анализа цитотоксичности для пяти типичных конъюгатов антитело-лекарственное средство (hD12-VI, hD12-II, hD12-VII, hD12-IV и hD12-XI) на четырех клеточных линиях, которые экспрессируют различные количества cMET на их клеточной поверхности (SNU-1, отсутствие экспрессии cMET (фиг. 18A), SNU-16, средняя экспрессия cMET (фиг. 18B), SNU-620, высокая экспрессия cMET (фиг. 18C) и MKN-45, высокая экспрессия cMET (фиг. 18D)). Процент выживаемости указан на оси Y, а количество добавленного конъюгата антитела и лекарственного средства указано на оси Х (пМ).

Результаты обобщены на фиг. 18E, где показаны сравнительные значения IC50.

Фиг. 19A-19E показывают результаты анализа цитотоксичности для пяти типичных конъюгатов антитела и лекарственного средства (hD12-VI, hD12-II, hD12-VII, hD12-IV и hD12-XI) на пяти клеточных линиях, которые экспрессируют разное количество cMET на их клеточной поверхности (H441, средняя экспрессия cMET (фиг. 19A); H1373, средняя экспрессия cMET (фиг. 19B); H1975, средняя экспрессия cMET (фиг. 19C); SNU-5, высокая экспрессия cMET (фиг. 19D), а H1573, средняя экспрессия cMET (фиг. 19E)). На фиг. 19-1 представлены фиг. 19A-19D.

Фиг. 19-2. Здесь представлена фиг. 19E. Процент выживаемости указан на оси Y, а количество добавленного конъюгата антитела и лекарственного средства указано на оси Х (пМ). Результаты представлены на фиг. 19F, на которой показаны сравнительные значения IC50.

На фиг. 20 показаны результаты исследования ксенотрансплантата in vivo. Мышам вводили опухолевые клетки H1975 (средняя экспрессия cMET) и лечили либо hD12-XI (фиг. 20A, 20B и 20C), либо hD12-VI (фиг. 20A, 20B и 20D), hD12-II (фиг. 20A, 20B и 20E), hD12-VII (фиг. 20A, 20B и 20F) и hD12-IV (фиг. 20A, 20B и 20G), и определяли объем опухоли (ось Y, фиг. 20A и 20C-20G) или массу тела (фиг. 20В) с течением времени (т.е. дни, ось Х). Антитело отрицательного контроля (деносумаб), конъюгированное с каждой из пяти различных нагрузок (т.е. VI, II, IV, VII и XI), тестировали в качестве отрицательного контроля. На фиг. 20-1 представлена фиг. 20А.

На фиг. 20-2 представлена фиг. 20В.

На фиг. 20-3 представлена фиг. 20C.

На фиг. 20-4 представлена фиг. 20D.

На фиг. 20-5 представлена фиг. 20E.

На фиг. 20-6 представлена фиг. 20F.

На фиг. 20-7 представлена фиг. 20G.

На фиг. 21 показаны результаты исследования ксенотрансплантата in vivo. Мышам вводили опухолевые клетки H1373 (средняя экспрессия cMET) и лечили hD12-XI (фиг. 21A), hD12-VI (фиг. 21B), hD12-II (фиг. 21C), hD12-VII (фиг. 21D) и hD12-IV (фиг. 21E), и определяли объем опухоли (ось Y) с течением времени (то есть дни, ось Х). Антитело отрицательного контроля (Деносумаб), конъюгированное с II, тестировали в качестве отрицательного контроля. На фиг. 21-1 представлены фиг. 21A и 21B.

На фиг. 21-2 представлена фиг. 21С.

На фиг. 21-3 представлена фиг. 21D.

На фиг. 21-4 представлена фиг. 21Е.

На фиг. 22 показана масса тела (ось Y) мышей, получавших лечение, показанное на фиг. 21, с течением времени (ось X).

На фиг. 23 показана сывороточная концентрация (ось Y) hD12-XI, hD12-VI, hD12-II, hD12-VII, hD12-IV и Деносумаба-II после внутривенного введения мышам. Время (часы) после инъекции указано на оси Х. Концентрацию каждого конъюгата антитело-лекарственное средство определяли с помощью ИФА.

На фиг. 24 показаны результаты анализа связывания cMET на основе ИФА, демонстрирующие относительную аффинность hD12 и четырех вариантов hD12 (hD12-T289C, hD12-V442C и hD12-V282C), которые ковалентно связаны с нагрузкой II, для соединенного с планшетом человеческого cMET. hD12-II был стохастически связан с нагрузкой случайными сульфгидрильными группами. hD12-T289C-II, hD12-V442C-II и hD12-V282C-II были сайт-специфически связаны с нагрузкой в положении вариантного остатка цистеина (т.е. T289C, V442C и V282C, соответственно). Конъюгаты антитела и лекарственного средства тестировали при возрастающих концентрациях (ось Х, концентрация конъюгата антитела и лекарственного средства (мг/мл)) на их способность связывать соединенный с планшетом человеческий cMET. Относительная сила связывания указывается люминесценцией (ось Y). Антитело отрицательного контроля (Деносумаб-II) тестировали как отрицательный контроль. Фиг. 24B показывает значения IC50 для каждого из антител, протестированных на фиг. 24A.

На фиг. 25 показаны результаты анализа цитотоксичности для конъюгатов антител, показанных на фиг. 24 (т.е. hD12-II, hD12-T289C-II, hD12-V442C-II и hD12-V282C-II) на четырех клеточных линиях, которые экспрессируют разные количества cMET на их клеточной поверхности (SNU-1, отсутствие экспрессии cMET (фиг. 25A); SNU-16, средняя экспрессия cMET (фиг. 25B); SNU-620, высокая экспрессия cMET (фиг. 25C); MKN-45, высокая экспрессия cMET (фиг. 25D), а N87, низкая экспрессия cMET (фиг. 25E)). Процент выживаемости указан на оси Y, а количество добавленного конъюгата антитела и лекарственного средства указано на оси Х (пМ). Результаты суммированы на фиг. 25F, на которой показаны сравнительные значения IC50. Концентрации тестируемого конъюгата антитело-лекарственное средство показаны на фиг. 25G.

На фиг. 25-1 представлена фиг. 25А.

На фиг. 25-2 представлена фиг. 25В.

На фиг. 25-3 представлена фиг. 25С.

На фиг. 25-4 представлена фиг. 25D.

На фиг. 25-5 представлена фиг. 25Е.

На фиг. 25-6 представлены фиг. 25F и 25G.

На фиг. 26A показаны результаты анализа цитотоксичности конъюгатов антител, показанных на фиг. 24 (т.е. hD12-II, hD12-T289C-II, hD12-V442C-II и hD12-V282C-II), на линии клеток, экспрессирующих сМЕТ (т.е. SNU-5). Процент выживаемости указан на оси Y, а количество добавленного конъюгата антитела и лекарственного средства указано на оси x (пМ). Результаты суммированы на фиг. 26В, на которой показаны сравнительные значения IC50. Концентрации тестируемого конъюгата антитело-лекарственное средство показаны на фиг. 26C.

На фиг. 27 показаны результаты анализа цитотоксичности конъюгатов антител, показанных на фиг. 24 (т.е. hD12-II, hD12-T289C-II, hD12-V442C-II и hD12-V282C-II) на трех клеточных линиях, экспрессирующих средние количества cMET на их клеточной поверхности (H1373, фиг. 27A; H1573, фиг. 27B и H1975, фиг. 27C). Процент выживаемости указан на оси Y, а количество добавленного конъюгата антитела и лекарственного средства указано на оси x (пМ). Концентрации тестируемого конъюгата антитело-лекарственное средство показаны на фиг. 27D. Результаты приведены на фиг. 27E, на которой показаны сравнительные значения IC50. На фиг. 27-1 представлена фиг. 27А.

На фиг. 27-2 представлена фиг. 27В.

На фиг. 27-3 представлена фиг. 27С.

На фиг. 27-4 представлены фиг. 27D и 27E.

На фиг. 28 показаны результаты исследования ксенотрансплантата in vivo. Мышам вводили опухолевые клетки H1975 (средняя экспрессия cMET) и обрабатывали hD12-V442C-II (фиг. 28A), hD12-T289C-II (фиг. 28B) и hD12-V282C-II (фиг. 28C) в указанных концентрациях. Мышам вводили стохастически конъюгированный hD12-II в качестве положительного контроля. Мышам вводили носитель (ФБР) или Деносумаб-II в качестве отрицательного контроля. Объем опухоли (ось Y) определяли с течением времени (т.е. дни, ось Х). На фиг. 28-1 представлена фиг. 28А.

На фиг. 28-2 представлена фиг. 28B.

На фиг. 28-3 представлена фиг. 28C.

На фиг. 29 показана масса тела (ось Y) мышей, получавших лечение на фиг. 28, с течением времени (ось X).

На фиг. 30 показана сывороточная концентрация (ось Y) hD12-V442C-II (фиг. 28A), hD12-T289C-II (фиг. 28B) и hD12-V282C-II (фиг. 28C) после внутривенного введения крысам. Время (часы) после инъекции указано на оси Х. Концентрацию каждого конъюгата антитела и лекарственного средства определяли с помощью ИФА.

На фиг. 31 представлена таблица, обобщающая фармакокинетические данные, полученные в эксперименте на фиг. 30.

На фиг. 32 показаны результаты исследования in vivo полученного от пациента ксенотрансплантата (PDX) с использованием ткани первичного рака желудка человека (фиг. 32A), ткани первичного колоректального рака человека (фиг. 32B) и ткани рака головы и шеи человека (фиг. 32C). Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) показан на оси Y, а концентрация введенного конъюгата антитела (hD12-T289C-II) показана на оси Х. TGI% рассчитывали, как описано в Примере 12.

На фиг. 33A показано иммуногистохимическое окрашивание поперечного среза PDX модели рака желудка GA3121 на белок cMET человека. На фиг. 33B показан увеличенный вид области, показанной на белой вставке на фиг. 33A.

На фиг. 33C показаны результаты ингибирования роста на модели ксенотрансплантата опухоли GA3121, полученной от пациента (PDX), in vivo. Каждая точка данных представляет 1 группу, состоящую из 10 мышей. Мышам вводили носитель (ФБР) или секукинумаб-II в качестве отрицательного контроля. Объем опухоли (ось Y) определяли с течением времени (т.е. дни, ось X).

Описание вариантов осуществления изобретения

В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке представлены конъюгаты связывающего агента и лекарственного средства, содержащие связывающий агент (например, моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть) и полезную нагрузку (например, цитотоксическую нагрузку). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент представляет собой новое моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, которая специфически связывается с cMET. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит пирролобензодиазепиновый токсин (ПБД) и специфическую связывающую группу. Представленные в настоящей заявке новые конъюгаты связывающего агента и лекарственного средства полезны для лечения рака и/или неопластических расстройств.

Раскрытые в настоящей заявке связывающие агенты являются новыми не только по аминокислотным последовательностям их антигенсвязывающих областей (например, вариабельных областей тяжелой и легкой цепей), но также по их функциональным характеристикам. Например, описанные в настоящей заявке связывающие агенты против cMET обладают комбинацией различных характеристик, не обнаруженных у других антител к cMET. Во-первых, описанные здесь связывающие агенты против cMET не индуцируют значительную передачу сигналов (например, рецепторную тирозинкиназную активность) от рецептора cMET при связывании. Соответственно, при связывании связывающие cMET агенты, описанные в настоящей заявке, не вызывают нежелательной онкогенной активности при связывании (например, роста, пролиферации, метастазирования или ангиогенеза). Во-вторых, описанные в настоящей заявке связывающие агенты против cMET могут вызывать деградацию cMET и интернализуются после связывания. Преимущество этой характеристики заключается в том, что любая токсическая полезная нагрузка, прикрепленная к связывающему агенту против cMET, попадает внутрь клетки-мишени, тем самым снижая нецелевую неспецифическую токсичность нагрузки. Эта характеристика также позволяет контролировать или регулировать активность токсичной полезной нагрузки. Например, в некоторых вариантах осуществления токсическая полезная нагрузка, описанная в настоящей заявке, по существу неактивна до тех пор, пока не вступит в контакт с внутриклеточной протеазой. В-третьих, определенные связывающие анти-cMET агенты, описанные в настоящей заявке, перекрестно реагируют с антигенами нечеловеческих приматов, крыс и/или мышей, что позволяет тестировать и оптимизировать конъюгаты антитела и лекарственного средства с использованием моделей животных, не относящихся к человеку. В-четвертых, описанные в настоящей заявке связывающие агенты против cMET являются растворимыми, обладают длительным периодом полужизни in vivo и стабильны при хранении.

Известен ряд цитотоксических полезных нагрузок, которые могут быть присоединены к антителу с использованием известного линкера для создания конъюгата антитела и лекарственного средства (ADC) (например, см. US 2014/0120118, US 2014/0127239, US 2016/0250344, US 2016/0250345 и Tiberghien, et al., (2016) ACS Medicinal Chemistry Letters 7 (11): 983-987). Однако биохимические функции связывающего агента антитела часто изменяются после конъюгации с нагрузкой. Точно так же биохимические характеристики нагрузки после конъюгации с антителом не всегда предсказуемы. Например, активность известной нагрузки in vivo может значительно различаться, в диапазоне от летального эффекта до отсутствия терапевтического эффекта, в зависимости от типа используемого линкера и места, где линкер присоединен к антителу. Следовательно, создание конъюгата антитела и лекарственного средства путем комбинирования специфического связывающего cMET агента с идеальным линкером, выбранной токсической полезной нагрузкой и оптимальным сайтом конъюгации линкера с антителом для обеспечения оптимальной доставки токсина при существенном ограничении побочных эффектов (например, нецелевой токсичности), и поддержание необходимых биофункциональных свойств связывающего агента является чрезвычайно сложной задачей, требует много времени и значительных изобретательских усилий. Представленные в настоящей заявке ADC обеспечивают уникальную комбинацию токсинов, линкеров и новых связывающих cMET агентов, которые приводят к высокоэффективным ADC, обеспечивающим оптимальные терапевтические эффекты при существенном снижении или устранении нецелевой токсичности.

cMET

Термин «MET» используется в настоящей заявке как синоним термина «cMET». cMET также известен как рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR). сMET человека (например, SEQ ID NO: 109) содержит незрелую полипептидную последовательность из 1390 аминокислот и включает одиночную N-концевую последовательность из аминокислот 1-24, внеклеточный домен cMET человека примерно из аминокислот 24-932, и трансмембранный домен примерно от 933 до 955 аминокислоты, и цитоплазматический домен приблизительно от 956 до 1390 аминокислоты, при нумерации от N-конца до C-конца. Способы идентификации лидерных последовательностей, внеклеточных доменов, трансмембранных доменов и цитоплазматических доменов рецептора cMET известны, и любой подходящий способ можно использовать для идентификации таких доменов или областей в полипептидной последовательности cMET, происходящей от подходящего вида млекопитающих. Полипептид cMET человека может содержать несколько известных вариантов (например, см. URL: http://www.uniprot.org/uniprot/P08581, по состоянию на 5 мая 2016, где варианты cMET и альтернативные последовательности, раскрытые в нем, включены в настоящую заявку посредством ссылки). Неограничивающие примеры натуральных вариантов cMET человека включают аминокислотные замены 143, 150, 156, 168, 238, 316, 320, 375, 385, 773, 970, 991 и/или 992 cMET человека (SEQ ID NO: 109). В некоторых вариантах осуществления cMET или внеклеточный домен cMET содержит замену E на D в положении 168 человеческого cMET, обозначаясь в настоящей заявке как E168D. В некоторых вариантах осуществления cMET или внеклеточный домен cMET содержит замену N на S в положении 375 человеческого cMET, обозначаясь в настоящей заявке как N375S.

В некоторых вариантах осуществления cMET представляет собой cMET млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления cMET представляет собой cMET приматов. В некоторых вариантах осуществления cMET представляет собой cMET человека. В некоторых вариантах осуществления cMET представляет собой cMET обезьяны. В некоторых вариантах осуществления cMET представляет собой cMET грызуна (например, крысы и/или мыши). В некоторых вариантах осуществления cMET представляет собой cMET псовых (например, cMET собаки). Неограничивающие примеры cMET млекопитающих представлены в Примере 5 и/или в списке последовательностей данной заявки. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен cMET включает N-концевую часть полипептида cMET, который обычно экспрессируется на клеточной поверхности интактной клетки млекопитающего. Внеклеточный домен cMET может включать две или более полипептидных цепи, полученных из продукта трансляции MET. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен cMET может экспрессироваться в растворимой и/или не-мембранносвязанной форме, в которой отсутствует цитоплазматический и/или трансмембранный домен. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный домен cMET экспрессируют, выделяют и/или очищают как слитый белок. Например, внеклеточный домен cMET млекопитающего может быть сконструирован и экспрессирован в виде слитого белка, содержащего Fc-часть иммуноглобулина (например, cMET-Fc). В некоторых вариантах осуществления cMET и/или внеклеточный домен cMET содержит одну или несколько аминокислотных добавок, делеций или замен. Полипептид cMET может составлять по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% от полипептида cMET, описанного в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления полипептид cMET содержит часть (например, подпоследовательность) белка cMET. В некоторых вариантах осуществления часть cMET содержит внеклеточный домен cMET или его часть.

Связывающие агенты

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает или состоит из одного или нескольких полипептидов, или одного или нескольких белков, которые специфически связываются с cMET или его частью. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает или состоит из белка, который специфически связывается с cMET или его частью. Связывающий агент часто включает по меньшей мере одну антигенсвязывающую часть (т.е. связывающую часть). Антигенсвязывающая часть связывающего агента - это та часть, которая специфически связывается с антигеном. В некоторых вариантах осуществления связывающая часть связывающего агента включает или состоит из одного полипептида (например, одноцепочечного антитела). В некоторых вариантах осуществления связывающая часть связывающего агента включает или состоит из двух полипептидов. В некоторых вариантах осуществления связывающая часть связывающего агента содержит 2, 3, 4 или более полипептидов или состоит из них. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько структурных частей (например, каркасов, структурных полипептидов, константных областей и/или каркасных областей). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его связывающую часть прикрепляют к подложке (например, полимеру, неорганическому материалу, кремнию, грануле и т.п.).

Связывающий агент может включать одну антигенсвязывающую часть или несколько антигенсвязывающих частей. Например, связывающий агент, который содержит одну связывающую часть, иногда называют моновалентным. Связывающий агент, который содержит две связывающие части, иногда называют двухвалентным. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 или более связывающих частей. В некоторых вариантах осуществления все связывающие части поливалентного связывающего агента связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления все связывающие части поливалентного связывающего агента содержат одну или несколько полипептидных последовательностей, которые идентичны по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100%.

В некоторых вариантах осуществления две или более связывающих частей связывающего агента связываются с разными антигенами. Такие связывающие агенты иногда называют биспецифическими или полиспецифическими связывающими агентами (например, антителами). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает первую антигенсвязывающую часть, которая специфически связывает cMET или его часть, и вторую антигенсвязывающую часть, которая специфически связывает другой антиген (например, полипептид, который не является cMET, или его часть). Связывающий агент, который специфически связывает cMET, в некоторых вариантах осуществления ковалентно или нековалентно присоединен к другому связывающему агенту, который не связывается специфически с cMET или его частью. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывает cMET, включает второй связывающий агент, который специфически связывается с другим антигеном.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает антитело или его часть (например, его связывающую часть). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает подходящее антитело или антигенсвязывающую часть антитела, или состоит из него. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент представляет собой антитело (например, моноклональное антитело и/или рекомбинантное антитело). Связывающий агент или антитело можно создать, изготовить или получить подходящим способом. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент представляет собой моноклональное антитело, происходящее от подходящего вида. Некоторые неограничивающие примеры связывающего агента включают моноклональные антитела, химерные антитела, связывающие фрагменты антитела (например, антигенсвязывающую часть антитела), антитело с привитым CDR, гуманизированное антитело, человеческое антитело или их части. Человеческие антитела можно получить любым подходящим способом. Например, человеческие антитела можно получить от трансхромосомных животных, созданных для продуцирования полностью человеческих антител. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент не является поликлональным, не является поликлональным антителом, и термин «связывающий агент» не относится к поликлональным антителам.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент выделяют, продуцируют, изолируют и/или очищают из подходящих видов. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент выделяют, продуцируют, получают, изолируют и/или очищают, например, из кролика, козы, лошади, коровы, крысы, мыши, рыбы, птицы или ламы. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент выделяют, продуцируют, получают, изолируют и/или очищают от птицы (например, курицы или птичьего яйца). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент выделяют, продуцируют, получают, изолируют и/или очищают из растения (например, рекомбинантный связывающий агент, продуцируемый генетически модифицированным растением). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент выделяют, продуцируют, получают, изолируют и/или очищают из подходящего млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления подходящее млекопитающее представляет собой генетически измененное млекопитающее (например, трансхромосомное или трансгенное млекопитающее), созданное для продуцирования антител, содержащих тяжелые цепи человека и/или легкие цепи человека, или их части. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент продуцируют, получают, изолируют или очищают из прокариотической или эукариотической клетки (например, рекомбинантный связывающий агент, продуцируемый генно-инженерной клеткой). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент продуцируют, получают, изолируют или очищают из вируса (например, рекомбинантный связывающий агент, продуцируемый генно-инженерным вирусом). Связывающий агент может быть экспрессирован в подходящей системе экспрессии, изолирован и/или очищен из подходящей системы экспрессии, неограничивающие примеры которой включают подходящую систему экспрессии бактерий, фагов, насекомых, вирусов, растений или млекопитающих. Например, нуклеиновая кислота, кодирующая связывающий агент, может быть введена в подходящую линию клеток млекопитающих, которая экспрессирует и секретирует связывающий агент в среду для культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент не встречается в природе и не является натуральным. Например, в некоторых вариантах осуществления связывающий агент генерируют искусственно у животного путем введения эмульгированного коктейля, который включает чужеродный рекомбинантный антиген, мощный адъювант и часто минеральное масло и/или детергент, тем самым вызывая искусственный иммунный ответ на чужеродный рекомбинантный антиген (например, cMET, cMET-Fc).

В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело или моноклональный связывающий агент представляет собой по существу гомогенную популяцию связывающих агентов или их связывающих фрагментов, где каждый отдельный связывающий агент в популяции по существу идентичен и/или связывается с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов, которые могут возникнуть во время продукции моноклонального связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления такие варианты обычно отсутствуют или могут присутствовать в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают популяцию различных антител, направленных против разных детерминант (эпитопов), каждый связывающий агент из популяции моноклональных связывающих агентов часто связывается с одной антигенной детерминантой. Моноклональные связывающие агенты часто не загрязнены другими иммуноглобулинами. Один или несколько различных моноклональных связывающих агентов могут быть специально добавлены к композиции для образования смеси.

Определение «моноклональный» не должно толковаться как требующее получения связывающего агента каким-либо конкретным методом. Моноклональный связывающий агент можно получить любым подходящим способом. Например, в некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают гибридомным способом, описанным Kohler et al. (1975) Nature, 256: 495, или его вариациями. В некоторых вариантах осуществления моноклональный связывающий агент получают подходящим методом рекомбинантных ДНК. Например, моноклональные антитела можно получить или изменить с помощью способа или его разновидностей, описанных в патенте США № 5225539 и/или Daugherty et al. (1991) Nucleic Acids Research 19 (9): 2471-2476. Моноклональный связывающий агент можно получить, например, путем скрининга рекомбинантной библиотеки с использованием подходящей системы экспрессии (например, системы экспрессии фагового дисплея). В некоторых вариантах осуществления моноклональный связывающий агент выделяют из фаговой библиотеки связывающих агентов, например, с использованием методики, описанной у Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 и/или Marks et al. (1991) J. Mol Biol, 222: 581-597, или с их разновидностями.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает одну или несколько структурных или основных частей, иногда называемых каркасами. Связывающий агент может включать каркас, неограничивающие примеры которого включают каркас, полученный из антитела, Z-домена белка A, гамма-B кристаллина, убиквитина, цистатина, Sac7d, тройной суперспирали, липокалина, мотива с анкириновым повтором, домена SH3 Fyn, домена Кунитца подходящего ингибитора протеазы, домена фибронектина, полимера на основе нуклеиновой кислоты и т.п., их частей или их комбинаций. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент не содержит каркаса. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает одну или несколько структурных частей антитела млекопитающего.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает одну или несколько константных областей (например, константные области, полученные из антитела, например, антитела млекопитающего). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает константную область легкой цепи антитела и/или константную область тяжелой цепи антитела. В антителе млекопитающего существует по меньшей мере два типа легких цепей иммуноглобулина, которые называются лямбда (λ) и каппа (κ). Связывающий агент может включать любую подходящую константную область антитела, или одну или несколько его частей. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит константную область легкой цепи лямбда или ее часть. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит константную область легкой цепи каппа или ее часть. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает полипептид, который по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичен полипептидной последовательности константной области, или ее части легкой цепи антитела млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает полипептид, который по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентичен полипептидной последовательности константной области легкой цепи человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент не включает константную область легкой цепи.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит константную область тяжелой цепи антитела. У млекопитающих антитело может иметь по меньшей мере пять типов/классов тяжелых цепей Ig, обозначенных как IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, которые определяются наличием отдельных константных областей тяжелой цепи или их части (например, CH1, CL, CH2, CH3 доменов). Связывающий агент может включать любую подходящую константную область тяжелой цепи или ее часть. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4, или одну или несколько их частей. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько константных областей тяжелой цепи изотипа IgM, IgD, IgA или IgE, или их часть.

Если здесь не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в константной области антитела осуществляется в соответствии с системой нумерации ЕС, как описано у Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает полипептид, который по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичен полипептидной последовательности константной области или ее части, из тяжелой цепи антитела млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит полипептид, который по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% идентичен, или на 100% идентичен полипептидной последовательности константной области тяжелой цепи человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает одно или несколько добавлений, делеций и/или модификаций константной области. Связывающий агент иногда модифицируют для изменения класса антител или изотипа связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает одно или несколько добавлений, делеций и/или модификаций константной области. Связывающий агент иногда модифицируют для изменения класса антител или изотипа связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает одно или несколько добавлений, делеций и/или модификаций (одну или несколько аминокислотных замен, делеций или добавлений) для модификации одной или нескольких функций связывающего агента, например, для отмены, увеличения или уменьшения полужизни в сыворотке крови, связывания с рецептором Fc, связывания комплемента (например, связывания C1q), гликозилирования, сиалирования, клеточной токсичности, антителозависимого клеточно-опосредованного фагоцитоза (АЗКФ), антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ), и тому подобного. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент не включает одну или несколько частей константной области тяжелой цепи или константной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент не включает константную область тяжелой цепи.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит или состоит из одной или нескольких вариабельных областей антитела, или их части. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько вариабельных областей легкой цепи, или их часть. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько вариабельных областей тяжелой цепи, или их часть. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи. Вариабельная область легкой цепи и вариабельная область тяжелой цепи могут находиться на одном или разных полипептидах. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая часть связывающего агента состоит из одной или нескольких вариабельных областей тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая часть связывающего агента состоит из одной или нескольких вариабельных областей легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая часть связывающего агента состоит из одной или нескольких вариабельных областей легкой цепи и одной или нескольких вариабельных областей тяжелой цепи.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит или состоит из Fab, Fab', F(ab')₂, Fv фрагмента, одноцепочечного Fv (scFv), диатела (Dab), синтела и т.п., и/или их комбинации или части. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент представляет собой Fab, Fab', F(ab')₂, Fv фрагмент, одноцепочечный Fv (scFv), диатело (Dab), синтело и т.п. и/или их комбинацию, или их часть (см., например, патенты США №№ 6099842 и 5990296). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает одноцепочечный полипептид, содержащий одну или несколько антигенсвязывающих частей. Например, одноцепочечный связывающий агент может быть сконструирован путем соединения вариабельной области тяжелой цепи или ее антигенсвязывающей части с вариабельной областью легкой цепи или ее антигенсвязывающей частью линкером (например, аминокислотным, полипептидным линкером) с использованием процессов рекомбинантной молекулярной биологии. Такие одноцепочечные связывающие агенты часто проявляют специфичность и аффинность к антигену, подобную исходному двухцепочечному моноклональному связывающему агенту. Связывающие агенты часто содержат сконструированные области, такие как участки с привитыми CDR или гуманизированные участки. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент представляет собой интактный двухцепочечный иммуноглобулин, а в других вариантах осуществления связывающий агент представляет собой мономер Fab или димер Fab.

Нуклеиновые кислоты или их части, которые кодируют полипептид связывающего агента, могут быть клонированы, субклонированы, перегруппированы или модифицированы для рекомбинантной экспрессии подходящей процедурой клонирования и впоследствии экспрессированы с использованием подходящей системы экспрессии способом, известным специалистам в данной области техники (см., например, Maniatis et al. (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Methods in molecular biology, edited by Benny K. C. Lo, Springer Science & Business Media, 2004; Antibody Engineering, Vol. 1, Roland E. Kontermann, Stefan Dübel, Edition 2, Publisher Springer Science & Business Media, 2010; Antibody Phage Display: Methods and Protocols, Biomed Protocols, Vol. 178 of Methods in molecular biology, Editors Philippa M. O'Brien, Robert Aitken, Springer Science & Business Media, 2004).

У млекопитающих вариабельная область тяжелой цепи и вариабельная область легкой цепи антитела вносят вклад в три CDR (гипервариабельные области), обычно обозначаемые как CDR1, CDR2 и CDR3, которые разделены и/или фланкированы каркасными областями (например, FR1, FR2, FR3 и FR4). Термин «CDR» в контексте настоящего описания относится к аминокислотной последовательности полипептида, идентифицированной как гипервариабельная область. В некоторых вариантах осуществления окончательное определение последовательности полипептида CDR и идентификация остатков, составляющих сайт связывания связывающего агента, осуществляют путем решения структуры связывающего агента и/или решения структуры комплекса связывающий агент-антиген. В некоторых вариантах осуществления это может быть выполнено любым подходящим способом, таким как рентгеновская кристаллография и/или компьютерное моделирование. В некоторых вариантах осуществления можно использовать различные методы анализа для идентификации или аппроксимации последовательностей CDR связывающего агента или антитела. Например, аминокислотная последовательность и/или расположение CDR в полипептидной последовательности связывающего агента, антитела, его связывающей части или его вариабельной области могут быть идентифицированы с использованием подходящего способа, неограничивающие примеры которого включают систему Kabat (например, см. Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication No. 91-3242, а также Johnson, G. and Wu, TT (2000) Nucleic Acids Research 28 (1): 214-8 и/или схему нумерации Chothia (например, Chothia & Lesk, (1987) J. Mol. Biol, 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878- 883, а Al-Lazikani et al. (1997) JMB 273,927-948). В некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность и/или расположение CDR антитела можно идентифицировать с использованием метода AbM и/или контактного метода. В определении «AbM» используется интегрированный набор компьютерных программ, производимых Oxford Molecular Group, которые моделируют структуру антител (см., например, Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:9268-9272; «AbM™, A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies», Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd.). Определение AbM моделирует третичную структуру антитела из первичной последовательности с использованием комбинации баз данных знаний и методов с нуля, таких как описанные Samudrala et al. (1999) Proteins, Structure, Function and Genetics, Suppl, 3: 194-198 и Xia Y, et al. (2000) J Mol Biol. 300 (1): 171-85. В некоторых вариантах осуществления определение контакта основано на анализе доступных сложных кристаллических структур (см., например, MacCallum et al. (1996) J. Mol. Biol 5: 732-45).

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент и/или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5 или по меньшей мере 6 CDR. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит от 3 до 60 CDR (например, для связывающих агентов, имеющих несколько антигенсвязывающих частей). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит от 3 до 12 CDR. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит от 1 до 6 полипептидных последовательностей CDR.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент и/или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит одну, две или три CDR вариабельной области легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи связывающего агента содержит одну или несколько CDR (например, одну, две, три или несколько CDR). Аминокислотные последовательности, представляющие CDR в вариабельной области легкой цепи антитела или связывающего агента, обозначаются как CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, которые пронумерованы последовательно (т.е. L1, L2 и L3) в направлении от аминоконца (N-конец) к карбокси-концу (C-концу) вариабельной области легкой цепи. Например, в полипептиде, представляющем вариабельную область легкой цепи связывающего агента, CDR-L1, если она присутствует, представляет собой наиболее близкую к N-концу CDR легкой цепи; CDR-L3, если она присутствует, представляет собой CDR, наиболее близкую к С-концу легкой цепи, а CDR-L2, если присутствует, расположена (i) между CDR-L1 и CDR-L3, (ii) на N-концевой стороне CDR-L3 или (iii) на C-концевой стороне CDR-L1 вариабельной области легкой цепи или связывающей части связывающего агента. Термины «CDR-L1», «CDR-L2» и «CDR-L3» частично относятся к аминокислотной последовательности полипептида, идентифицированного или описанного в настоящей заявке как гипервариабельная область связывающего агента (например, CDR вариабельной области легкой цепи). Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3 представлены в таблицах 1-3, соответственно. Вариабельная область легкой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, может включать любую комбинацию CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, раскрытых в данном документе, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET, или их часть. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит CDR одной легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L3, выбранной из таблицы 3.

В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L3, выбранной из таблицы 3, и любые другие подходящие полипептидные последовательности CDR-L2 и/или CDR-L1, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET, или его частью. В некоторых вариантах осуществления CDR легкой цепи вариабельной области легкой цепи или антигенсвязывающей части связывающего агента состоят из CDR-L3 и CDR-L2, где CDR-L3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L3, выбранной из таблицы 3, а CDR-L2 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L2, выбранной из таблицы 2. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L3, выбранной из таблицы 3, и аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L2, выбранной из таблицы 2, и любую другую подходящую полипептидную последовательность CDR-L1, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET или его частью. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит три CDR легкой цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 70% идентичной CDR-L3, выбранной из таблицы 3, аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 70% идентичной CDR-L2, выбранной из таблицы 2, и аминокислотной последовательности по меньшей мере на 70% идентичной CDR-L1, выбранной из таблицы 1. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область легкой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L3, выбранной из таблицы 3, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L2, выбранной из таблицы 2, и аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-L1, выбранной из таблицы 1, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET, или его частью.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько CDR легкой цепи, которые по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичны любой из последовательностей CDR, перечисленных в таблицах 1, 2 или 3. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L1, по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичную любой из последовательностей, показанных в таблице 1. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L1 из любой последовательности, показанной в таблице 1.

Таблица 1. Последовательности CDR-L1

Названия клонов, указанные в таблицах 1-10, указывают номер гибрида (F), номер планшета (P) и номер лунки (от A1 до H12) 96-луночного планшета, из которого был получен клон. Соответственно, клон F6AP12F12 был получен, например, из Гибрида 6A, планшета 12, лунки F12. Номера гибрида каждого клона соответствуют гибридам, указанным на фиг. 2.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит CDR-L2, по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичную любой из последовательностей, показанных в таблице 2. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L2 любой из последовательностей, показанных в таблице 2.

Таблица 2. Последовательности CDR-L2

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит CDR-L3, по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичную любой из последовательностей, показанных в таблице 3. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L3 любой из последовательностей, показанных в таблице 3.

Таблица 3. Последовательности CDR-L3

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит вариабельную область легкой цепи, по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичную аминокислотной последовательности из таблицы 4. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит последовательность вариабельной области легкой цепи из таблицы 4.

Таблица 4. Последовательности вариабельной области легкой цепи

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит вариабельную область гуманизированной легкой цепи, имеющую по меньшей мере 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичность последовательности, указанной в таблице 5. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит последовательность вариабельной области гуманизированной легкой цепи из таблицы 5.

Таблица 5. Гуманизированные легкие цепи P3D12

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент и/или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит одну, две или три CDR вариабельной области тяжелой цепи. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи содержит одну или несколько CDR (например, одну, две, три или несколько CDR). Аминокислотные последовательности, представляющие CDR в вариабельной области тяжелой цепи антитела или связывающего агента, обозначаются как CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, которые пронумерованы последовательно (т.е. H1, H2 и H3) в направлении от аминоконца (N-конца) к карбокси-концу (C-концу) вариабельной области тяжелой цепи. Например, в полипептиде, представляющем вариабельную область тяжелой цепи связывающего агента, CDR-H1, если она присутствует, представляет собой наиболее близкую к N-концу CDR; CDR-H3, если она присутствует, представляет собой наиболее близкую к C-концу CDR, а CDR-H2, если присутствует, расположена (i) между CDR-H1 и CDR-H3, (ii) на N-концевой стороне CDR-H3 или (iii) на C-концевой стороне CDR-H вариабельной области тяжелой цепи. Термины «CDR-H1», «CDR-H2» и «CDR-H3» частично относятся к аминокислотной последовательности полипептида, идентифицированного или описанного в данном документе как гипервариабельная область связывающего агента (например, CDR вариабельной области тяжелой цепи связывающего агента). Неограничивающие примеры аминокислотных последовательностей CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3 представлены в таблицах 6-8, соответственно. Вариабельная область тяжелой цепи или антигенсвязывающей части описанного в настоящей заявке связывающего агента может включать любую комбинацию CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, раскрытых в настоящей заявке, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET, или его частью. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит CDR одной тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 70% идентичной CDR-H3, выбранной из таблицы 8. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H3, выбранной из таблицы 8, и любую другую подходящую полипептидную последовательность CDR-H2 и/или CDR-H1, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET или его частью. В некоторых вариантах осуществления CDR тяжелой цепи вариабельной области тяжелой цепи или антигенсвязывающей части связывающего агента состоит из CDR-H3 и CDR-H2, где CDR-H3 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H3, выбранной из таблицы 8, а CDR-H2 содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H2, выбранной из таблицы 7. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанная в настоящей заявке, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H3, выбранной из таблицы 8, и аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H2, выбранной из таблицы 7, и любую другую подходящую последовательность полипептида CDR-H1, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET или его частью. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанного в настоящей заявке, содержит три CDR тяжелой цепи, состоящие из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 70% идентичной CDR-H3, выбранной из таблицы 8, аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 70% идентичной CDR-H2, выбранной из таблицы 7, и аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 70% идентичной CDR-H1, выбранной из таблицы 6. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область тяжелой цепи или антигенсвязывающая часть связывающего агента, описанная в настоящей заявке, содержит аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H3, выбранной из таблицы 8, аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H2, выбранной из таблицы 7, и аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70% идентичную CDR-H1, выбранной из таблицы 6, где связывающий агент сохраняет специфическое связывание с cMET или его частью.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько CDR тяжелой цепи по меньшей мере с 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичности с любой из CDR из Таблиц 6, 7 или 8. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-H1, по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичную любой из последовательностей, показанных в таблице 6. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит CDR-H1 любой из последовательностей, представленных в Таблице 6.

Таблица 6. Последовательности CDR-H1

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит CDR-H2, по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичную любой из последовательностей, показанных в таблице 7. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-H2 любой из последовательностей, показанных в таблице 7.

Таблица 7. Последовательности CDR-H2

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит CDR-H3, по меньшей мере на 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере на 99% идентичную любой из последовательностей, показанных в таблице 8. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-H3 любой из последовательностей, показанных в таблице 8.

Таблица 8. Последовательности CDR-H3

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью, указанной в таблице 9. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи из таблицы 9.

Таблица 9. Последовательности вариабельной области тяжелой цепи

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает вариабельную область гуманизированной тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 70%, 75%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или по меньшей мере 99% идентичности с последовательностью, указанной в таблице 10. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит последовательность вариабельной области гуманизированной тяжелой цепи из таблицы 10.

Таблица 10. Гуманизированные тяжелые цепи P3D12

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 26-36 (например, последовательности CDR-L3, выбранной из таблицы 3), и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичной любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 79-93 (например, последовательность CDR-H3, выбранную из таблицы 8). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или 35, и CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 87, 88, 92 или 93.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 26-36 (например, последовательности CDR-L3, выбранной из таблицы 3), CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16-25 (например, последовательности CDR-L2, выбранной из таблицы 2); CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 79-93 (например, последовательности CDR-H3, выбранной из таблицы 8), и CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 62-78 (например, последовательности CDR-H2, выбранной из таблицы 7). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или 35; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 или 25; CDR-H3, содержащую аминокислоту последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 87, 88, 92 или 93, а CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 70, 71 или 78.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100%, идентичную любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 26-36 (например, последовательности CDR-L3, выбранной из таблицы 3); CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16-25 (например, последовательности CDR-L2, выбранной из таблицы 2); CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15 (например, последовательности CDR-L1, выбранной из таблицы 1); CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 79-93 (например, последовательности CDR-H3, выбранной из таблицы 8); CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90%, или на 100% идентичную любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 62-78 (например, последовательности CDR-H2, выбранной из таблицы 7), а CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 50-61 (например, последовательности CDR-H1, выбранной из таблицы 6). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит CDR-L3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 34 или 35; CDR-L2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24 или 25; CDR-L1, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9, 10 или 15; CDR-H3, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90%, или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 87 или 88; CDR-H2, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO : 70, 71 или 78, а CDR-H1, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 90% или на 100% идентичную аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58 или 59.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 94-108 (например, вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из таблиц 9 и 10), а вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 86%, по меньшей мере на 87%, по меньшей мере на 88%, по меньшей мере на 89%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 91%, по меньшей мере на 92%, по меньшей мере на 93%, по меньшей мере на 94%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37- 49 (например, вариабельной области легкой цепи, выбранной из таблиц 4 и 5). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 104-108 (например, вариабельной области тяжелой цепи, выбранной из таблицы 10), и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную любой одной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 45-49 (например, вариабельной области легкой цепи, выбранной из таблицы 5).

Аббревиатуры «abb», «sdr», «fra», «ven» и «cdr», используемые в настоящей заявке, поясняются ниже. Аббревиатура «cdr» или «CDR» относится к гипервариабельной области. Аббревиатура «abb» относится к сокращенной CDR, например, как описано у Padlan et al. (1995) FASEB J 9: 133-139. В некоторых вариантах осуществления сокращенные CDR представляют собой остатки 27D-34, 50-55 и 89-96 в легкой цепи и 31-35B, 50-58 и 95-101 в тяжелой цепи, которые трансплантированы на соответствующий человеческий каркас. Критические остатки каркаса часто сохраняются. Аббревиатура «sdr» относится к «остаткам, определяющим специфичность», например, как описано в Padlan et al. (1995), которые, как полагают, участвуют в связывании антигена. Аббревиатура «fra» относится к «подходу Франкенштейна», например, как описано в Wu and Kabat (1992) Mol Immunol 29: 1141-1146. Аббревиатура «ven» относится к рекомбинации поверхностных остатков, например, как описано у Padlan (1991), Mol Immunol 28: 489-498.

Термин «процент идентичности» или «процентная идентичность» относится к идентичности двух аминокислотных последовательностей. Идентичность может быть определена путем сравнения положения в каждой последовательности, которая может быть выровнена для целей сравнения. Когда эквивалентное положение в сравниваемых последовательностях занято одной и той же аминокислотой, тогда молекулы идентичны в этом положении. Когда эквивалентное положение занято таким же или подобным аминокислотным остатком (например, подобным по стерической и/или электронной природе), тогда молекулы могут называться гомологичными (подобными) в этом положении. Выражение в виде процента гомологии, сходства или идентичности относится к функции числа идентичных или подобных аминокислот в положениях, общих для сравниваемых последовательностей. Выражение в виде процента гомологии, сходства или идентичности относится к функции числа идентичных или подобных аминокислот в положениях, общих для сравниваемых последовательностей. Могут использоваться различные алгоритмы и/или программы выравнивания, включая FASTA, BLAST или ENTREZ. FASTA и BLAST доступны как часть пакета анализа последовательности GCG (Университет Висконсина, Мэдисон, Висконсин) и могут использоваться, например, с настройками по умолчанию. Программа ENTREZ доступна через Национальный центр биотехнологической информации, Национальную медицинскую библиотеку, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд. В одном варианте осуществления процент идентичности двух последовательностей может быть определен программой GCG со штрафом за открытие гэпа 1, например, каждый аминокислотный гэп оценивается так, как если бы это было единственное несоответствие аминокислоты или нуклеотида между двумя последовательностями.

Другие методики выравнивания описаны в Methods in Enzymology, Vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., San Diego, Calif., USA. В некоторых вариантах осуществления программа выравнивания, которая допускает гэпы в последовательности, используется для выравнивания последовательностей. Алгоритм Смита-Уотермана - это один из типов алгоритмов, который разрешает гэпы в выравнивании последовательностей. См. Meth. Mol. Biol. 70:173-187 (1997). Кроме того, для выравнивания последовательностей можно применять программу GAP, использующую метод выравнивания Нидлмана и Вунша. Альтернативная стратегия поиска использует программное обеспечение MPSRCH, которое работает на компьютере MASPAR. MPSRCH использует алгоритм Смита-Уотермана для оценки последовательностей на компьютере с массовым параллелизмом. Этот подход улучшает способность определять отдаленно связанные совпадения и особенно устойчив к небольшим гэпам и ошибкам нуклеотидной последовательности. Аминокислотные последовательности, кодируемые нуклеиновыми кислотами, можно использовать для поиска в базах данных как белков, так и ДНК.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит одну или несколько CDR, выбранных из вариабельной области легкой цепи из таблиц 4 и 5. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит одну или более CDR, выбранных из вариабельной области тяжелой цепи из таблиц 9 и 10. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит одну или несколько CDR, выбранных из вариабельной области легкой цепи из таблиц 4 и 5, и одну или более CDR, выбранных из вариабельной области тяжелой цепи из таблиц 9 и 10. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента включает CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, каждая из которых выбрана из любой из вариабельных областей легкой цепи из таблиц 4 и 5, а также CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, каждая из которых выбрана из любой из вариабельных областей тяжелой цепи из таблиц 9 и 10. Аминокислотная последовательность CDR (например, CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3, CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3) может быть идентифицирована в вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи, раскрытой в настоящей заявке, любым подходящим способом, описанным в данном документе или известным специалистам в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывается с cMET, включает (i) CDR-L1, CDR-L2 и CDR-L3, которые представляют собой полипептидные последовательности гипервариабельной области легкой цепи (CDR-L), где CDR-L1 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1-15, CDR-L2 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 16-25, а CDR-L3 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 26-36, а (ii) CDR-H1, CDR-H2 и CDR-H3, которые представляют собой полипептидные последовательности гипервариабельной области тяжелой цепи (CDR-H), где CDR-H1 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 50-61, CDR-H2 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 62-78, а CDR-H3 выбрана из аминокислотных последовательностей SEQ ID NО: 79-93.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько подходящих последовательностей, выбранных из таблиц 1-10, где выбранная полипептидная последовательность содержит от 0 до 5, от 1 до 5, от 0 до 10, от 1 до 10, от 0 до 15 или от 1 до 15 аминокислотных модификаций, где аминокислотная модификация может представлять собой добавление аминокислоты, делецию аминокислоты и/или замену аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит одну или несколько подходящих последовательностей, выбранных из таблиц 4, 5, 9 или 10, где выбранная полипептидная последовательность включает от 0 до 5, от 1 до 5, от 0 до 10, от 1 до 10, от 0 до 15, или от 1 до 15 аминокислотных модификаций в каркасных областях или константной области, где аминокислотная модификация может представлять собой добавление аминокислоты, делецию аминокислоты и/или замену аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная модификация представляет собой консервативную аминокислотную замену. В некоторых вариантах осуществления описанный здесь связывающий агент включает один или несколько аналогов аминокислот, ненативных аминокислот или производных аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или антигенсвязывающая часть связывающего агента содержит одну или несколько каркасных областей (FR). Каркасные области часто расположены между CDR и/или фланкирующими последовательностями CDR вариабельной области тяжелой или легкой цепи антитела или связывающего агента. У млекопитающих вариабельная область тяжелой цепи часто включает четыре каркасных области, а вариабельная область легкой цепи часто включает четыре каркасных области. Любой подходящий метод можно использовать для идентификации одной или нескольких каркасных областей в антителе, в вариабельной области антитела или в связывающем агенте. Связывающий агент может включать синтетические или натуральные каркасные области, которые немодифицированы или модифицированы (например, оптимизированы), как обсуждается ниже.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть является химерным, привитым и/или гуманизированным. Химерные, привитые и/или гуманизированные связывающие агенты часто содержат модифицированные или замещенные константные области и/или каркасные области, сохраняя при этом специфичность связывания с cMET или его частью. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть содержит константные области, каркасные области или их части, полученные из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть включает полностью синтетические части, одну или несколько аминокислот или аминокислотных последовательностей, которые не обнаруживаются в молекулах нативных антител.

Натуральные каркасные области или их части могут быть получены из любых подходящих видов. В некоторых вариантах осуществления гипервариабельные области (CDR) вариабельных областей легкой и тяжелой цепей связывающего агента или его антигенсвязывающей части прививают в каркасные области того же или другого вида. Например, одна или несколько каркасных областей связывающего агента могут происходить из вида грызунов (например, мыши или крысы) или вида приматов (например, человека).

В некоторых вариантах осуществления CDR вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи связывающего агента или его антигенсвязывающей части могут быть привиты к консенсусным каркасным областям человека. Для создания консенсусных каркасных областей человека в некоторых вариантах осуществления каркасные области из нескольких аминокислотных последовательностей тяжелой или легкой цепи человека могут быть выровнены для идентификации консенсусной последовательности. В некоторых вариантах осуществления каркасные области тяжелой цепи или легкой цепи антитела или связывающего агента заменены одной или несколькими каркасными областями или их частями из другой вариабельной области тяжелой цепи или легкой цепи. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть содержит одну или несколько каркасных областей человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 человеческих каркасных областей. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть содержит одну или несколько каркасных областей мыши. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть содержит по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 каркасных областей мыши. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент или его антигенсвязывающая часть содержит одну или несколько каркасных областей человека и одну или несколько каркасных областей мыши.

Способы создания химерных, гуманизированных и/или оптимизированных антител или связывающих агентов, например, путем модификации, замены или удаления каркасных областей или их частей, известны. Неограничивающие примеры прививки CDR описаны, например, в патенте США № 6180370; патенте США № 6054297; патенте США № 5693762; патенте США № 5859205; патенте США № 5693761; патенте США № 5565332; патенте США № 5585089; в патенте США № 5530101, а в Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536 и Winter (1998) FEBS Letts. 430: 92-94. Дополнительные неограничивающие примеры получения химерных, привитых и/или гуманизированных связывающих агентов включают патент США № 5530101; патент США № 5707622; патент США № 5994524; патент США № 6245894; Queen et al. (1988) PNAS 86: 10029-10033; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; Antibody Engineering: Methods and Protocols, Vol. 248 of Methods in molecular biology, edited by Benny K. C. Lo, Springer Science & Business Media, (2004); and Antibody Engineering, Vol. 1, Roland E. Kontermann, Stefan Dübel, Edition 2, Publisher Springer Science & Business Media, (2010). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент может быть гуманизирован путем замены одной или нескольких каркасных областей или их частей (например, одной или нескольких аминокислот) на одну или несколько каркасных областей или их частей из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело или связывающий агент можно гуманизировать или привить путем переноса одной или нескольких CDR (например, 1, 2, 3, 4, 5 или всех 6 CDR) от донорского связывающего агента (например, мышиного моноклонального антитела) к акцепторному связывающему агенту (например, человеческому антителу), при сохранении специфичности связывания донорского связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления процесс получения химерного, привитого или гуманизированного связывающего агента включает выполнение одной или нескольких аминокислотных замен, добавлений или делеций в константной области или каркасной области связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления для получения гуманизированных связывающих агентов можно использовать такие методы, как «реконструкция», «гиперхимеризация» или «рекомбинация/маскировка поверхностных остатков» (например, см. Vaswami et al. (1998) Annals of Allergy, Asthma, & Immunol. 81: 105; Roguska et al. (1996) Prot. Engin. 9: 895-904, а патент США № 6072035). В некоторых аспектах связывающий агент модифицируют способом, описанным выше, или другим подходящим способом для снижения иммуногенности (например, см. Gilliland et al. (1999) J. Immunol. 62 (6): 3663-71).

В некоторых вариантах осуществления аминокислотную последовательность связывающего агента модифицируют для оптимизации аффинности связывания с мишенью (например, cMET), межвидовой перекрестной реактивности, растворимости и/или функции (например, агонистической активности или ее отсутствия). В некоторых вариантах осуществления конкретная комбинация CDR, раскрытых в настоящей заявке, может быть оптимизирована для связывания с cMET и/или для оптимизации функции или характеристики связывающего агента, раскрытого в настоящей заявке. Например, описанная в настоящей заявке охарактеризованная вариабельная область легкой цепи (например, вариабельная область легкой цепи SEQ ID NO: 48) может быть совместно экспрессирована с использованием подходящей системы экспрессии, с библиотекой вариабельных областей тяжелой цепи, содержащей CDR-H1 и CDR-H2 охарактеризованной вариабельной области тяжелой цепи (например, вариабельной области тяжелой цепи SEQ ID NO: 107), где CDR-H3 заменена библиотекой последовательностей CDR-H3, которая может включать одну или несколько областей, например, области CDR-H3 из таблицы 8. Полученные в результате связывающие агенты легкой цепи/тяжелой цепи можно подвергнуть скринингу на связывание с cMET и/или на конкретную функцию. Оптимизированные связывающие агенты могут быть идентифицированы, и аминокислотная последовательность CDR-H3 может быть идентифицирована подходящим способом. Вышеупомянутый метод скрининга можно использовать для идентификации связывающих агентов, содержащих специфические комбинации CDR или специфические оптимизированные последовательности CDR (например, последовательности CDR, содержащие аминокислотные замены, добавления или делеции), которые обеспечивают связывающий агент с улучшенной специфичностью связывания, аффинностью связывания и/или функцией. Такие методы скрининга и оптимизации связывающих агентов известны (например, см. Portolano et al. (1993) Journal of Immunology 150: 880-887, а Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628). В таких ссылках описаны способы получения антител, которые связываются со специфическим антигеном, с использованием известных вариабельных легких цепей, известных вариабельных тяжелых цепей или их частей (например, их CDR) путем скрининга библиотеки комплементарных вариабельных областей.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент модифицируют для устранения или добавления сайтов гликозилирования для оптимизации аффинности и/или функции связывающего агента (например, см. Co et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 1361-1367). В некоторых вариантах осуществления количество и/или тип сайтов гликозилирования в связывающем агенте модифицируют или изменяют. N-связанный сайт гликозилирования часто характеризуется последовательностью Asn-X-Ser или Asn-X-Thr, где аминокислотный остаток, обозначенный как X, может быть любым аминокислотным остатком, кроме пролина. Замена аминокислотных остатков для создания этой последовательности обеспечивает потенциальный новый сайт для добавления N-связанной углеводной цепи. Альтернативно, замены, которые устраняют эту последовательность, удаляют существующую N-связанную углеводную цепь. В некоторых вариантах осуществления также предусмотрена перегруппировка N-связанных углеводных цепей, при которой один или несколько N-связанных сайтов гликозилирования (обычно те, которые являются натуральными) удаляют и создают один или несколько новых N-связанных сайтов. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент модифицирован путем удаления одного или нескольких остатков цистеина, или замены одного или нескольких остатков цистеина на другую аминокислоту (например, серин) по сравнению с немодифицированным связывающим агентом. В некоторых вариантах осуществления варианты цистеина могут быть полезны для оптимизации экспрессии, секреции и/или растворимости.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент модифицирован для включения определенных аминокислотных добавлений, замен или делеций, разработанных или предназначенных, например, для снижения чувствительности связывающего агента к протеолизу, уменьшения чувствительности связывающего агента к окислению, увеличения периода полужизни в сыворотке и/или получения или изменения других физико-химических, фармакокинетических или функциональных свойств связывающего агента.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с cMET млекопитающего или его частью. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с внеклеточным доменом или внеклеточными областями cMET млекопитающего или их частью. В некоторых аспектах связывающий агент специфически связывается с cMET дикого типа, продуцируемым клеткой неизмененного (генетически не модифицированного) млекопитающего, встречающегося в природе. В некоторых аспектах связывающий агент специфически связывается с встречающимся в природе вариантом cMET. В некоторых аспектах связывающий агент специфически связывается с cMET, содержащим одну или несколько аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с cMET, продуцируемым и/или экспрессируемым на поверхности клетки человека, не являющихся человеком приматов, собак, кошек или грызунов (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с одним или несколькими полипептидами cMET или их частью, имеющей аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO: 109-113. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с человеческим cMET. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с внеклеточным доменом cMET человека. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с человеческим cMET и/или его внеклеточным доменом, где человеческий cMET содержит замену E168 на D168 (т.е. вариантом cMET E168D). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с человеческим cMET и/или его внеклеточным доменом, где человеческий cMET содержит замену N375 на S375 (т.е. вариантом N375S человеческого cMET).

Термин «специфически связывает» относится к связывающему агенту, который связывает целевой пептид, и не связывает другие молекулы или другие пептиды, как определено, например, подходящим анализом in vitro (например, ИФА, иммуноблоттингом, проточной цитометрией, и т.д.). Специфическое связывающее взаимодействие усилено по сравнению с неспецифическим связывающим взаимодействием примерно в 2 раза или более, часто примерно в 10 раз или более, а иногда примерно в 100 раз или более, в 1000 раз или более, в 10 000 раз или более, в 100000 раз или более, или в 1 000 000 раз или более.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывается с cMET или его частью, представляет собой связывающий агент, который связывает cMET или его часть (например, внеклеточный домен cMET), с константой аффинности связывания (KD), равной или менее 100 нМ, равной или менее 50 нМ, равной или менее 25 нМ, равной или менее 10 нМ, равной или менее 5 нМ, равной или менее 1 нМ, равной или менее 900 пМ, равной или менее 800 пМ, равной или менее 750 пМ, равной или менее 700 пМ, равной или менее 600 пМ, равной или менее 500 пМ, равной или менее 400 пМ, равной или менее 300 пМ, равной или менее 200 пМ, или равной или менее 100 пМ. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывается с cMET или его частью, представляет собой связывающий агент, который связывает человеческий cMET или его часть (например, внеклеточный домен человеческого cMET) с константой аффинности связывания (KD), равной или менее 100 нМ, равной или менее 50 нМ, равной или менее 25 нМ, равной или менее 10 нМ, равной или менее 5 нМ, равной или менее 1 нМ, равной или менее 900 пМ, равной или менее 800 пМ, равной или менее 750 пМ, равной или менее 700 пМ, равной или менее 600 пМ, равной или менее 500 пМ, равной или менее 400 пМ, равной или менее 300 пМ, равной или менее 200 пМ, или равной или менее 100 пМ. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, который специфически связывается с cMET или его частью, представляет собой связывающий агент, который специфически связывается с cMET или его частью, полученными от не относящихся к человеку видов (например, приматов, не являющихся людьми, или грызунов, например, мыши или крысы) с константой аффинности связывания (KD), равной или менее 100 нМ, равной или менее 50 нМ, равной или менее 25 нМ, равной или менее 10 нМ, равной или менее 5 нМ, равной или менее 1 нМ, равной или менее 900 пМ, равной или менее 800 пМ, равной или менее 750 пМ, равной или менее 700 пМ, равной или менее 600 пМ, равной или менее 500 пМ, равной или менее 400 пМ, равной или менее 300 пМ, равной или менее 200 пМ, или равной или менее 100 пМ. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, раскрытый в настоящей заявке, специфически связывает человеческий cMET или его часть и специфически связывается с cMET или его частью, полученной от приматов, не являющихся человеком. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент, описанный в настоящей заявке, специфически связывает человеческий cMET или его часть и специфически связывается с cMET или его частью, полученной от грызуна (например, мыши или крысы). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент (i) специфически связывается с человеческим cMET или его частью (например, внеклеточным доменом человеческого cMET) с KD 10 нМ или менее, или 1 нМ или менее, а (ii) специфически связывает cMET крысы или мыши или их часть (например, внеклеточный домен cMET крысы или мыши) с KD 100 нМ или менее, 90 нМ или менее, 80 нМ или менее, 70 нМ или менее, 60 нМ или менее, 50 нМ или менее, 40 нМ или менее, 30 нМ или менее, 20 нМ или менее или 10 нМ или менее.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент имеет одну или несколько функциональных характеристик. Соответственно, связывающий агент можно описать структурно и функционально (например, тем, что он делает, или тем, что он способен делать). Раскрытые в настоящей заявке связывающие агенты могут специфически связываться с внеклеточной частью cMET, например, внеклеточной частью cMET, присутствующей на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления клетка представляет собой раковую клетку человека или неопластическую клетку человека, экспрессирующую cMET. В некоторых вариантах осуществления связывающие агенты, раскрытые в настоящей заявке, при связывании cMET на поверхности клетки индуцируют интернализацию cMET. Способность связывающего cMET агента индуцировать интернализацию и/или деградацию cMET обеспечивает преимущество перед другими связывающими cMET агентами, у которых эта способность отсутствует. Конъюгат cMET-связывающего агента и лекарственного средства, который индуцирует интернализацию и/или деградацию cMET после связывания, обеспечивает локализованную внутриклеточную доставку цитотоксического лекарственного средства. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства сконструирован для высвобождения пирролобензодиазепинового токсина из связывающего агента только после интернализации, например, посредством сайта расщепления лизосомным ферментом, интегрированного в связывающую группу. Соответственно, описанные в настоящей заявке конъюгаты связывающего агента и лекарственного средства могут доставлять токсин специфически внутрь раковой клетки, которая экспрессирует cMET, при минимизации неспецифической цитотоксичности по отношению к здоровым клеткам субъекта. Следовательно, описанные в настоящей заявке конъюгаты анти-cMET-связывающего агента и лекарственного средства обеспечивают более высокую эффективность (например, мишень-специфическую цитотоксичность) и меньшие побочные эффекты (например, меньшую неспецифическую цитотоксичность). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства содержит связывающий агент, который специфически связывает cMET на клеточной поверхности клетки и индуцирует интернализацию cMET после связывания. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент специфически связывается с cMET или его частью и вызывает деградацию cMET. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства содержит связывающий агент, который специфически связывает cMET на клеточной поверхности и индуцирует интернализацию и/или деградацию cMET после связывания. Интернализация и/или деградация рецептора, связанного с клеточной поверхностью, вызванная связыванием лиганда или связывающего агента, представляет собой известный биологический процесс, который может быть обнаружен, измерен и/или количественно оценен с использованием подходящего анализа, известного в данной области техники. Соответственно, способность связывающего агента вызывать интернализацию и/или деградацию cMET может быть определена без излишнего экспериментирования с использованием подходящего экспериментального анализа. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления описанный в настоящей заявке связывающий агент представляет собой связывающий агент, который специфически связывается с cMET или его частью на поверхности клетки и индуцирует интернализацию и/или деградацию cMET.

Активация cMET путем связывания его когнатных лигандов вовлечена в рост опухоли, ангиогенез и метастазирование. Агонистические анти-cMET антитела часто имитируют связывание лиганда за счет перекрестного связывания рецепторов cMET и индукции активации cMET. Соответственно, связывающий агент, который связывает cMET на поверхности клетки без активации рецептора cMET, лучше подходит для применений в противораковой терапии. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент из конъюгата связывающего агента и лекарственного средства специфически связывается с cMET или его частью на поверхности клетки, и не индуцирует обнаруживаемым образом или не способствует передаче сигналов (например, активности тирозинкиназы). В некоторых вариантах осуществления связывающий агент конъюгата связывающего агента и лекарственного средства специфически связывается с cMET или его частью на поверхности клетки и не активирует по существу cMET (например, активность тирозинкиназы). В некоторых вариантах осуществления агент, связывающий cMET, описанный в настоящей заявке, не обладает обнаруживаемой активностью агониста cMET. В некоторых вариантах осуществления агент, связывающий cMET, не обладает агонистической активностью при связывании cMET на поверхности клетки и/или не может индуцировать или способствовать обнаруживаемой активности тирозинкиназы при связывании с cMET на поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления агент, связывающий cMET, представляет собой антагонист cMET. В некоторых вариантах осуществления агент, связывающий cMET, снижает, ингибирует, уменьшает, блокирует или предотвращает передачу сигналов через рецептор cMET и/или снижает, ингибирует, уменьшает, блокирует или предотвращает индукцию или стимуляцию обнаруживаемой активности тирозинкиназы рецептором cMET. В некоторых вариантах осуществления агент, связывающий cMET, описанный в настоящей заявке, снижает, ингибирует, уменьшает, предотвращает или блокирует связывание cMET с его нативным когнатным лигандом (например, фактором роста гепатоцитов или его изоформой).

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент содержит метку. В контексте настоящего описания термины «метка» или «меченый» относятся к включению обнаруживаемого маркера, например, путем включения меченой аминокислоты или присоединения к полипептиду биотиновых фрагментов, которые могут быть обнаружены меченым авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или ферментативную активность, которая может быть обнаружена оптическими или колориметрическими методами). В некоторых вариантах осуществления метка или маркер могут быть прикреплены к связывающему агенту для создания терапевтического или диагностического агента. Связывающий агент может быть ковалентно или нековалентно присоединен к любой подходящей метке или маркеру. Различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов известны специалистам в данной области техники и могут быть использованы. Неограничивающие примеры меток для полипептидов включают следующие: радиоизотопы или радионуклиды (например, ³H, ¹⁴C, ¹⁵N, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹²⁵I, ¹³¹I), флуоресцентные метки, ферментативные метки (например, пероксидазу хрена, β-галактозидазу, люциферазу, щелочную фосфатазу), хемилюминесцентные метки, металлическую метку, хромофор, электрохемилюминесцентную метку, фосфоресцентную метку, гаситель (например, гаситель флуорофора), пару резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) (например, донор и акцептор), краситель, ферментный субстрат, малую молекулу, метку для масс-спектрометрии, квантовые точки, наночастицы, биотинильные группы, заранее определенные эпитопы полипептидов, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательности пары лейциновой застежки, участки связывания для вторичных антител, металлсвязывающие домены, эпитопные метки) и т.п. или их комбинации, но не ограничиваются ими.

В некоторых вариантах осуществления связывающий агент включает подходящий носитель. Связывающий агент может быть ковалентно или нековалентно присоединен к подходящему носителю. В некоторых вариантах осуществления носитель представляет собой агент или молекулу, которые изменяют или продлевают период полужизни связывающего агента in vivo или улучшают его фармакокинетические характеристики. Неограничивающие примеры носителя включают полиэтиленгликоль, гликоген (например, путем гликозилирования связывающего агента), декстран, и носитель или наполнитель, описанный в патенте США №6660843 и т.п., или их комбинации.

Полезные нагрузки

ПБД токсины

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства содержит связывающий агент, описанный в настоящей заявке (например, связывающий агент, который специфически связывается с cMET), и полезную нагрузку (например, цитотоксическую нагрузку). Полезная нагрузка конъюгата связывающего агента и лекарственного средства часто ковалентно связана со связывающим агентом. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит пирролобензодиазепиновый токсин (ПБД). В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит связывающую группу или подходящий линкер. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит пирролобензодиазепиновый токсин (ПБД) и связывающую группу. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит пирролобензодиазепиновый (ПБД) токсин и связывающую группу, где пирролобензодиазепиновый токсин ковалентно связан со связывающей группой, а связывающая группа ковалентно связана со связывающим агентом, описанным в настоящей заявке.

Неограничивающие примеры ПБД токсинов и способы получения ПБД токсинов описаны в следующих публикациях патентных заявок: US 2011/0256157, WO/2015/052322, US 2016/0106861, US 2007/0072846, US 2011/0201803, US 2010/0113425, US 2008/0167293, US 2014/0127239, US 2015/0158869, US 2015/0344482, US 2015/0111880, US 2015/0315196, US 2016/0015828, US 2014/0088089, US 2013/0035484, US 2011/0196148, US 2013/0028919, US 2013/0059800, US 2014/0274907, US 2014/0275522, US 2014/0234346, US 2013/0266595, US 2014/0302066, US 2014/0286970, US 2014/0294868, US 2016/0144052, US 2016/0031887, US 2014/0120118, US 2016/0250344, WO/2017/137553, WO/2017/137555 и WO/2017/186894, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.

В некоторых вариантах осуществления пирролобензодиазепиновый токсин имеет структуру химической формулы I:

[Хим. 16]

,

где Z₁ и Z₂ оба представляют собой N; Z₃ и Z₄ оба представляют собой C;

[Хим. 17]

двойная линия с пунктиром представляет одинарную связь или двойную связь;

n составляет от 1 до 12; каждый из R₃ и R₄ независимо представляет собой H или C1-4 алкоксил, а каждый из R₁ и R₂ независимо выбран из группы, состоящей из H, C_1-5 алкила, C_3-6 циклоалкила, C_2-5 алкенила и фенила, при необходимости замещенного R₅, где R₅ выбран из группы, состоящей из -NH₂, -NHR₆ и пиперазинила, замещенного R₇, имеющего структуру

[Хим. 18]

,

где R₆ содержит связывающую группу, а R₇ отсутствует или является C_1-5 алкилом; X₁ отсутствует, является защитной группой или включает связывающую группу; X₂ отсутствует, является защитной группой или содержит связывающую группу; только один из X₁, X₂, R₁ и R₂ содержит связывающую группу, а каждый из Y₁ и Y₂ независимо отсутствует, OH или SO₃; при условии, что:

[Хим. 19]

(i) когда Х₁ содержит связывающую группу, представляет собой N-C; (ii) когда Х₂ содержит связывающую группу, представляет собой N-C; (iii) когда Х₁ содержит защитную группу, представляет собой N-C, и (iv) когда Х₂ содержит защитную группу, представляет собой N-C.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин содержит только одну связывающую группу. Например, в химической формуле I только один из X₁, X₂, R₁ и R₂ может содержать связывающую группу. Например, если X₁ содержит связывающую группу, причем X₂, R₁ и R₂ не содержат связывающую группу.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I n равен 1-12. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I n равен 1-10, 1-9, 1-7, 1-5 или 1-3. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I n равен 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12. В некоторых вариантах осуществления n равен 1, 3 или 5. В некоторых вариантах осуществления n равен 3 или 5.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I R₃ и R₄ независимо представляют собой C_1-4 алкоксил. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I R₃ и R₄ независимо выбраны из -O-CH₂CH₃ или -O-CH₃. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I R₃ и R₄ оба представляют собой -O-CH₃.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, состоящей из H, C_1-5 алкила, C₃-C₆ циклоалкила и C_2-5 алкенила. R₁ и R₂ могут быть одинаковыми или разными. В некоторых вариантах осуществления R₁ и R₂ независимо выбраны из C₁-C₃ алкила и C₂-C₃ алкенила. В некоторых вариантах осуществления R₁ и R₂ независимо выбраны из -CH₂CH₂CH₃ и -CH₃. В некоторых вариантах осуществления как R₁, так и R₂ представляют собой -CH₂CH₂CH₃ или -CH₃.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I R₁ и R₂ независимо выбраны из C₃-C₆ циклоалкила и фенила, при необходимости замещенного R₅, где R₅ выбран из группы, состоящей из -NH₂, -NHR₆ и пиперазинила, замещенного R₇, имеющего структуру

[Хим. 20]

,

где R₆ содержит связывающую группу, а R₇ отсутствует или является C_1-5 алкилом. В некоторых вариантах осуществления R₁ и R₂ являются различными и независимо выбраны из (i) C₃-C₆ циклоалкила и (ii) фенила, при необходимости замещенного R₅, где R₅ выбран из -NH₂, и -NHR₆, где R₆ включает связывающую группу. В некоторых вариантах осуществления R₁ и R₂ являются различными и независимо выбраны из (i) C₃ циклоалкила и (ii) фенила, замещенного -NH₂, или -NHR₆, где R₆ содержит связывающую группу. В некоторых вариантах осуществления R₁ и R₂ являются различными и независимо выбраны из (i) фенила, при необходимости замещенного R₅, где R₅ выбран из -NH₂ и -NHR₆, где R₆ содержит связывающую группу, и (ii) пиперазинила, замещенного R₇, имеющего структуру, где R₇ отсутствует или C₁-C₂ алкилом. В некоторых вариантах осуществления R₁ и R₂ являются различными и независимо выбраны из (i) фенила, замещенного R₅, где R₅ представляет собой -NH₂, и -NHR₆, где R₆ содержит связывающую группу, и (ii) пиперазинила, замещенного R₇, имеющего структуру

[Хим. 21]

,

где R₇ представляет собой -CH₃. В некоторых вариантах осуществления R₂ представляет собой фенил, замещенный 4-метилпиперазин-1-илом.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I X₁ отсутствует, Y₁ отсутствует, Z₁-Z₃ представляет собой N=C, X₂ отсутствует, Y₂ отсутствует, а Z₂ Z₄ представляет собой N=C. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I X₁ содержит связывающую группу, Y₁ представляет собой OH, Z_2-Z₄ представляет собой N=C, X₂ отсутствует и Y₂ отсутствует. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсина химической формулы I X₁ содержит связывающую группу, Y₁ представляет собой OH, Z₂-Z₄ представляет собой N-C, X₂ представляет собой защитную группу, и Y₂ представляет собой OH.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин имеет структуру химической формулы VII, показанной ниже:

[Хим. 22]

,

где X₁ включает связывающую группу.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин имеет структуру химической формулы VIII, показанной ниже:

[Хим. 23]

,

где X₁ включает связывающую группу.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин имеет структуру химической формулы IX, показанной ниже:

[Хим. 24]

,

где R₆ включает связывающую группу.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин имеет структуру химической формулы X, показанной ниже:

[Хим. 25]

,

где R₆ включает связывающую группу.

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин присоединен (например, ковалентно связан) к связывающей группе подходящей связью, фрагментом или группой. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин присоединен (например, ковалентно) к связывающей группе карбонильной связью или амидной связью. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин присоединен (например, ковалентно связан) к связывающей группе посредством карбаматной группы. В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин присоединен (например, ковалентно связан) к связывающей группе посредством амидной группы. Неограничивающие примеры присоединения ПБД токсина к связывающей группе описаны в US 2017/0002096, US 2016/0331842, US 2015/0250896, US 2017/0080103, US 2016/0136300, US 2017/0152274, US 2015/0209444, US 2013/0274091, US 2017/0095570, US 2017/0157264, US 2015/0125474, US 2011/0256157, WO/2015/052322, US 2016/0106861, US 2007/0072846, US 2011/0201803, US 2010/0113425, US 2008/0167293, US 2014/0127239, US 2015/0158869, US 2015/0344482, US 2015/0111880, US 2015/0315196, US 2016/0015828, US 2014/0088089, US 2013/0035484, US 2011/0196148, US 2013/0028919, US 2013/0059800, US 2014/0274907, US 2014/0275522, US 2014/0234346, US 2013/0266595, US 2014/0302066, US 2014/0286970, US 2014/0294868, US 2016/0144052, US 2016/0031887, US 2014/0120118, US 2016/0250344, WO/2017/137553, WO/2017/137555 и WO/2017/186894, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.

Термин «отсутствует», используемый в настоящей заявке, означает, что указанный фрагмент отсутствует в структуре, однако указанный фрагмент может быть заменен или занят одним или несколькими атомами водорода для достижения необходимой валентности. Кроме того, в отношении любой структуры, показанной в настоящей заявке, один или несколько атомов водорода могут присутствовать для обеспечения необходимой валентности атома углерода, азота или кислорода, показанного в структуре. Соответственно, если не указано явно, может присутствовать один или несколько атомов водорода.

Связывающие группы

В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит связывающую группу, которая частично облегчает связь между связывающим агентом и ПБД токсином. В некоторых вариантах осуществления любую подходящую связывающую группу можно использовать для связывания ПБД токсина со связывающим агентом. Неограничивающие примеры связывающих групп и способы создания связывающих групп описаны в WO/2015/052322, US 2015/0158869, US 2015/0344482, US 2014/0127239, US 2017/0002096, US 2016/0331842, US 2015/0250896, US 2017/0080103, US 2016/0136300, US 2017/0152274, US 2015/0209444, US 2013/0274091, US 2017/0095570, US 2017/0157264 и US 2015/0125474, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. В некоторых вариантах осуществления связывающая группа включает C1-C20 алкил, C1-C20 алкенил, C1-C20 алкоксил, одну или несколько аминокислот или производных аминокислот, пептид, содержащий от 1 до 20 аминокислот, фенильную группу, подходящий полимер (например, полиэтиленгликоль) или их комбинацию.

В некоторых вариантах осуществления связывающая группа содержит структуру химической формулы A:

[Хим. 26]

где звездочка указывает точку присоединения связывающей группы к пирролобензодиазепиновому токсину, волнистая линия указывает точку присоединения связывающей группы к связывающему агенту, m составляет от 0 до 20, q составляет от 0 до 10, а E представляет собой соединительную группу. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы A, m составляет от 1 до 20, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6, от 1 до 4, от 2 до 8, или 4, или 8. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы из химической формулы A m выбран из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы из химической формулы A q составляет от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 6 или от 1 до 4. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы A q выбран из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы A q равен 0, 1 или 2. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы A m равен 8, а q равен 2.

В некоторых вариантах осуществления связывающая группа содержит структуру из химической формулы B:

[Хим. 27]

,

где звездочка указывает точку присоединения связывающей группы к пирролобензодиазепиновому токсину, волнистая линия указывает точку присоединения связывающей группы к связывающему агенту, v составляет от 0 до 10, и u равен 0 или 1, где в случае, когда u равен 1, t составляет от 1 до 10, а E является соединительной группой. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы B, v составляет от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 4 или от 0 до 4. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы B, v выбран из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы B, когда u равен 1, t равен от 1 до 8, от 1 до 5, от 1 до 4 или от 2 до 5. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы B, когда u равен 1, t выбран из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В некоторых вариантах осуществления для связывающей группы химической формулы B, t равен 8, u равен 1 и v равен 2. В некоторых вариантах осуществления связывающей группы химической формулы B, u равен 0 и v равен 4.

Соединительная группа E из химических формул A и B может включать любую подходящую связь, линкер или фрагмент, неограничивающие примеры которых включают дисульфидную связь, тиоэфирную связь, сложно-тиоэфирную связь, амидную связь, амин, кетон, карбоксилатный эфир, карбамат, сложный эфир, сложный тиоэфир и т.п., или их комбинацию. В некоторых вариантах осуществления E содержит ковалентную связь между связывающей группой и связывающим агентом. В некоторых вариантах осуществления E содержит ковалентную связь. В некоторых вариантах осуществления E содержит прореагировавший фрагмент, который остается после проведения подходящей реакции конъюгации. В данной области техники известно множество реакций конъюгации, любую из которых можно использовать для ковалентного связывания связывающей группы, раскрытой в настоящей заявке, со связывающим агентом, раскрытым в настоящей заявке. Любая подходящая химия конъюгации может быть использована для ковалентного присоединения связывающей группы к связывающему агенту, стохастическим или сайт-специфическим образом, неограничивающие примеры которой включают реакцию конъюгации, описанную в Shan S. Wong (Published June 18, 1991) Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press; Greg T. Hermanson (Copyright 2013) Bioconjugate Techniques, Third Edition, Elsevier Inc.; and Thiol-X Chemistries in Polymer and Materials Science, RSC Polymer Chemistry Series No. 6 (2013) Edited by Andrew B. Lowe and Christopher N. Bowman, RCS Publishing, WO/2015/052322, US 2015/0158869, US 2015/0344482, US 2014/0127239, US 2017/0002096, US 2016/0331842, US 2015/0250896, US 2017/0080103, US 2016/0136300, US 2017/0152274, US 2015/0209444, US 2013/0274091, US 2017/0095570, US 2017/0157264 и US 2015/0125474, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте. Другие неограничивающие примеры конъюгации нагрузки или связывающей группы со связывающим агентом включают взаимодействие амина или аминогруппы с N-гидроксисукцинимидным (NHS) сложным эфиром, сукцинимидилсукцинатом, сукцинимидилсукцинамидом, сукцинимидилпропионатом, сукцинимидилкарбонатом, оксикарбонилимидазолом, нитрофенилкарбонатами, трихлорфенилкарбонатами, тресилатом, малеиновым ангидридом, метилмалеиновым ангидридом, имидоэфиром, пентафторфениловым сложным эфиром (PFP), гидроксиметилфосфином, оксираном или любым другим карбонильным фрагментом; взаимодействие карбоксильного фрагмента с карбодиимидом; взаимодействие сульфгидрильного фрагмента с малеимидом, галогенацетилом, пиридилдисульфидом, ортопиридилдисульфидом и/или винилсульфоном; взаимодействие альдегидного фрагмента с гидразином или гидразидом; взаимодействие любой неселективной группы с диазирином и/или арилазидом; взаимодействие гидроксильного фрагмента с изоцианатом; взаимодействие гидроксиламинового фрагмента с карбонильным фрагментом; подобное и их комбинации.

Соответственно, E часто определяется химией, используемой для конъюгации связывающей группы со связывающим агентом. В некоторых вариантах осуществления E содержит подходящий фрагмент, сконструированный для присоединения связывающей группы к связывающему агенту. В некоторых вариантах осуществления связывающая группа ковалентно связана со связывающим агентом посредством подходящей сульфгидрил-сульфгидрильной реакции, например, с использованием малеимидной или пиридилдитиольной реакционноспособной группы, которая взаимодействует с восстановленным цистеином с образованием стабильной тиоэфирной связи. Дополнительные неограничивающие примеры реакционноспособных сульфгидрильных фрагментов включают галогенацетилы, азиридины, акрилоилы, арилирующие агенты, винилсульфоны, пиридилдисульфид и TNB-тиол. В некоторых вариантах осуществления связывающий агент соединен с E тиоэфирной связью, образованной между тиольным остатком цистеина (например, тиолом) связывающего агента и E. Соответственно, в определенных вариантах осуществления E содержит дисульфидную связь или тиоэфирную связь. В некоторых вариантах осуществления, например, когда реакцию малеимида используют для ковалентного связывания связывающего агента со связывающей группой, E содержит структуру химической формулы C:

[Хим. 28]

,

где волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту, а двойная звездочка (**) указывает точку присоединения к связывающей группе. В некоторых вариантах осуществления двойная звездочка химической формулы C представляет собой тиоэфирную связь.

Полезная нагрузка, связывающая группа или соединительная группа могут быть конъюгированы стохастическим или сайт-специфическим образом с любой подходящей аминокислотой связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка, связывающая группа или соединительная группа конъюгирована с одним или несколькими подходящими цистеинами связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка, связывающая группа или соединительная группа конъюгированы с одним или несколькими подходящими остатками лизина связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления одна или несколько аминокислот связывающего агента заменены аминокислотой, которая подходит для конъюгации с нагрузкой, связывающей группой или соединительной группой. Неограничивающие примеры аминокислот, которые могут быть заменены тиолсодержащим аминокислотным остатком или лизиновым остатком, включают A118, S119, S239, V282, T289, N361 и V422 из IgG2; S115, S252, V289, T306 и N384 из IgG1, или соответствующее положение в IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4. Включение цистеинов в антитела путем мутагенеза позволяет осуществлять прямую конъюгацию нагрузки, связывающей группы или соединительной группы с конкретными сайтами на антителе, например, через дисульфидную связь или тиоэфирную связь. Например, одна или несколько аминокислот связывающего агента могут быть заменены цистеином, где цистеин можно использовать для сайт-специфической конъюгации нагрузки, связывающей группы или соединительной группы с использованием подходящей химической реакции. Любую подходящую аминокислоту константной области антитела можно заменить на цистеин или лизин для сайт-специфической конъюгации с нагрузкой, связывающей группой или соединительной группой. Стабильность конъюгата антитела и лекарства, полученного в результате сайт-специфической конъюгации, можно оценить способами, известными в данной области техники.

В некоторых вариантах осуществления связывающая группа включает подходящий сайт расщепления ферментом. В некоторых вариантах осуществления сайт расщепления ферментом включает сайт распознавания протеазой млекопитающих. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления связывающая группа или ее часть расщепляется протеазой млекопитающего. Связывающая группа может расщепляться ферментом, присутствующим в целевом сайте или рядом с ним (например, в белке cMET или рядом с ним). Фермент, присутствующий в целевом сайте или рядом с ним, может быть внутриклеточным, мембраносвязанным, ассоциированным с мембраной или внеклеточным (например, секретируемым). Например, связывающая группа может быть сконструирована для расщепления протеазой клеточной поверхности, секретируемой протеазой или внутриклеточной протеазой (например, лизосомальной протеазой). Неограничивающие примеры сайтов расщепления ферментом включают сайт распознавания лизосомальной цистеиновой протеазой и/или лизосомальной аспарагиновой протеазой. Неограничивающие примеры лизосомальных протеаз включают катепсин B, C, H, I, J, K, L, M, N, O, P, S, T и X, а также катепсин D, E, F, G и/или катепсин А (карбоксипептидазу А).

Защитные группы

В некоторых вариантах осуществления ПБД токсин содержит подходящую защитную группу. Неограничивающие примеры защитных групп и способ получения защитных групп описаны в следующих публикациях патентных заявок: US 2011/0256157, WO/2015/052322, US2011/0201803, US2008/0167293, US2014/0127239, US2015/0158869, US2015/0344482, US2015/0315196, US2015/0315196, US2014/0302066, US2006/0264622 и US2015/0133435, содержание которых включено в настоящий документ посредством ссылки во всей полноте.

В некоторых вариантах осуществления защитная группа включает структуру химической формулы D ниже:

[Хим. 29]

,

где звездочка указывает точку присоединения к пирролобензодиазепиновому токсину, а w составляет от 0 до 10. В некоторых вариантах осуществления w составляет от 0 до 8, от 0 до 6, от 0 до 4, от 1 до 10, от 1 до 8, от 1 до 5 или от 1 до 4. В некоторых вариантах осуществления w выбран из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10. В некоторых вариантах осуществления w равен 2.

В некоторых вариантах осуществления защитная группа является удаляемой. В некоторых вариантах осуществления защитная группа может быть отщеплена с использованием подходящей химической реакции.

В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит структуру химической формулы II:

[Хим. 30]

,

где m равен 8, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту.

В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит структуру химической формулы III:

[Хим. 31]

,

где m равен 8, p равен 1 или 3, X₂ отсутствует или представляет собой защитную группу, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту. В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит структуру химической формулы IV:

[Хим. 32]

,

где волнистой линией обозначена точка присоединения к связывающему агенту.

В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит структуру химической формулы V'

[Хим. 33]

,

где m равен 8, E представляет собой подходящую соединительную группу, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту. В некоторых вариантах осуществления E содержит сукцинамидный фрагмент структуры C:

[Хим. 34]

,

где волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту, а двойная звездочка указывает точку присоединения к полезной нагрузке химической формулы V. Нагрузка химической формулы V, содержащая соединительную группу структуры C, иногда упоминается в настоящей заявке как химическая формула XI.

В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит структуру химической формулы VI:

[Хим. 35]

,

где t равен 8, v равен 1, а волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту.

В некоторых вариантах осуществления полезная нагрузка содержит структуру химической формулы VII:

[Хим. 36]

,

где волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента с лекарственным средством включает нагрузку, содержащую структуру, выбранную из любой из химических формул II, III, IV, V, VI, VII и XI, и связывающий агент, содержащий CDR-L1, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 и 14; CDR-L2, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 17, 19, 21, 23 и 25; CDR-L3, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 27, 29, 31, 33 и 35; CDR-H1, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 51, 53, 55, 57 и 59; CDR-H2, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 63, 65, 67, 69, 71, 73 и 75, а CDR-H3, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 80, 82, 84, 86, 88, 91 и 93.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства содержит нагрузку, включающую структуру, выбранную из любой из химических формул II, III, IV, V, VI, VII и XI, и связывающий агент, содержащий CDR-L1, включающую аминокислоту последовательность SEQ ID NO: 10 или 14, CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства содержит нагрузку, включающую структуру, выбранную из любой из химических формул II, III, IV, V, VI, VII и XI, и связывающий агент, содержащий CDR-L1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, CDR-L2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24, CDR-L3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34, CDR-H1, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, CDR-H2, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, и CDR-H3, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат связывающего агента и лекарственного средства содержит нагрузку, включающую структуру, выбранную из любой одной из химических формул II, III, IV, V, VI, VII и XI, и связывающий агент, содержащий вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37-44, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ №№: 94-103.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента с лекарственным средством содержит полезную нагрузку, включающую структуру, выбранную из любой одной из химических формул II, III, IV, V, VI, VII и XI, и связывающий агент, включающий вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 37-44, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 94-103.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат связывающего агента и лекарственного средства содержит нагрузку, включающую структуру, выбранную из любой из химических формул II, III, IV, V, VI, VII и XI, и связывающий агент, содержащий вариабельную область легкой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 45-49, и вариабельную область тяжелой цепи, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью, выбранной из аминокислотных последовательностей SEQ ID №№: 104-108.

В некоторых вариантах осуществления изобретения конъюгат связывающего агента с лекарственным средством содержит полезную нагрузку, включающую структуру, выбранную из любой из химических формул II, III, IV, V, VI, VII и XI, и связывающий агент, включающий вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 45-49, и вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 104-108.

Фармацевтические композиции

В некоторых вариантах осуществления композиция или фармацевтическая композиция содержит описанный в настоящей заявке конъюгат связывающего агента и лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит конъюгат связывающего агента и лекарственного средства и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, разбавитель, добавку или носитель.

Фармацевтическая композиция может быть составлена для подходящего пути введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для подкожного (п/к), внутрикожного, внутримышечного, интраперитонеального и/или внутривенного (в/в) введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать материалы для изменения, поддержания или сохранения, например, pH, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости растворения или высвобождения, адсорбции или проникновения композиции. В некоторых вариантах осуществления подходящие материалы для приготовления включают аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); противомикробные препараты; антиоксиданты (такие, как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия); буферы (такие как борат, бикарбонат, трис-HCl, цитраты, фосфаты (например, забуференный фосфатом физиологический раствор) или подходящие органические кислоты); объемообразующие агенты (такие, как маннитол или глицин); хелатирующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)); комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бетациклодекстрин); белки (такие, как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители, ароматизаторы и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие, как поливинилпирролидон); полипептиды с низкой молекулярной массой; солеобразующие противоионы (такие как натрий); растворители (такие, как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); разбавители; вспомогательные вещества и/или фармацевтические адъюванты, но не ограничиваются ими. В частности, фармацевтические композиции могут включать любой подходящий носитель, состав или ингредиент, тому подобное, или их комбинации, перечисленные в «Remington: The Science And Practice Of Pharmacy» Mack Publishing Co., Easton, PA, 19th Edition, (1995) (далее Remington '95), или «Remington: The Science And Practice Of Pharmacy», Pharmaceutical Press, Easton, PA, 22nd Edition, (2013) (далее Remington 2013), содержание которых включено в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте. Различные материалы, перечисленные в настоящей заявке, по отдельности или в комбинации, могут быть включены или использованы с материалами, описанными в Remington '95 или Remington 2013. Могут использоваться любые подходящие методики, носители и наполнители, включая те, которые известны в данной области техники; например, как описано в Remington '95 или Remington 2013.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит подходящее вспомогательное вещество, неограничивающие примеры которого включают антиадгезивные средства (например, стеарат магния), связующий агент, наполнители, моносахариды, дисахариды, другие углеводы (например, глюкозу, маннозу или декстрин), сахароспирты (например, маннитол или сорбитол), покрытия (например, целлюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), микрокристаллическую целлюлозу, синтетические полимеры, шеллак, желатин, кукурузный протеин, зеин, энтеросолюбильные вещества или другие полисахариды), крахмал (например, картофельный, кукурузный или пшеничный крахмал), диоксид кремния, красители, дезинтегранты, ароматизаторы, любриканты, консерванты, сорбенты, подсластители, носители, суспендирующие агенты, поверхностно-активные вещества и/или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, сложные эфиры сорбитана, полисорбаты, такие как полисорбат 20, полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапол), агенты, повышающие стабильность (такие, как сахароза или сорбитол), и агенты, повышающие тоничность (такие, как галогениды щелочных металлов, хлорид натрия или калия, маннитол, сорбитол) и/или любое вспомогательное вещество, описанное в Remington '95 или Remington 2013. Термин «связующий агент» в контексте настоящего описания относится к соединению или ингредиенту, который помогает поддерживать соединение фармацевтической смеси. Подходящие связующие агенты для изготовления фармацевтических составов и часто используемые при приготовлении фармацевтических таблеток, капсул и гранул известны специалистам в данной области техники. Для пояснения, используемый в настоящей заявке термин «связывающий агент» не относится к «связующему веществу», которое используется в некоторых фармацевтических составах. Хотя фармацевтическая композиция в некоторых вариантах осуществления может содержать связывающий агент, который специфически связывает cMET, а также связующий агент.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит подходящую фармацевтически приемлемую добавку и/или носитель. Неограничивающие примеры подходящих добавок включают подходящий регулятор pH, смягчающий агент, буфер, серосодержащий восстанавливающий агент, антиоксидант и т.п. Неограничивающие примеры серосодержащих восстанавливающих агентов включают те, которые имеют сульфгидрильную группу (например, тиол), такие как N-ацетилцистеин, N-ацетилгомоцистеин, тиоктовая кислота, тиодигликоль, тиоэтаноламин, тиоглицерин, тиосорбитол, тиогликолевая кислота и их соли, тиосульфат натрия, глутатион и С1-С7 тиоалкановая кислота. Неограничивающие примеры антиоксидантов включают эриторбиновую кислоту, дибутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, альфа-токоферол, токоферолацетат, L-аскорбиновую кислоту и ее соли, L-аскорбилпальмитат, L-аскорбилстеарат, бисульфит натрия, сульфит натрия, триамилгаллат и пропилгаллат, а также хелатирующие агенты, такие как динатрий этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), пирофосфат натрия и метафосфат натрия. Кроме того, разбавители, добавки и вспомогательные вещества могут включать другие обычно используемые ингредиенты, например, неорганические соли, такие как хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, фосфат натрия, фосфат калия и бикарбонат натрия, а также органические соли, такие как цитрат натрия, цитрат калия и ацетат натрия.

Используемые в настоящей заявке фармацевтические композиции могут быть стабильными в течение длительного периода времени, например, порядка месяцев или лет. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит один или несколько подходящих консервантов. Неограничивающие примеры консервантов включают бензалкония хлорид, бензойную кислоту, салициловую кислоту, мертиолят, фенэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновую кислоту, перекись водорода и т.п., и/или их комбинации. Консервант может включать четвертичное аммонийное соединение, такое как бензалкония хлорид, бензоксония хлорид, бензетония хлорид, цетримид, сепазония хлорид, цетилпиридиния хлорид или домифен бромид (BRADOSOL (зарегистрированная торговая марка)). Консервант может включать алкилртутную соль тиосалициловой кислоты, такую как мертиолят, нитрат фенилртути, ацетат фенилртути или борат фенилртути. Консервант может включать парабен, такой как метилпарабен или пропилпарабен. Консервант может включать спирт, такой как хлорбутанол, бензиловый спирт или фенилэтиловый спирт. Консервант может включать производное бигуанида, такое как хлоргексидин или полигексаметиленбигуанид. Консервант может включать перборат натрия, имидазолидинилмочевину и/или сорбиновую кислоту. Консервант может включать стабилизированные оксихлорокомплексы, такие как известные и коммерчески доступные под торговым наименованием PURITE (зарегистрированная торговая марка). Консервант может включать смолы конденсации полигликоля-полиамина, такие как известные и коммерчески доступные под торговым названием POLYQUART (зарегистрированная торговая марка) от Henkel KGaA. Консервант может включать стабилизированную перекись водорода. Консервантом может быть бензалкония хлорид. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция не содержит консервантов.

В некоторых вариантах осуществления композиция, фармацевтическая композиция или конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по существу не содержат загрязняющих веществ (например, клеток крови, тромбоцитов, полипептидов, минералов, передаваемых с кровью соединений или химических веществ, вирусов, бактерий, других патогенов, токсинов и т.п.). В некоторых вариантах осуществления композиция, фармацевтическая композиция или конъюгат связывающего агента с лекарственным средством по существу не содержат сыворотки и сывороточных примесей (например, белков сыворотки, липидов сыворотки, углеводов сыворотки, сывороточных антигенов и т.п.). В некоторых вариантах осуществления композиция, фармацевтическая композиция или конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по существу не содержит патогена (например, вируса, паразита или бактерий). В некоторых вариантах осуществления композиция, фармацевтическая композиция или конъюгат связывающего агента и лекарственного средства практически не содержат эндотоксина. В некоторых вариантах осуществления композиция, фармацевтическая композиция или конъюгат связывающего агента и лекарственного средства являются стерильными. В некоторых вариантах осуществления композиция или фармацевтическая композиция содержит конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, который специфически связывает внеклеточный домен cMET, и подходящий разбавитель (например, фосфатный буферный физиологический раствор).

Описанные в настоящей заявке фармацевтические композиции могут быть сконструированы для введения субъекту в любой подходящей форме и/или количестве в соответствии с терапией, в которой они используются. Например, фармацевтическая композиция, предназначенная для парентерального введения (например, путем инъекции или инфузии), может принимать форму суспензии, раствора или эмульсии в масляном или водном носителе, и может содержать агенты, наполнители, добавки и/или разбавители для состава, такие как водные или неводные растворители, сорастворители, суспендирующие растворы, консерванты, стабилизирующие агенты и/или диспергирующие агенты. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, подходящая для парентерального введения, может содержать одно или несколько вспомогательных веществ. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию лиофилизируют до формы сухого порошка. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическую композицию лиофилизируют до формы сухого порошка, который подходит для восстановления подходящим фармацевтическим растворителем (например, водой, физиологическим раствором, изотоническим буферным раствором (например, ФБР) и т.п.). В некоторых вариантах осуществления восстановленные формы лиофилизированной фармацевтической композиции подходят для парентерального введения (например, внутривенного введения) млекопитающему.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предназначена для перорального введения и может быть составлена в виде таблетки, микротаблетки, минитаблеток, микрогранул, порошковых гранул, капсул (например, капсул, наполненных микротаблетками, микрогранулами, порошками или гранулами), эмульсий или растворов. Фармацевтические композиции, предназначенные для перорального введения, могут включать подходящие покрытия для задержки или замедления высвобождения активного ингредиента (например, связывающего агента), неограничивающие примеры которых включают энтеросолюбильные покрытия, такие как жирные кислоты, воски, шеллак, пластмассы, сополимеры метилакрилата-метакриловой кислоты, целлюлозы ацетат фталат (ЦАФ), целлюлозы ацетат сукцинат, гидроксипропилметилцеллюлозы фталат, гидроксипропилметилцеллюлозы ацетат сукцинат (гипромеллозы ацетат сукцинат), поливинилацетата фталат (ПВАФ), сополимеры метилметакрилата-метакриловой кислоты, целлюлозы ацетат триметиллат, натрия альгинат, зеин, растительные волокна и т.п., и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтические композиции, описанные в настоящей заявке, могут быть предназначены для местного введения и могут включать одно или несколько из связующего агента и/или любриканта, полимерных гликолей, желатинов, масла какао или других подходящих восков или жиров. В некоторых вариантах осуществления описанная в настоящей заявке фармацевтическая композиция включена в состав для местного применения, содержащий носитель для местного применения, который обычно подходит для местного введения лекарственного средства и включает любой подходящий материал, известный специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления состав фармацевтической композиции для местного применения готовят для введения связывающего агента из пластыря для местного применения.

В некоторых вариантах осуществления оптимальная фармацевтическая композиция будет определена специалистом в данной области техники в зависимости, например, от предполагаемого пути введения, формата доставки и необходимой дозировки (см., например, Remington '95 или Remington 2013, выше). В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo конъюгатов антитела и лекарственного средства по изобретению. Фармацевтическая композиция может быть произведена любым подходящим способом, включая, например, способы обычного смешивания, растворения, гранулирования, дражирования, растирания в порошок, эмульгирования, инкапсулирования, улавливания или таблетирования (например, см. способы, описанные в Remington '95 или Remington 2013).

Второе медицинское использование

В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке представлена композиция или фармацевтическая композиция для использования в качестве лекарственного средства для лечения рака или неопластического заболевания у субъекта, при этом композиция или фармацевтическая композиция содержит описанный в настоящей заявке конъюгат связывающего агента и лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке представлена композиция или фармацевтическая композиция, содержащая описанный в настоящей заявке конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, для применения при лечении рака или неопластического заболевания.

Способы лечения

В некоторых вариантах осуществления композиция, фармацевтическая композиция или конъюгат связывающего агента с лекарственным средством, описанные в настоящей заявке, используются для лечения субъекта, у которого имеется или предполагается наличие неопластического заболевания или рака. В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства или фармацевтическую композицию, описанную в настоящей заявке, используют для лечения неопластического заболевания или рака у субъекта, где конъюгат связывающего агента и лекарственного средства специфически связывается с внеклеточным доменом cMET человека. В некоторых вариантах осуществления в настоящей заявке представлен способ лечения субъекта, у которого имеется или предполагается наличие неопластического заболевания или рака. В некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта, у которого имеется или предполагается наличие неопластического заболевания или рака, включает введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, фармацевтической композиции или конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, описанного в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение контакта клетки (например, одной или нескольких клеток) субъекта с терапевтически эффективным количеством описанной в настоящей заявке композиции, фармацевтической композиции или конъюгата связывающего агента и лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение контакта раковой клетки или неопластической клетки субъекта с терапевтически эффективным количеством описанной в настоящей заявке композиции, фармацевтической композиции или конъюгата связывающего агента и лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение контакта клетки (например, одной или нескольких клеток) субъекта с терапевтически эффективным количеством конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, который специфически связывается с внеклеточной частью человеческого cMET или его варианта. В некоторых вариантах осуществления способ включает обеспечение контакта раковой клетки или неопластической клетки с терапевтически эффективным количеством конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, который специфически связывается с внеклеточной частью человеческого cMET или его варианта, где клетка экспрессирует cMET на своей поверхности. Клетка субъекта часто представляет собой клетку, которая экспрессирует внеклеточную часть cMET. Клетка, которая контактирует с конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, может быть обнаружена внутри субъекта (например, in vivo) или вне субъекта (например, in vitro или ex vivo).

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства блокирует, ингибирует, ослабляет, предотвращает или подавляет рост, жизнеспособность или метастазирование рака или раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства вызывает смерть, некроз или апоптоз рака или раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления обеспечение контакта клетки субъекта с конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытым в настоящей заявке, индуцирует или стимулирует гибель, некроз или апоптоз клетки. В некоторых вариантах осуществления обеспечение контакта клетки субъекта с конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытым в настоящей заявке, индуцирует или стимулирует гибель клетки в результате процесса АЗКЦ, АЗКФ или комплемент-зависимой клеточной цитотоксичности (КЗКЦ). В некоторых вариантах осуществления обеспечение контакта клетки субъекта с конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытым в настоящей заявке, снижает, ингибирует или уменьшает митоз клетки. В некоторых вариантах осуществления обеспечение контакта рака или раковой клетки субъекта с конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытым в настоящей заявке, уменьшает, ингибирует или снижает метастазирование рака или раковой клетки.

Субъекты

Термин «субъект» относится к млекопитающему. Любое подходящее млекопитающее можно лечить способом или композицией, описанными в настоящей заявке. Неограничивающие примеры млекопитающих включают людей, приматов, не являющихся человеком (например, обезьян, гиббонов, шимпанзе, орангутанов, мартышек, макак и т.п.), домашних животных (например, собак и кошек), сельскохозяйственных животных (например, лошадей, коров, коз, овец, свиней) и экспериментальных животных (например, мышей, крыс, кроликов, морских свинок). В некоторых вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека. Млекопитающее может быть любого возраста или находиться на любой стадии развития (например, взрослый, подросток, ребенок, младенец или млекопитающее в утробе матери). Млекопитающее может быть самцом или самкой.

В некоторых вариантах осуществления субъект нуждается в лечении или композиции, описанной в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления у субъекта имеется или предполагается наличие неопластического заболевания или рака. В некоторых вариантах осуществления у субъекта, нуждающегося в лечении или композиции, описанной в настоящей заявке, имеется или предполагается наличие неопластического заболевания или рака. В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящей заявке конъюгат связывающего агента и лекарственного средства или композицию используют для лечения субъекта, у которого имеется или предполагается наличие неопластического заболевания или рака.

Типы рака

Композиция, фармацевтическая композиция или конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, раскрытые в настоящей заявке, могут быть использованы для лечения неопластического заболевания или рака, неограничивающие примеры которых включают карциному, саркому, нейро-неоплазию, лимфому, миелому, лейкоз, меланому, мезотелиому, солидные опухоли или опухоли мягких тканей, и вторичный рак (например, происходящий из первичного очага). Неограничивающие примеры карциномы включают карциномы респираторной системы, карциномы желудочно-кишечной системы, карциномы мочеполовой системы, карциномы яичка, карциномы простаты, карциномы эндокринной системы, базальноклеточную карциному кожи, карциному неустановленной первичной локализации, холангиокарциному, протоковую карциному in situ (DCIS), карциному из клеток Меркеля, карциному легкого, тимому и карциному тимуса, срединную карциному, мелкоклеточную карциному легкого, карциному щитовидной железы, гепатоцеллюлярную карциному, плоскоклеточную карциному, плоскоклеточную карциному головы и шеи, карциному молочной железы, эпителиальную карциному, карциному коры надпочечника, карциному поверхностного эпителия яичника и т.п., дополнительно включая карциному матки, шейки матки, толстой кишки, поджелудочной железы, почки, пищевода, желудка и яичника. Неограничивающие примеры саркомы включают саркому Юинга, лимфосаркому, липосаркому, остеосаркому, саркому молочной железы, саркому мягких тканей, саркому Капоши, рабдомиосаркому, саркому матки, хондросаркому, лейомиосаркому, фибросаркому и т.п. Неограничивающие примеры нейро-неоплазии включают глиому, глиобластому, менингиому, нейробластому, ретинобластому, астроцитому, олигодендроцитому и т.п. Неограничивающие примеры лимфом, миелом и лейкозов включают острый и хронический лимфобластный лейкоз, миелобластный лейкоз, множественную миелому, низкодифференцированные острые лейкозы (например, эритробластный лейкоз и острый мегакариобластный лейкоз), острый промиелоидный лейкоз (ОПМЛ), острый миелогенный лейкоз (ОМЛ), хронический миелолейкоз (ХМЛ), острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), который включает В-клеточный ОЛЛ и Т-клеточный ОЛЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ), волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ), макроглобулинемию Вальденстрема (МВ), неходжкинскую лимфому и ее варианты, периферические Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз/лимфому взрослых (ATL), кожную Т-клеточную лимфому (КТКЛ), лейкоз из больших зернистых лимоцитов (LGF), болезнь Ходжкина и болезнь Рид-Штернберга. Неограничивающие примеры опухолей мягких или твердых тканей включают висцеральные опухоли, семиномы, гепатомы и другие опухоли молочной железы, печени, легкого, поджелудочной железы, матки, яичника, яичка, головы, шеи, глаза, головного мозга, рта, глотки, голосовых связок, уха, носа, пищевода, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, надпочечника, почки, кости, мочевого пузыря, уретры, легкого, мышцы, кожи, ступни, руки и мягких тканей. В некоторых вариантах осуществления неопластическое заболевание или рак, которые можно лечить фармацевтической композицией или конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытым в настоящей заявке, выбраны из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака шейки матки, рака желудка, рака печени, гепатоцеллюлярного рака, гипофарингеального рака, рака легкого, аденокарциномы, рака яичника и рака почки. В некоторых вариантах осуществления неопластическое заболевание или рак, которые можно лечить фармацевтической композицией или конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытыми в настоящей заявке, выбраны из рака поджелудочной железы (например, аденокарциномы поджелудочной железы, экзокринного рака поджелудочной железы или нейроэндокринного рака поджелудочной железы), колоректального рака (например, колоректальной аденокарциномы), злокачественного новообразования тонкой кишки, холангиокарциномы, немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), рака щитовидной железы, рака пищевода или пищеводно-желудочного перехода (ПЖП), аденокарциномы желудка, гепатоцеллюлярной карциномы печени, плоскоклеточной карциномы головы и шеи, злокачественного новообразования женских половых путей, карциномы молочной железы, мелкоклеточной карциномы легкого, карциномы поверхностного эпителия яичника, ретроперитонеальной или перитонеальной саркомы, аденокарциномы простаты, нейроэндокринной опухоли, стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта, глиобластомы или неэпителиального рака яичника. В некоторых вариантах осуществления неопластическое заболевание или рак, которые можно лечить фармацевтической композицией или конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытым в настоящей заявке, представляет собой рак молочной железы, неограничивающие примеры которого включают протоковую карциному in situ (DCIS), инвазивную протоковую карциному (IDC) (например, канальцевую карциному молочной железы, медуллярную карциному молочной железы, муцинозную карциному молочной железы, папиллярную карциному молочной железы и криброзную карциному молочной железы), инвазивную лобулярную карциному (ИЛК), воспалительный рак молочной железы, лобулярную карциному in situ (LCIS), рак молочной железы у мужчин, молекулярные подтипы рака молочной железы (например, люминальный тип В рак молочной железы или гормон-рецептор-положительный рак молочной железы, трижды негативный рак молочной железы, рак молочной железы с гиперэкспрессией HER2, и нормально-подобный рак молочной железы), болезнь Педжета соска молочной железы, филлодийные опухоли молочной железы и метастатический рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления неопластическое заболевание или рак, которые можно лечить фармацевтической композицией или конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства, раскрытым в настоящей заявке, представляет собой трижды негативный рак молочной железы.

В некоторых вариантах осуществления эффективность описанного здесь лечения может быть определена или с прогнозирована, отчасти, по количеству cMET, которое экспрессируется раком или неоплазией. Известно, что многие виды рака и опухолей экспрессируют cMET, неограничивающие примеры которых включают определенные виды рака мочевого пузыря, рака молочной железы, колоректального рака, рака желудка, гепатоцеллюлярного рака, плоскоклеточного рака головы и шеи, гипофарингеального рака, рака легкого, аденокарциномы, рака яичника и рака почки (например, см. Ariyawutyakorn et al. (2016) Journal of Cancer 7 (6): 633-649), и известны количества cMET, экспрессируемые многими типами рака (например, см. Arguello et al. (2013) Annual Meeting of Association for Molecular Pathology (AMP) Abstract No. 294319). Кроме того, неопластическая клетка или раковая клетка могут быть быстро проанализированы на экспрессию cMET с использованием подходящего связывающего анти-cMET агента (например, антитела) с использованием подходящего метода (например, ИФА целых клеток, сортировки клеток с активированной флуоресценцией, любого подходящего иммуноанализа и т.п.). Соответственно, в некоторых вариантах осуществления способ лечения субъекта с наличием или подозрением на наличие рака включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, описанного в настоящей заявке, или фармацевтической композиции, содержащей конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, описанной в настоящей заявке, субъекту, у которого рак экспрессирует определяемые уровни cMET. В некоторых вариантах осуществления рак, который экспрессирует определяемые уровни cMET, может быть раком, который, как известно или сообщается, экспрессирует cMET, или для которого предполагается экспрессия cMET (например, имеет генотип или фенотип, аналогичный другому раку, который, как известно, экспрессирует cMET). В некоторых вариантах осуществления рак, который экспрессирует cMET, или рак, для которого предполагается экспрессия cMET, представляет собой рак, который экспрессирует транскрипт РНК, кодирующий cMET, или его часть. В некоторых вариантах осуществления рак, который экспрессирует cMET, или рак, для которого предполагается экспрессия cMET, представляет собой рак, который экспрессирует cMET на своей клеточной поверхности.

Путь применения

Может быть использован любой подходящий способ введения субъекту композиции, фармацевтической композиции или конъюгата связывающего агента и лекарственного средства. Точный состав и способ введения композиции для применения в соответствии со способами изобретения, описанными в настоящей заявке, могут быть выбраны медицинским работником (например, врачом) с учетом состояния пациента (см., например, Fingl et al. 1975, «The Pharmacological Basis of Therapeutics», включенный в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте). Любой подходящий способ введения может быть использован для применения фармацевтической композиции или конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, описанного в настоящей заявке. Неограничивающие примеры путей введения включают местное или локальное введение (например, трансдермальное или кожное (например, на коже или эпидермисе), введение в глаз или на глаз, интраназальное, трансмукозальное, введение в ухо, внутри уха (например, за барабанную перепонку)), энтеральное (например, с доставкой через желудочно-кишечный тракт, например, пероральное (например, в виде таблетки, капсулы, гранулы, жидкости, эмульсии, пастилки или их комбинации), сублингвальное, через желудочный зонд, ректальное, и т.п.), парентеральное введение (например, парентерально, например, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутрикожно, подкожно, внутри полости, интракараниально, интра-артикулярно, в суставное пространство, внутрисердечно (в сердце), внутрикавернозной инъекцией, внутриочаговой инфузией (в очаг поражения кожи), внутрикостной инфузией (в костный мозг), интратекально (в позвоночный канал), внутриматочно, интравагинально, внутрипузырной инфузией, интравитреально) и т.п., или их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления композиция предоставляется субъекту. Композиция, которая предоставляется субъекту, иногда предоставляется субъекту для самостоятельного введения или для введения субъекту другим лицом (например, немедицинским специалистом). Например, описанная в настоящей заявке композиция может быть предоставлена в виде инструкции, написанной практикующим врачом, которая разрешает пациенту получать композицию или лечение, описанные в настоящей заявке (например, рецепт). В другом примере композиция может быть предоставлена субъекту, если субъект самостоятельно вводит композицию, например, перорально, внутривенно или с помощью ингалятора.

Альтернативно, можно применять композиции для использования согласно способам по изобретению местным, а не системным образом, например, путем прямого нанесения на кожу, слизистую оболочку или интересующую область для лечения, включая использование депо или композиции с замедленным высвобождением.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, может применяться отдельно (например, в качестве одного активного ингредиента (АИ или, например, в качестве одного активного фармацевтического ингредиента (АФИ)). В других вариантах осуществления фармацевтическую композицию, содержащую конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, можно применять в комбинации с одним или несколькими дополнительными АИ/АФИ, например, в виде двух отдельных композиций или в виде единой композиции, где один или несколько дополнительных АИ/АФИ смешаны или составлены вместе со конъюгатом связывающего агента и лекарственного средства в фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат cMET-связывающего агента и лекарственного средства доставляется в клетку (например, клетку млекопитающего). Конъюгат cMET-связывающего агента и лекарственного средства может быть доставлен в клетку с использованием любого подходящего метода. В некоторых вариантах осуществления доставка конъюгата cMET-связывающего агента и лекарственного средства в клетку включает обеспечение контакта клетки млекопитающего in vitro или in vivo с композицией, содержащей конъюгат cMET-связывающего агента и лекарственного средства в условиях, которые позволяют конъюгату связывающего агента и лекарственного средства связываться с клеткой.

Доза и терапевтически эффективное количество

В некоторых вариантах осуществления количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства в композиции является терапевтически эффективным количеством. В некоторых вариантах осуществления субъекту вводят терапевтически эффективное количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства в композиции представляет собой количество, необходимое для получения эффективного терапевтического результата. В некоторых вариантах осуществления количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства в композиции (например, фармацевтической композиции) представляет собой количество, достаточное для предотвращения, лечения, снижения тяжести, замедления развития и/или облегчения симптома неопластического заболевания или рака, рассматриваемых в настоящей заявке.

«Терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для получения эффективного терапевтического результата, и/или количество, достаточное для предотвращения, лечения, уменьшения тяжести, замедления развития и/или облегчения симптома неопластического заболевания или рака. В некоторых вариантах осуществления «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для прекращения роста и/или замедления роста новообразования или рака. В некоторых вариантах осуществления «терапевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для ингибирования репликации и/или индукции гибели одной или нескольких неопластических или раковых клеток. Определение терапевтически эффективного количества находится в компетенции специалистов в данной области техники, особенно в свете подробного описания, представленного в настоящей заявке.

В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, достаточно высокое, чтобы обеспечить эффективный терапевтический эффект, и количество, достаточно низкое, чтобы минимизировать нежелательные побочные реакции. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства может варьировать от субъекта к субъекту, часто в зависимости от возраста, массы тела, общего состояния здоровья субъекта, тяжести состояния, которое лечат, и конкретной комбинации вводимых препаратов. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество определяют эмпирически. Соответственно, терапевтически эффективное количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, используемого для лечения субъекта, может быть определено рядовым специалистом в данной области техники, например, на основании количеств, эффективных в исследованиях на животных или в клинических исследованиях, опыта врача и предлагаемых диапазонов доз или руководств по дозировке.

В некоторых вариантах осуществления конъюгат связывающего агента и лекарственного средства (например, конъюгат связывающего агента и лекарственного средства в фармацевтической композиции) применяют в подходящем терапевтически эффективном количестве или дозе (например, в подходящем объеме и концентрации, которые иногда частично зависят от конкретного пути введения). В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства выбирают из одной или нескольких доз примерно от 0,01 мг/кг (например, на кг массы тела субъекта) до 500 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 500 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 400 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 300 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 300 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 200 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 150 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 100 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 75 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 50 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 25 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,1 мг/кг до 1 мг/кг, промежуточных количеств, и их комбинаций. В некоторых аспектах терапевтически эффективное количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства включает одну или несколько доз примерно 10 мг/кг, 9 мг/кг, 8 мг/кг, 7 мг/кг, 6 мг/кг, 5 мг/кг, 4 мг/кг, 3 мг/кг, 2 мг/кг, 1 мг/кг, 0,9 мг/кг, 0,8 мг/кг, 0,7 мг/кг, 0,6 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,4 мг/кг, 0,3 мг/кг, 0,2 мг/кг и 0,1 мг/кг, промежуточные количества и их комбинации. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства составляет от примерно 0,1 мг/кг до 100 мг/кг или примерно от 1 мг/кг до 50 мг/кг.

В некоторых вариантах осуществления применение терапевтически эффективного количества конъюгата связывающего агента и лекарственного средства или фармацевтической композиции, содержащей конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, включает применение подходящей дозы с частотой или интервалом, которые необходимы для получения эффективного терапевтического результата. В некоторых вариантах осуществления изобретения применение терапевтически эффективного количества конъюгата связывающего агента и лекарственного средства или фармацевтической композиции, содержащей конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, включает применение подходящей дозы ежечасно, каждые два часа, каждые 4 часа, каждые 6 часов, три раза в сутки, два раза в сутки, один раз в сутки, шесть раз в неделю, пять раз в неделю, четыре раза в неделю, три раза в неделю, два раза в неделю, один раз в неделю, в их сочетаниях и/или через регулярные или нерегулярные интервалы, и/или просто с частотой или интервалом по мере необходимости или по рекомендации медицинского работника. В некоторых вариантах осуществления эффективный терапевтический результат может быть определен путем мониторинга количества, размера, жизнеспособности, роста, митоза или метастазирования рака, неопластического роста или раковых клеток у субъекта. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления уменьшение или снижение количества, жизнеспособности, размера, роста, митоза или метастазирования неопластических или раковых клеток у субъекта считается эффективным терапевтическим результатом.

Наборы

Фармацевтическая композиция, содержащая количество или дозу конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, при необходимости может быть предоставлена в наборе, упаковке или дозирующем устройстве, которые могут содержать одну или несколько доз связывающего агента. В некоторых вариантах осуществления набор включает упаковку и/или дозирующее устройство. Неограничивающие примеры упаковки включают металлический, стеклянный или пластиковый контейнер, или блистерную упаковку, которая содержит описанный в настоящей заявке конъюгат связывающего агента и лекарственного средства или композицию. В некоторых вариантах осуществления набор включает дозирующее устройство, такое как шприц или ингалятор. К упаковке и/или дозирующему устройству могут прилагаться инструкции по применению. К упаковке или дозатору может также прилагаться уведомление, связанное с контейнером, в форме, предписанной государственным агентством, регулирующим производство, использование или продажу фармацевтических препаратов, причем это уведомление отражает одобрение агентством формы лекарственного средства для человеческого или ветеринарного применения. Таким уведомлением, например, может быть маркировка, одобренная Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств США для рецептурных препаратов, или одобренный вкладыш продукта.

В некоторых вариантах осуществления набор или упаковка содержит количество конъюгата связывающего агента и лекарственного средства, достаточное для лечения пациента от 1 дня до 1 года, от 1 дня до 180 дней, от 1 дня до 120 дней, от 1 дня до 90 дней, от 1 дня до 60 дней, от 1 дня до 30 дней, 1-24 часа, 1-12 часов, 1-4 часа или для промежутка времени между ними.

Набор при необходимости включает этикетку продукта и/или один или несколько упаковочных вкладышей, которые предоставляют описание компонентов или инструкции по применению in vitro, in vivo или ex vivo компонентов в нем. Примерные инструкции включают инструкции по диагностическому методу, протоколу лечения или терапевтическому режиму. В некоторых вариантах осуществления набор содержит упаковочный материал, который относится к физической структуре, содержащей компоненты набора. Упаковочный материал может обеспечивать стерильность компонентов и может быть изготовлен из материала, обычно используемого для таких целей (например, бумаги, гофрированного волокна, стекла, пластика, фольги, ампул, флаконов, тюбиков и т.д.). Этикетки или вкладыши продуктов включают «печатные материалы», например, бумагу или картон, или отдельные или прикрепленные к компоненту, набору или упаковочному материалу (например, коробке), или прикрепленные к ампуле, пробирке или флакону, содержащему компонент набора. Этикетки или вкладыши могут дополнительно включать машиночитаемый носитель, оптический диск, такой как CD- или DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, магнитную ленту, или электрические носители данных, такие как RAM и ROM, или их гибриды, такие как магнитные/оптические. носители данных, флэш-накопители или карты памяти. Этикетки или вкладыши продуктов могут включать идентифицирующую информацию об одном или нескольких компонентах в них, количестве доз, клинической фармакологии активного ингредиента (ингредиентов), включая механизм действия, фармакокинетику (ФК) и фармакодинамику (ФД). Этикетки или вкладыши продуктов могут включать идентифицирующую информацию о производителе, номера партий, местонахождение производителя, дату, информацию об указанном состоянии, расстройстве, заболевании или симптоме, для лечения которых может использоваться компонент набора. Этикетки или вкладыши продуктов могут включать инструкции для клинициста или для субъекта по использованию одного или нескольких компонентов набора в способе, протоколе лечения или терапевтической схеме. Инструкции могут включать количество доз, частоту или продолжительность, а также инструкции для практического применения любого из способов, протоколов лечения или терапевтических режимов, изложенных в настоящей заявке. Поэтому наборы по изобретению могут дополнительно включать этикетки или инструкции для практического применения любого из способов и применений изобретения, описанных в настоящей заявке. Этикетки или вкладыши продуктов могут включать информацию о потенциальных побочных эффектах и/или предупреждения.

Примеры

Пример 1. Получение антител

Чтобы вызвать антительный ответ против cMET, мышей иммунизировали cMET-Fc или сМЕТ пептидом, как описано на фиг. 1 и 2. В некоторых вариантах осуществления пептиды, полученные из стратегических областей, отбирали для иммунизации. На фиг. 3 показан пример структурной петли на МЕТ, которая вдохновила на дизайн пептида 3. Были получены селезенки от иммунизированных мышей, и спленоциты были слиты с подходящим партнером гибридизации для получения гибридом с использованием стандартного протокола. Выделяли клоны гибридомы, и среду гибридомы тестировали на связывание с MET и/или на способность к индукции интернализации cMET на линиях раковых клеток человека с помощью проточной цитометрии (фиг. 4). Отобранные гибридомные антитела отбирали по их способности индуцировать деградацию МЕТ (фиг. 5) или неспособности индуцировать фосфорилирование ERK (фиг. 6). Наилучшая гибридома F6B1P3D12 была депонирована в Американскую коллекцию типовых культур, Патентный депозитарий 10801 University Boulevard, Манассас, Вирджиния 20110-2209 США 20 марта 2019. Депозит был осуществлен в соответствии с положениями Будапештского договора о международном признании депозита микроорганизмов для целей патентной процедуры и правилами к ней (Будапештский договор). Номер АТСС пока не присвоен.

Были проведены дополнительные анализы для выбора идеальных кандидатов на антитела против cMET. Например, антитела против cMET были протестированы на видовую перекрестную реактивность путем определения способности антитела связываться с cMET человека, cMET обезьяны (например, Macaca fascicularis, то есть Cynomolgus Macaque), cMET крысы и cMET мыши, путем анализа с помощью ИФА (фиг. 7 и таблица 11). Также оценивали период полужизни in vivo и другие фармакокинетические характеристики (данные не показаны). Эффективность и специфичность конъюгатов антитело-лекарственное средство (ADC) также определяли на линиях клеток с высокой, средней и отрицательной экспрессией cMET с использованием антител против cMET, которые были конъюгированы с MMAF (фиг. 9 и 15, таблицы 11 и 12). ADC тестировали на эффективность in vivo с использованием модели ксенотрансплантата MKN45.

Пример 2. Обзор характеристик выбранных гуманизированных моноклональных связывающих агентов

Были созданы гуманизированные и моноклональные связывающие агенты с переключением изотипа, которые включают CDR тяжелой цепи и CDR легкой цепи моноклонального антитела мыши P3D12. Шестнадцать различных комбинаций тяжелой цепи (HC) и легкой цепи (LC) были протестированы на растворимость в ФБР, связывание с cMET человека, связывание с cMET крысы, аффинность связывания с cMET человека и крысы, при определении с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР), наличие агонистической активности и деградации cMET сообщается как платформа Meso Scale Discovery (MSD). Результаты представлены в таблице 12 ниже.

Авторы изобретения выбрали моноклональное гуманизированное антитело изотипа IgG2, содержащее гуманизированную вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 47 и гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:108, в качестве примерного гуманизированного антитела против cMET, названного hD12, и использовали антитело в следующих примерах.

Пример 3. Анализы связывания

Примерное гуманизированное антитело против cMET, hD12, содержащее гуманизированную тяжелую цепь SEQ ID NO:108 и последовательности гуманизированной легкой цепи SEQ ID NO: 47, стохастически конъюгировали с пятью примерными полезными нагрузками (то есть полезными нагрузками согласно химическим формулам II, IV, VI, VII и XI), где каждая полезная нагрузка содержит пирролобензодиазепиновый токсин и связывающую группу. В этом примере связывающие группы нагрузки были стохастически связаны с антителом hD12 с использованием дисульфидной химии. Вкратце, антитело hD12 сначала подвергали восстановлению глутатионом (GSH), непрореагировавший GSH удаляли, и связывающую группу, которая включает реакционноспособную малеимидную группу, подвергали взаимодействию с одной или несколькими свободными сульфгидрильными группами (т.е. тиольными группами) на антителе. Используя этот подход, одну или несколько нагрузок ковалентно связывали с антителом hD12 в случайных положениях, занимаемых остатком цистеина. Соответственно, этот способ был обозначен как стохастическая конъюгация.

Полученные в результате конъюгаты антитело hD12-лекарство (т.е. hD12-II (антитело hD12, присоединенное к нагрузке химической формулы II); hD12-IV (антитело hD12, присоединенное к нагрузке химической формулы IV); hD12-VI (антитело hD12, присоединенное к нагрузке химической формулы IV); hD12-VII (антитело hD12, присоединенное к нагрузке химической формулы VII), а hD12-XI (антитело hD12, присоединенное к нагрузке химической формулы XI)) анализировали на связывание с присоединенным к планшету cMET с помощью ИФА. Деносумаб, конъюгированный с каждой из пяти нагрузок, использовали в качестве отрицательного контроля, поскольку моноклональное антитело Деносумаб специфически связывается с лигандом RANK (RANKL) и не связывается с cMET. Результаты исследования связывания ИФА показаны на фиг. 17A и 17B. Не было значительных различий в связывании 5 разных конъюгатов лекарственного средства hD12 с cMET. Конъюгаты Деносумаба изотипического контроля не связывались с cMET, как ожидалось.

Материалы: 384-луночные планшеты с высоким связыванием (Thermo Fisher #: 8755), блокирующий буфер (SkyTek Lab # AAA500), рекомбинантный человеческий c-Met-10X His (1,04 мг/мл, внутренний препарат компании, серия # 140924TA), антитело к легкой цепи каппа человека, конъюгированное с пероксидазой хрена (1 мг/мл, Brthyl # AP80-219P), 1x KPL промывающий буфер в воде (20x, 200 мл, KPL # 50-63-01), TMB (100 мл, KPL # 53-00-00), и останавливающий раствор (Cell Signaling # 7002L).

Пример 4. Анализы цитотоксичности

Цитотоксичность пяти конъюгатов антитело hD12-лекарственное средство из Примера 3 тестировали на клетках, экспрессирующих различные уровни поверхностного cMET. Деносумаб, конъюгированный с каждой из пяти типичных нагрузок, использовали в качестве отрицательного контроля (данные не показаны). Конъюгаты деносумаба практически не влияли на лизис клеток в клеточных линиях, экспрессирующих cMET.

Результаты анализа цитотоксичности показаны на фиг. 18A-18E и 19A-19F. Тестируемыми линиями клеток были SNU-1 (ATCC, отсутствие экспрессии cMET, фиг. 18A), SNU-16 (ATCC, средняя экспрессия cMET, фиг. 18B), SNU-620 (KCLB, высокая экспрессия cMET, фиг. 18C), MKN-45 (DSMZ, высокая экспрессия cMET, фиг. 18D), H441 (ATCC, средняя экспрессия cMET, фиг. 19A), H1373 (ATCC, средняя экспрессия cMET, фиг. 19B), H1975 (ATCC, средняя экспрессия cMET, фиг. 19C), SNU-5 (ATCC, высокая экспрессия cMET, фиг. 19D) и H1573 (ATCC, средняя экспрессия cMET, фиг. 19E). hD12-II и hD12-VII показали немного более высокую активность в некоторых линиях клеток, экспрессирующих cMET со средним и высоким уровнем.

Пример 5. Исследования с помощью ксенотрансплантатов

Два исследования с ксенотрансплантатами in vivo проводили для оценки эффективности пяти конъюгатов антитела hD12 и лекарственного средства из Примера 3 (т.е. hD12-VI, hD12-II, hD12-VII и hD12-XI). Следует отметить, что термины hD12-vc-XI, hD12-vc-VI, hD12-vc-II, hD12-vc-VII и hD12-vc-IV, как показано на фиг. 20-22, используются как синонимы с терминами hD12-XI, hD12-VI, hD12-II, hD12-VII и hD12-IV соответственно. Кроме того, Деносумаб-* (например, Деносумаб-II) используется как синоним терминов Деносумаб-vc-* (например, Деносумаб-vc-II), как показано на фигурах. Обозначение «vc» не имеет никакого значения. Термин «Деносумаб-II» относится к моноклональному антителу «Деносумаб», присоединенному к нагрузке химической формулы II.

Первое исследование ксенотрансплантата H1975 in vivo проводили на десяти мышах (Nu/nu: (Charles River)) в каждой группе. Каждую мышь инокулировали клетками H1975 с последующим лечением одним из указанных конъюгатов антитела и лекарства или ФБР. Конъюгаты антитело-лекарство применяли путем однократной внутривенной инъекции в хвостовую вену в день 1. Были протестированы две различные дозы (0,5 мг/кг и 0,125 мг/кг) каждого конъюгата антитела и лекарственного средства. Деносумаб-II использовали в качестве отрицательного контроля. Объем и массу опухоли измеряли 3 раза в неделю. Результаты исследования ксенотрансплантата H1975 in vivo показаны на фиг. 20A-20G.

Все животные хорошо переносили конъюгаты антитела и лекарственного средства. Ни в одной из групп не наблюдалось значительной потери массы тела (например, см. фиг. 20B). hD12-VII показал наивысшую эффективность при обеих концентрациях доз из всех протестированных ADC (фиг. 20A и 20F). hD12-II и hD12-VI были немного менее эффективны в группе с низкой дозой (0,125 мг/кг) (фиг. 20E и 20D), чем hD12-VII. hD12-3315 и hD12-XI были наименее эффективными в группе с низкой дозой (фиг. 20G и 20C). Изотипический контроль Деносумаб-II показал некоторую эффективность в дозе 0,5 мг/кг. Возможно, что Деносумаб показал ингибирование роста опухоли, потому что H1975 имеет сигнальный путь RANK-RANKL (Journal of Thoracic Oncol., 2014, 9 (3) 345-54). Таким образом, все пять конъюгатов лекарственного средства-hD12 показали значительную эффективность против ксенотрансплантатов H1975. hD12-VII, hD12-II и hD12-VI показали самую высокую эффективность лечения, при этом VII немного превзошел два других.

Второе исследование ксенотрансплантата H1373 in vivo было проведено для дополнительной оценки эффективности пяти конъюгатов антитело hD12-лекарственное средство из Примера 3 (т.е. hD12-VI, hD12-II, hD12-VII и hD12-XI). Исследование ксенотрансплантата H1373 in vivo проводили с использованием десяти мышей (Nu/nu: (Charles River)) в каждой группе. Каждую мышь инокулировали клетками H1373 с последующим лечением одним из указанных конъюгатов антитела и лекарственного средства или ФБР. Конъюгаты антитела и лекарственного средства вводили однократно путем внутривенной инъекции в хвостовую вену на день 7. Тестировали две разные дозы (0,5 мг/кг и 0,125 мг/кг) каждого конъюгата антитела и лекарственного средства. Деносумаб-II использовали в качестве отрицательного контроля. Объем и массу опухоли измеряли 3 раза в неделю. Результаты исследования ксенотрансплантата H1373 in vivo показаны на фиг. 21A-213 и 22.

Все животные хорошо переносили конъюгаты антитела и лекарственного средства. Ни в одной из групп не наблюдалось значительной потери массы тела (например, см. фиг. 22). Как видно из первой модели ксенотрансплантата H1975, hD12-VII (фиг. 21D) показал немного лучшую эффективность в группе с низкой дозой (0,125 мг/кг) по сравнению с hD12-II и hD12-VI (фиг. 21C и 21B). hD12-IV был наименее эффективным лекарственным средством, как наблюдалось ранее (фиг. 21E).

Пример 6. Фармакокинетические исследования на мышах

Период полужизни в циркуляции конъюгатов hD12-лекарственного средства из Примера 3 (т.е. hD12-VI, hD12-II, hD12-VII и hD12-XI) оценивали в 5 группах по 3 мыши в течение 72 часов. Каждая группа мышей получала одну внутривенную инъекцию 1 мг/кг одного из hD12-II, hD12-IV, hD12-VI, hD12-XI или Деносумаба-II. Кровь брали через 0,5 часа, 2 часа, 6 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа. Образцы сыворотки были приготовлены и проанализированы на количество каждого из указанных конъюгатов антитела и лекарственного средства (фиг. 23). Сывороточные антитела улавливали анти-Fc-специфическим антителом и выявляли с помощью козьего антитела против человеческого IgG (H + L), конъюгированного с пероксидазой хрена.

Пример 7. Сайт-специфическая конъюгация нагрузки с hD12

Кодирующие области hD12 были мутированы в различных сайтах, чтобы ввести остаток цистеина в константную область тяжелой цепи антитела IgG2, чтобы получить вариант антител hD12 hD12-T289C (T в положении 289, замененный на цистеин), hD12-V442C (V в положение 442, замененный на цистеин), hD12-V282C (V в положении 282, замененный на цистеин), hD12-S119C (S в положении 119, замененный на цистеин). Точки мутации находятся в константной области hD12 и определены в соответствии с системой нумерации ЕС, как описано у Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969). PMID: 5257969. Нагрузка химической формулы II была сайт-специфически конъюгирована с каждым из мутантных остатков цистеина с использованием малеимидной химии. Качество и степень конъюгации оценивали путем определения общего извлечения, содержания агрегатов, содержания мономеров и отношения лекарственное средство-антитело (DAR). Оптимальная конъюгация наблюдалась для конъюгатов hD12-T289C-II, hD12-V442C-II и hD12-V282C-II. Относительную аффинность связывания этих трех сайт-специфических конъюгатов для cMET сравнивали со стохастически конъюгированным hD12-II с использованием ИФА связывания cMET, как описано в Примере 3. Результаты анализа связывания cMET показаны на Фигурах 24A и 24B. Все сайт-специфические соединения успешно связываются с человеческим cMET с аналогичной аффинностью. Сайт-специфические конъюгаты связываются с аналогичной или немного лучшей аффинностью, чем стохастически связанный hD12-II.

Пример 8. Оценка цитотоксичности сайт-специфических конъюгатов с клеточными линиями, экспрессирующими cMET

Авторы изобретения оценили цитотоксическую активность сайт-специфически связанных конъюгатов II (т.е. hD12-T289C-II, hD12-V442C-II и hD12-V282C-II) по сравнению со стохастически связанным hD12-II в качестве эталона, против восьми cMET экспрессирующих клеточных линий SNU-16 (фиг. 25B), SNU-620 (фиг. 25C), MKN-45 (фиг. 25D), NCI-N87 (фиг. 25E), SNU-5 (фиг. 26A), H1373 (фиг. 27A), H1573 (фиг. 27B), H1975 (фиг. 27C) и сМЕТ-отрицательной клеточной линии SNU-1 (фиг. 25A). Результаты цитотоксичности суммированы на фиг. 25F, 26B и 27E. Вводимые дозы указаны на фиг. 25G, 26C и 27D.

Все сайт-специфически конъюгированные антитела показали цитотоксичность, сопоставимую со стохастически связанным контролем hD12-II, против линий клеток MKN-45, SNU-620, SNU-5, SNU-16, NCI-N87 и H1975. Значение EC50 для сайт-специфических конъюгатов не может быть определено для клеточных линий H1373 и H1573 из-за сложных кривых лизиса, которые значительно отличаются от сигмоидальных кривых. Сложная форма кривых лизиса была более выраженной для сайт-специфических конъюгатов и повторялась в двойных экспериментах. В целом цитотоксическая активность сайт-специфических конъюгатов hD12 оказалась лучше, чем у стохастически конъюгированных hD12-II.

Пример 9. Анализ ксенотрансплантата сайт-специфических конъюгатов in vivo

Сайт-специфические конъюгаты hD12-T289C-II, hD12-V442C-II и hD12-V282C-II и стохастически связанный hD12-II оценивали на модели ксенотрансплантата опухоли H1975 (средняя экспрессия cMET). Деносумаб-II использовали в качестве отрицательного контроля. Каждой мыши инокулировали клетки H1975 (день 0) с последующим лечением одним из указанных конъюгатов антитела и лекарственного средства или ФБР. Конъюгаты антитела и лекарственного средства вводили однократно внутривенной инъекцией в хвостовую вену на 14 день после инокуляции опухолевых клеток. Были протестированы две разные дозы (0,5 мг/кг и 0,125 мг/кг) каждого конъюгата антитела и лекарственного средства. Для каждой обработки тестировали по десять мышей. Объем и массу опухоли измеряли 3 раза в неделю. Результаты исследования ксенотрансплантата H1975 in vivo показаны на фиг. 28A-28C.

Все группы высоких доз с сайт-специфическими ADC и стохастически связанным II (0,5 мг/кг) показали высокую эффективность на модели H1975. Опухоли полностью регрессировали (фиг. 28A-28C). Группы с низкой дозой (0,125 мг/кг) показали регресс опухоли с hD12-II (стохастический) и hD12-T289C-II, причем hD12-V422C-II был наиболее эффективным. hD12-V282C-II оказался наименее эффективным. Контрольный Деносумаб показал умеренную эффективность в высокой дозе, что также было замечено в предыдущей модели H1975, протестированной со стохастически конъюгированными ADC. Все вводимые испытуемые препараты хорошо переносились, и значительной потери массы тела не наблюдалось (фиг. 29).

Пример 10. Фармакокинетика у крыс с сайт-специфическими конъюгатами hD12 (определение общих антител)

Период полужизни в кровотоке сайт-специфичных конъюгатов hD12 hD12-V422C-II, hD12-V282C-II и hD12-T289C-II оценивали на крысах в течение 21 дня. Каждая группа крыс (3 крысы на группу) получала одну внутривенную инъекцию 1 мг/кг указанного конъюгата антитела и лекарственного средства (фиг. 30). Кровь брали через 0,5 часа, 2 часа, 6 часов, 24 часа, 48 часов, 72 часа, 168 часов, 312 часов и 480 часов после инъекции. Уровни антител в образцах сыворотки анализировали в ФК ИФА с использованием захватывающего антитела (анти-Fc-специфического) и козьего антитела против человеческого IgG (H + L) - детектирующего антитела с пероксидазой хрена. Результаты суммированы на фиг. 31. Фармакокинетические (ФК) параметры сайт-специфических конъюгатов определяли с помощью программного обеспечения WinNonlin. Все 3 сайт-специфических конъюгата показали сходную форму кривых зависимости концентрации от времени. Расчетный период полужизни составлял от 12 до 18 дней. Варианты нельзя было отличить друг от друга только на основании общих данных фармакокинетики антител. На основании результатов этого эксперимента нет значительных фармакокинетических различий между hD12-V422C-II, hD12-V282C-II и hD12-T289C-II.

Пример 11. Переносимость для приматов, не являющихся людьми

Стохастически связанный hD12-II и сайт-специфические варианты hD12-V282C-II и hD12-T289C-II были протестированы в количествах до 1 мг/кг на переносимость у нечеловеческих приматов. В целом все конъюгаты антитела и лекарственного средства переносились хорошо. К концу исследования (21 день) серьезной потери массы тела не наблюдалось.

Пример 12. Модели, методы и результаты PDX

Ксенотрансплантаты, полученные от пациента (PDX), представляют собой модели рака, где ткань или клетки опухоли пациента имплантируют иммунодефицитной мыши. Модели PDX часто используют для создания среды, напоминающей естественный рост рака, для изучения его прогрессирования и лечения. Для оценки эффективности hD12-T289C-II использовали несколько PDX моделей рака желудка, колоректального рака и рака головы и шеи (H&N) Crown Bio HuPrime (зарегистрированная торговая марка). Были выбраны модели PDX, которые различались по экспрессии c-Met (от низкой до высокой).

Вкратце, самкам бестимусных мышей BALB/c в возрасте 14-15 недель подкожно инокулировали в правый бок фрагмент первичной опухоли человека (рак желудка, колоректальный рак или рак H&N, размером 2-3 мм) для развития опухоли. Мышей рандомизировали и распределяли в группы (6 групп лечения), когда размер опухоли достигал среднего объема 200 мм³. Каждая группа состояла из 10 мышей. Испытуемые вещества вводили внутривенно в виде однократной дозы мышам с опухолью, начиная с 0 дня. При необходимости вводили вторую дозу. Нецелевое антитело (Секукинумаб), связанное с полезной нагрузкой химической формулы II, (Секукинумаб-II) вводили в дозе 1 мг/кг. hD12-T289C-II вводили в виде однократной дозы 1,0 мг/кг, 0,5 мг/кг, 0,25 и 0,125 мг/кг, за исключением случаев, указанных на фиг. 34. В контрольной группе с применением растворителя вводили однократно внутривенно дозу 1x ФБР.

После рандомизации размер опухоли измеряли штангенциркулем дважды в неделю в двух измерениях. Объем опухоли (мм³) рассчитывали по TV = 0,5a x b2, где a и b - длинный и короткий диаметры поверхности опухоли. Массу тела измеряли и регистрировали вместе с измерениями опухоли.

Затем размер опухоли использовали для расчета TGI% по следующей формуле: TGI% = ((среднее(C) - среднее (C0)) - (среднее(T)- среднее(T0)) / (среднее(C) - среднее (C0)) * 100%, где T - текущее значение в группе; T0 - текущее начальное значение в группе; C - значение в контрольной группе; C0 - начальное значение в контрольной группе.

Результаты исследований PDX показаны на фиг. 32 и 33. Каждая точка данных представляет 1 группу моделей PDX, состоящую из 10 мышей, инокулированных одной опухолью PDX. TGI% рассчитывали, как описано выше. Мышам вводили носитель (ФБР) или Секукинумаб-II в качестве отрицательного контроля. Объем опухоли (ось Y) определяли с течением времени (т.е. дни, ось X; фиг. 33C). Результаты на фиг. 32 и 33 показывают, что hD12-T289C-II эффективно ингибирует рост опухолевых тканей человека, происходящих от рака желудка, колоректального рака или рака H&N, дозозависимым образом.

Пример 13

У человека отмечены множественные метастатические карциномы размером 2 см или более, присутствующие в печени и легких. Биопсию проводили, чтобы определить, экспрессируют ли клетки карциномы cMET на своей клеточной поверхности. Наличие экспрессии cMET на клеточной поверхности подтверждают результатами биопсии.

Субъекту-человеку вводят описанный в настоящей заявке конъюгат связывающего агента и лекарственного средства, который специфически связывается с внеклеточным доменом cMET человека. Связывающий агент при необходимости содержит константные области тяжелой цепи каппа и IgG2 человека, вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 41 и вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 98. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства вводят в дозе 15 мг/кг внутривенно в объеме 100 мл в течение 1 часа один раз в сутки в течение шести недель. Наличие, размер и жизнеспособность опухолей определяют с помощью контрольной биопсии и ультразвукового исследования. Размер и количество опухолей значительно уменьшаются после 2 недель лечения. Установлено, что после шести недель лечения у субъекта наступает ремиссия.

Пример 14

У человека отмечена колоректальная аденокарцинома, имеющая солидную опухоль диаметром 2 см. Субъекту-человеку вводят описанный в настоящей заявке конъюгат связывающего агента и лекарственного средства. Связывающий агент из конъюгата связывающего агента и лекарственного средства представляет собой моноклональное гуманизированное антитело изотипа IgG2, содержащее вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 47 и вариабельную область гуманизированной тяжелой цепи SEQ ID NO: 108. Лекарственное средство из конъюгата связывающего агента и лекарственного средства представляет собой полезную нагрузку, имеющую структуру химической формулы II. Связывающий агент вводят в дозе 1 мг/кг внутривенно в объеме 50 мл в течение 30 минут один раз в день в течение шести недель. После двух недель лечения размер опухоли уменьшается более чем на 50%. Установлено, что после шести недель лечения у субъекта наступила ремиссия.

Пример 15. Последовательности cMET

SEQ ID NO: 109 (cMET человека - UniProtKB - P08581 (MET_HUMAN)).

* Остатки E168 и N375 выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.

SEQ ID NO: 110 (Rat cMET-UniProtKB - P97523 (MET_RAT))

SEQ ID NO: 111 (Мышиный cMET- UniProtKB - P16056 (MET_MOUSE))

SEQ ID NO: 112 (Собачий cMET)

SEQ ID NO: 113 (Macaca mulatta, Rhesus cMET - NCBI эталонная последовательность: NP_001162100.1)

Пример 16. Гуманизированное моноклональное антитело hD12

SEQ ID NO: 114. Последовательность тяжелой цепи hD12

SEQ ID: 115. Последовательность легкой цепи hD12

SEQ ID NO: 116. Последовательность тяжелой цепи hD12 T289C (Остаток C289 подчеркнут)

Каждый патент, заявка на патент, публикация или любая другая ссылка или документ, цитируемые в настоящей заявке, включены посредством ссылки во всей полноте. В случае конфликта описание, включая определения, будет иметь преимущественную силу.

Цитирование любого патента, заявки на патент, публикации или любого другого документа не является признанием того, что что-либо из вышеперечисленного является уместным предшествующим уровнем техники, а также не является признанием в отношении содержания или даты этих публикаций или документов.

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которой принадлежит это изобретение. Хотя способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным здесь, могут быть использованы на практике или при тестировании настоящего изобретения, подходящие методы и материалы описаны в настоящей заявке.

Все раскрытые в настоящей заявке признаки могут быть объединены в любой комбинации. Каждая функция, раскрытая в описании, может быть заменена альтернативной функцией, служащей той же, эквивалентной или аналогичной цели. Таким образом, если специально не указано иное, раскрытые признаки (например, антитела) являются примером рода эквивалентных или подобных признаков.

В контексте настоящего описания все числовые значения или числовые диапазоны включают целые числа в пределах таких диапазонов и доли значений или целые числа в пределах диапазонов, если контекст явно не указывает иное. Кроме того, когда здесь описывается список значений (например, около 50%, 60%, 70%, 80%, 85% или 86%), список включает все их промежуточные и дробные значения (например, 54%, 85,4%). Таким образом, для иллюстрации ссылка на 80% или более идентичности включает 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% и т.д., а также 81,1%, 81,2%, 81,3%, 81,4%, 81,5% и т.д., 82,1%, 82,2%, 82,3%, 82,4%, 82,5% и т.д.

Ссылка на целое число с числом более (больше) или менее, чем включает любое число, большее или меньшее, чем справочное число, соответственно. Таким образом, например, ссылка менее 100 включает 99, 98, 97 и т.д. вплоть до числа один (1); а менее 10 включает 9, 8, 7 и т. д. вплоть до числа один (1).

В контексте настоящего описания все числовые значения или диапазоны включают доли значений и целые числа в таких диапазонах и доли целых чисел в таких диапазонах, если контекст явно не указывает иное. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на числовой диапазон, такой как 1-10, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, а также 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5, а т. д. Ссылка на диапазон от 1 до 50, следовательно, включает 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, и т.д., до 50 включительно, а также 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5 и т.д.; 2,1; 2,2; 2,3; 2,4; 2,5 и т. д.

Ссылка на серию диапазонов включает диапазоны, которые объединяют значения границ разных диапазонов внутри серии. Таким образом, для иллюстрации, ссылка на ряд диапазонов, например, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1000, 1000-1500, 1500-2000, 2000-2500, 2500-3000, 3000-3500, 3500-4000, 4000-4500, 4500-5000, 5500-6000, 6000-7000, 7000-8000 или 8000-9000, включает диапазоны 10-50, 50-100, 100-1000, 1000-3000, 2000-4000, и т.д.

В вышеизложенное могут быть внесены изменения без отступления от основных аспектов технологии. Хотя технология была подробно описана со ссылкой на один или несколько конкретных вариантов осуществления, специалисты в данной области техники поймут, что могут быть внесены изменения в варианты осуществления, конкретно раскрытые в этой заявке, однако эти модификации и улучшения находятся в пределах объема и сущности технологии.

Изобретение в целом раскрывается в настоящей заявке с использованием утвердительного языка для описания многочисленных вариантов осуществления и аспектов. Изобретение также конкретно включает варианты осуществления, в которых конкретный объект исключен, полностью или частично, например, вещества или материалы, этапы и условия способа, протоколы или процедуры. Например, в определенных вариантах осуществления или аспектах изобретения материалы и/или этапы способа исключены. Таким образом, даже если изобретение в целом не выражено здесь в том смысле, что оно не включает аспекты, которые не исключены явно в изобретении, тем не менее они раскрыты в настоящей заявке.

Технология, иллюстративно описанная в данном документе, подходящим образом может быть реализована на практике в отсутствие какого-либо элемента (элементов), конкретно не раскрытого в данном документе. Таким образом, например, в каждом случае в данном документе любой из терминов «содержащий», «состоящий по существу из» и «состоящий из» может быть заменен любым из двух других терминов. Термины и выражения, которые использовались, применяются в качестве терминов описания, а не ограничения, и использование таких терминов и выражений не исключает каких-либо эквивалентов показанных и описанных функций или их частей, и в пределах объема возможны различные модификации заявленной технологии. Термины единственного числа могут относиться к одному из или к множеству элементов, которые они модифицируют (например, «реагент» может означать один или несколько реагентов), если контекстуально не ясно, один из элементов или более одного элементов описывается. Используемый в настоящей заявке термин «примерно» относится к значению в пределах 10% от базового параметра (т.е. плюс или минус 10%), а использование термина «примерно» в начале строки значений изменяет каждое из значений (т.е. «примерно 1, 2 и 3» относятся к примерно 1, примерно 2 и примерно 3). Например, масса «около 100 граммов» может включать массы от 90 до 110 граммов. Термин «по существу» в контексте настоящего описания относится к модификатору значения, означающему «по меньшей мере 95%», «по меньшей мере 96%», «по меньшей мере 97%», «по меньшей мере 98%» или «по меньшей мере 99%». и может включать 100%. Например, композиция, которая практически не содержит X, может включать менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2% или менее 1% X, и/или X может отсутствовать или не обнаруживается в составе.

Таким образом, следует понимать, что, хотя настоящая технология была специально раскрыта в примерных вариантах осуществления и дополнительных функциях, специалисты в данной области могут прибегать к модификации и изменению раскрытых здесь концепций, и такие модификации и вариации рассматриваются в объеме данной технологии.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> MITSUBISHI TANABE PHARMA CORPORATION

<120> DRUG CONJUGATES OF cMET MONOCLONAL BINDING AGENTS, AND USES

THEREOF

<130> 674562

<150> US 62/649078

<151> 2018-03-28

<160> 116

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Gln Thr Ile Val His Gly Thr Gly Asn Thr Tyr

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 3

Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 4

Glu Asn Val Gly Thr Tyr

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 6

Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ile Asn Gln Lys Asn Tyr

1 5 10

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 7

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Asn Thr Leu Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 6

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 8

Glu Asn Ile Tyr Asn Thr

1 5

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 9

Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Asn Tyr Leu Tyr

1 5 10

<210> 10

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 10

Ser Ser Val Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 11

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn Tyr Leu Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 12

Ser Ser Val Ser Ser Asn Tyr

1 5

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> X is S or T

<400> 13

Ser Ala Ser Ser Ser Val Xaa Ser Asn Tyr Leu Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

Gln Ser Val Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 15

Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Asn Tyr Leu Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 16

Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 17

<400> 17

000

<210> 18

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 18

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 19

<400> 19

000

<210> 20

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 20

Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 21

<400> 21

000

<210> 22

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 22

Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp

1 5

<210> 23

<400> 23

000

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 24

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 25

<400> 25

000

<210> 26

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 26

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

1 5 10 15

Glu Ile Lys Arg

20

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 27

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 28

<211> 20

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 28

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

1 5 10 15

Glu Leu Lys Arg

20

<210> 29

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 29

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 30

Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

1 5 10 15

Glu Leu Lys

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 31

Gln Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 32

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 32

Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

1 5 10 15

Glu Ile Lys

<210> 33

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 33

Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 34

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 34

His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu

1 5 10 15

Glu Ile Lys

<210> 35

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 35

His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Thr

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa is His, Gln or Gly

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is Trp, Ser or Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa is Ser or Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa is Ser or Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa is Pro or Leu

<400> 36

Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Tyr Pro Xaa Thr

1 5

<210> 37

<211> 113

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 37

Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Thr Ile Val His Gly

20 25 30

Thr Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg

<210> 38

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 38

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala

65 70 75 80

Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 39

<211> 114

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 39

Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Ile Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln

85 90 95

Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

100 105 110

Lys Arg

<210> 40

<211> 110

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 40

Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser

1 5 10 15

Val Gly Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr

20 25 30

Asn Thr Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu

35 40 45

Leu Val Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu

65 70 75 80

Gln Ser Glu Asp Phe Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr

85 90 95

Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

<210> 41

<211> 109

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 41

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 42

<211> 109

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 42

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 43

<211> 109

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 43

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 44

<211> 108

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (38)..(38)

<223> Xaa is His or Gln

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (61)..(61)

<223> Xaa is Ala or Arg

<400> 44

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Xaa Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Xaa Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala

65 70 75 80

Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 45

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Light Chain

<400> 45

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 46

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Light Chain

<400> 46

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 47

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Light Chain

<400> 47

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 48

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Light Chain

<400> 48

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 49

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Light Chain

<400> 49

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 50

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 50

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val Asn

1 5 10

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 51

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 52

Gly Phe Asn Ile Asn Asp Tyr Phe Met His

1 5 10

<210> 53

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 53

Phe Asn Ile Asn Asp Tyr Phe

1 5

<210> 54

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 54

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Ser

1 5 10

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 55

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 56

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn Met Asp

1 5 10

<210> 57

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 57

Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Asn

1 5

<210> 58

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 58

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His

1 5 10

<210> 59

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 59

Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 60

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (6)..(6)

<223> Xaa is Asp or Ser

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (8)..(8)

<223> Xaa is Asn or Trp

<400> 60

Gly Tyr Thr Phe Thr Xaa Tyr Xaa

1 5

<210> 61

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa is Tyr or Phe

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa is Asp or Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa is Asn, Trp or Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa is His or Ser

<400> 61

Gly Xaa Thr Phe Thr Xaa Tyr Xaa Met Xaa

1 5 10

<210> 62

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 62

Leu Ile Trp Gly Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 63

Ile Trp Gly Gly Gly Asp Thr

1 5

<210> 64

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 64

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 65

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 65

Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr

1 5

<210> 66

<211> 19

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 66

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Lys Tyr Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 67

Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr

1 5 10

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 68

Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 69

Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr

1 5

<210> 70

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 70

Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 71

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 71

Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr

1 5

<210> 72

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 72

Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 73

Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr

1 5

<210> 74

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 74

Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 75

Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Ile

1 5

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa is Ile or Thr

<400> 76

Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Xaa

1 5

<210> 77

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> Xaa is Tyr or Asp

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa is Lys or Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa is Asn or Tyr

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa is Thr or Ile

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> Xaa is Ala or Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> Xaa is Gln or Lys

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> Xaa is Gly or Asp

<400> 77

Xaa Ile Xaa Pro Ser Thr Asp Xaa Xaa Glu Tyr Xaa Gln Lys Phe Xaa

1 5 10 15

Xaa

<210> 78

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 78

Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 79

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 79

Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 80

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 80

Asp Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr

1 5

<210> 81

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 81

Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Leu Arg Glu Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 82

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 82

Arg Gly Gly Asn Tyr Leu Arg Glu Ser Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 83

Cys Ser Lys Asp Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 84

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 84

Asp Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 85

<211> 18

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 85

Arg Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met

1 5 10 15

Asp Tyr

<210> 86

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 86

Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 87

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 87

Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 88

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 88

Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 89

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 89

Cys Val Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 90

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 90

Cys Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Phe Pro Leu Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 91

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 91

Arg Ser Tyr Gly Asn Phe Pro Leu Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 92

<211> 13

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> Xaa is Ala or Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> Xaa is Phe or Tyr

<400> 92

Cys Xaa Arg Ser Tyr Gly Asn Xaa Pro Leu Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 93

<211> 11

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa is Phe or Tyr

<400> 93

Arg Ser Tyr Gly Asn Xaa Pro Leu Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 94

<211> 117

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 94

Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Leu Ile Trp Gly Gly Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Glu Thr Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Tyr Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 95

<211> 118

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 95

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Lys Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ser Lys Asp Arg Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 96

<211> 127

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 96

Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg

1 5 10 15

Pro Gly Ala Leu Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile

20 25 30

Asn Asp Tyr Phe Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Ile Tyr Asp

50 55 60

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Ser Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

65 70 75 80

Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Asn Tyr Leu Arg Glu Ser Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 97

<211> 127

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 97

Val Leu Ser Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

1 5 10 15

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

20 25 30

Thr Asp Tyr Asn Met Asp Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu

35 40 45

Glu Trp Ile Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn

50 55 60

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser

65 70 75 80

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

85 90 95

Tyr Tyr Arg Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Gly Ser Ser Arg Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 98

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 98

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 99

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 99

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 100

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 100

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 101

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 101

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 102

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 102

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Thr Asp Tyr Ile Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Gly Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Phe Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 103

<211> 119

<212> PRT

<213> Mus musculus

<220>

<221> misc_feature

<222> (23)..(23)

<223> Xaa is Lys or Arg

<220>

<221> misc_feature

<222> (46)..(46)

<223> Xaa is Glu or Asp

<220>

<221> misc_feature

<222> (52)..(52)

<223> Xaa is Lys or Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (57)..(57)

<223> Xaa is Tyr or Asn

<220>

<221> misc_feature

<222> (58)..(58)

<223> Xaa is Thr or Ile

<220>

<221> misc_feature

<222> (77)..(77)

<223> Xaa is Ser or Thr

<220>

<221> misc_feature

<222> (97)..(97)

<223> Xaa is Ala or Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (103)..(103)

<223> Xaa is Tyr or Phe

<400> 103

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Xaa Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Xaa Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Xaa Pro Ser Thr Asp Xaa Xaa Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Xaa Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Xaa Arg Ser Tyr Gly Asn Xaa Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 104

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Heavy Chain

<400> 104

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 105

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Heavy Chain

<400> 105

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Asn Leu Ile Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 106

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Heavy Chain

<400> 106

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Ala Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 107

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Heavy Chain

<400> 107

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 108

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Humanized Heavy Chain

<400> 108

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 109

<211> 1390

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 109

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro Asp

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Ile Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Thr Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Ile Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Leu Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Asn Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu Asn

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Thr Ala

930 935 940

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Phe Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln

945 950 955 960

Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His

965 970 975

Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr

980 985 990

Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro

995 1000 1005

Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln

1010 1015 1020

Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly

1025 1030 1035

Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile

1040 1045 1050

Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His

1055 1060 1065

Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val

1070 1075 1080

Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu

1085 1090 1095

Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn

1100 1105 1110

Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly

1115 1120 1125

Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu

1130 1135 1140

Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu Pro

1145 1150 1155

Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu Thr

1160 1165 1170

His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln Val

1175 1180 1185

Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg

1190 1195 1200

Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val

1205 1210 1215

Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu

1220 1225 1230

Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys

1235 1240 1245

Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys

1250 1255 1260

Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr

1265 1270 1275

Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr

1280 1285 1290

Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys

1295 1300 1305

Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys

1310 1315 1320

Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser

1325 1330 1335

Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn

1340 1345 1350

Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu

1355 1360 1365

Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp Thr Arg Pro

1370 1375 1380

Ala Ser Phe Trp Glu Thr Ser

1385 1390

<210> 110

<211> 1382

<212> PRT

<213> Rattus norvegicus

<400> 110

Met Lys Ala Pro Thr Ala Leu Ala Pro Gly Ile Leu Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ala Gln Arg Ser His Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Val Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile His Asn Val Val Leu Pro Gly His His Ile Tyr Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Asp Lys Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ser Glu Phe Lys Thr Gly Pro Val Val Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Val Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Val Asn Met Ala Leu Leu Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Leu Pro Pro Asp Asn Ala Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Met Phe Ser Pro Leu Ala Glu Glu Glu Ser Gly Gln Cys Pro Asp Cys

165 170 175

Val Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Leu Ser Glu Lys Asp Arg

180 185 190

Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Pro Pro

195 200 205

Asp Tyr Ser Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Gln

210 215 220

Asp Gly Phe Lys Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro

225 230 235 240

Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Ile His Ala Phe Glu Ser

245 250 255

Asn His Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Lys Glu Thr Leu Asp Ala

260 265 270

Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Val Asp Ser Gly

275 280 285

Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys

290 295 300

Arg Arg Lys Arg Ser Thr Arg Glu Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala

305 310 315 320

Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Asn Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ala

325 330 335

Ser Pro Tyr Asp Asp Ile Leu Tyr Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro

340 345 350

Asp Ser Ala Glu Pro Met Asn Arg Ser Ala Val Cys Ala Phe Pro Ile

355 360 365

Lys Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val

370 375 380

Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn

385 390 395 400

Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Val Arg Ser Asp Glu

405 410 415

Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met

420 425 430

Gly Arg Leu Asn His Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys

435 440 445

Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met

450 455 460

Gln Val Val Leu Ser Arg Thr Ala His Phe Thr Pro His Val Asn Phe

465 470 475 480

Leu Leu Asp Ser Tyr Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Pro

485 490 495

Ser Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Val Thr Gly Lys Lys Ile Thr

500 505 510

Lys Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Gly His Phe Gln Ser Cys Ser

515 520 525

Gln Cys Leu Ser Pro Pro Tyr Phe Ile Gln Cys Gly Trp Cys His Asn

530 535 540

Arg Cys Val His Ser Asn Glu Cys Pro Ser Gly Thr Trp Thr Gln Glu

545 550 555 560

Ile Cys Leu Pro Ala Val Tyr Lys Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu

565 570 575

Glu Gly Gly Thr Met Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Lys

580 585 590

Lys Asn Asn Lys Phe Asp Leu Arg Lys Thr Lys Val Leu Leu Gly Asn

595 600 605

Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Thr Asn Thr Leu Lys

610 615 620

Cys Thr Val Gly Pro Ala Met Ser Glu His Phe Asn Val Ser Val Ile

625 630 635 640

Val Ser Asn Ser Arg Glu Thr Thr Gln Tyr Ser Ala Phe Ser Tyr Val

645 650 655

Asp Pro Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Arg Tyr Gly Pro His Ala Gly

660 665 670

Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser

675 680 685

Arg His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser

690 695 700

Asp Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Gly His Thr Val Ser Ala Glu

705 710 715 720

Phe Pro Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asp Arg Val Thr Ser Ser

725 730 735

Phe Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Val Val Ser Glu Ile His Pro Thr Lys

740 745 750

Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Ile Gly Lys Asn Leu

755 760 765

Asn Ser Val Ser Thr Pro Lys Leu Val Ile Glu Val His Asp Val Gly

770 775 780

Val Asn Tyr Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Ser Ser Glu Ile Ile

785 790 795 800

Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Arg Gln Leu Asp Leu Gln Leu Pro Leu

805 810 815

Lys Thr Lys Ala Phe Phe Leu Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys His Phe

820 825 830

Asp Leu Thr Tyr Val His Asp Pro Met Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro

835 840 845

Val Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Val Glu Ile Lys Gly Asp

850 855 860

Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn

865 870 875 880

Lys Ser Cys Glu Asn Leu His Trp His Ser Glu Ala Leu Leu Cys Thr

885 890 895

Val Pro Ser Asp Leu Leu Lys Leu Asn Gly Gly Glu Leu Asn Ile Glu

900 905 910

Trp Lys Gln Ala Val Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln

915 920 925

Pro Asp Gln Asn Phe Ala Gly Leu Ile Ile Gly Ala Val Ser Ile Ser

930 935 940

Val Val Val Leu Leu Val Ser Gly Leu Phe Leu Trp Leu Arg Lys Arg

945 950 955 960

Lys His Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val

965 970 975

His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro

980 985 990

Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe

995 1000 1005

Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ala Cys Arg

1010 1015 1020

Gln Val Gln Tyr Leu Leu Thr Asp Leu Ser Pro Ile Leu Thr Ser

1025 1030 1035

Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His

1040 1045 1050

Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Pro

1055 1060 1065

His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu

1070 1075 1080

Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu

1085 1090 1095

Leu Asp Ser Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu

1100 1105 1110

Asn Arg Ile Thr Asp Ile Glu Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu

1115 1120 1125

Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu

1130 1135 1140

Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu

1145 1150 1155

Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu

1160 1165 1170

Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln

1175 1180 1185

Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Val Ser Lys Lys Phe Val His

1190 1195 1200

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr

1205 1210 1215

Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys

1220 1225 1230

Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val

1235 1240 1245

Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr

1250 1255 1260

Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met

1265 1270 1275

Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile

1280 1285 1290

Thr Ile Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr

1295 1300 1305

Cys Pro Asp Ala Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro

1310 1315 1320

Lys Ala Glu Met Arg Pro Ser Val Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile

1325 1330 1335

Ser Ser Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val

1340 1345 1350

Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser

1355 1360 1365

Leu Leu Pro Ser Gln Asp Asn Ile Asp Gly Glu Ala Asn Thr

1370 1375 1380

<210> 111

<211> 1379

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 111

Met Lys Ala Pro Thr Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Gln Arg Ser His Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Val Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Val Leu His Gly His His Ile Tyr Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Asp Lys Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ser Glu Phe Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Leu

85 90 95

Pro Cys Arg Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Ser Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Leu Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Leu Pro Pro Asp Asn Ser Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Met Phe Ser Pro Glu Glu Glu Ser Gly Gln Cys Pro Asp Cys Val Val

165 170 175

Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Leu Ser Glu Lys Asp Arg Phe Ile

180 185 190

Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Pro Pro Gly Tyr

195 200 205

Ser Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Gln Asp Gly

210 215 220

Phe Lys Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu Phe

225 230 235 240

Leu Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Ile His Ala Phe Glu Ser Asn His

245 250 255

Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Lys Glu Thr Leu Asp Ala Gln Thr

260 265 270

Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Val Asp Ser Gly Leu His

275 280 285

Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg Arg

290 295 300

Lys Arg Ser Thr Arg Glu Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala Tyr

305 310 315 320

Val Ser Lys Pro Gly Ala Asn Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ala Ser Pro

325 330 335

Ser Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp Ser

340 345 350

Ala Glu Pro Val Asn Arg Ser Ala Val Cys Ala Phe Pro Ile Lys Tyr

355 360 365

Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg Cys

370 375 380

Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg Thr

385 390 395 400

Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Ser Asp Glu Tyr Arg

405 410 415

Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly Arg

420 425 430

Leu Asn Gln Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys Gly Asp

435 440 445

Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln Val

450 455 460

Val Leu Ser Arg Thr Ala His Leu Thr Pro His Val Asn Phe Leu Leu

465 470 475 480

Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Pro Ser Asn

485 490 495

Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Val Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys Ile

500 505 510

Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Gly His Phe Gln Ser Cys Ser Gln Cys

515 520 525

Leu Ser Ala Pro Tyr Phe Ile Gln Cys Gly Trp Cys His Asn Gln Cys

530 535 540

Val Arg Phe Asp Glu Cys Pro Ser Gly Thr Trp Thr Gln Glu Ile Cys

545 550 555 560

Leu Pro Ala Val Tyr Lys Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu Glu Gly

565 570 575

Gly Thr Val Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Lys Asn

580 585 590

Asn Lys Phe Asp Leu Arg Lys Thr Lys Val Leu Leu Gly Asn Glu Ser

595 600 605

Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Thr Asn Thr Leu Lys Cys Thr

610 615 620

Val Gly Pro Ala Met Ser Glu His Phe Asn Val Ser Val Ile Ile Ser

625 630 635 640

Asn Ser Arg Glu Thr Thr Gln Tyr Ser Ala Phe Ser Tyr Val Asp Pro

645 650 655

Val Ile Thr Ser Ile Ser Pro Arg Tyr Gly Pro Gln Ala Gly Gly Thr

660 665 670

Leu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg His

675 680 685

Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asp Ser

690 695 700

Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Thr Ser Asp Glu Phe Pro

705 710 715 720

Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ser Phe Ser

725 730 735

Tyr Arg Glu Asp Pro Val Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser Phe

740 745 750

Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Ile Gly Lys Thr Leu Asn Ser

755 760 765

Val Ser Leu Pro Lys Leu Val Ile Asp Val His Glu Val Gly Val Asn

770 775 780

Tyr Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys Cys

785 790 795 800

Thr Thr Pro Ser Leu Lys Gln Leu Gly Leu Gln Leu Pro Leu Lys Thr

805 810 815

Lys Ala Phe Phe Leu Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys His Phe Asp Leu

820 825 830

Thr Tyr Val His Asn Pro Val Phe Glu Pro Phe Glu Lys Pro Val Met

835 840 845

Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Val Glu Ile Lys Gly Asn Asn Ile

850 855 860

Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Gln Ser

865 870 875 880

Cys Glu Ser Leu His Trp His Ser Gly Ala Val Leu Cys Thr Val Pro

885 890 895

Ser Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys Gln

900 905 910

Ala Val Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp Gln

915 920 925

Asn Phe Ala Gly Leu Ile Ile Gly Ala Val Ser Ile Ser Val Val Val

930 935 940

Leu Leu Leu Ser Gly Leu Phe Leu Trp Met Arg Lys Arg Lys His Lys

945 950 955 960

Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His Thr Pro

965 970 975

His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr Thr Glu

980 985 990

Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro Glu Asp

995 1000 1005

Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ala Cys Arg Gln Val Gln

1010 1015 1020

Tyr Pro Leu Thr Asp Leu Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly Asp Ser

1025 1030 1035

Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile Asp Leu

1040 1045 1050

Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His Val Val

1055 1060 1065

Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val Ile Gly

1070 1075 1080

Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu Asp Asn

1085 1090 1095

Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn Arg Ile

1100 1105 1110

Thr Asp Ile Glu Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly Ile Ile

1115 1120 1125

Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu Gly Ile

1130 1135 1140

Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu Pro Tyr Met

1145 1150 1155

Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu Thr His Asn

1160 1165 1170

Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln Val Ala Lys

1175 1180 1185

Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg Asp Leu

1190 1195 1200

Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val Lys Val

1205 1210 1215

Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu Tyr Tyr

1220 1225 1230

Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys Trp Met

1235 1240 1245

Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys Ser Asp

1250 1255 1260

Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr Arg Gly

1265 1270 1275

Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr Ile Tyr

1280 1285 1290

Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys Pro Asp

1295 1300 1305

Ala Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys Ala Glu

1310 1315 1320

Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser Ser Ile

1325 1330 1335

Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn Ala Thr

1340 1345 1350

Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu Leu Pro

1355 1360 1365

Ser Gln Asp Asn Ile Asp Gly Glu Gly Asn Thr

1370 1375

<210> 112

<211> 1382

<212> PRT

<213> Canis lupus

<400> 112

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Ala Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Lys Ser Tyr Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Val Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Pro Ile Gln Asn Val Val Leu His Lys His His Ile Tyr Leu

50 55 60

Gly Ala Val Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Asp Lys Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Ser

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser His Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Glu Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Leu Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val His Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Ile Leu Pro Pro Ser Asn Ile Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Met Tyr Ser Ser Gln Ala Asp Glu Glu Pro Ser Gln Cys Pro Asp Cys

165 170 175

Val Val Ser Ala Leu Gly Thr Lys Val Leu Ile Ser Glu Lys Asp Arg

180 185 190

Phe Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Asp His Pro

195 200 205

Asp His Ser Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Gln

210 215 220

Asp Gly Phe Lys Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro

225 230 235 240

Glu Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Val His Ala Phe Glu Ser

245 250 255

Asn His Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asp Ala

260 265 270

Gln Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Val Asp Ser Gly

275 280 285

Leu His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys

290 295 300

Arg Arg Lys Arg Ser Thr Arg Glu Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala

305 310 315 320

Ala Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala His Leu Ala Lys Gln Ile Gly Ala

325 330 335

Asn Leu Asn Asp Asp Ile Leu Tyr Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro

340 345 350

Asp Ser Ala Glu Pro Met Asn Arg Ser Ala Val Cys Ala Phe Pro Ile

355 360 365

Lys Tyr Val Asn Glu Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val

370 375 380

Arg Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn

385 390 395 400

Arg Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Asn Asp Glu

405 410 415

Tyr Arg Thr Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met

420 425 430

Gly Gln Phe Asn Gln Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Ile Lys

435 440 445

Gly Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met

450 455 460

Gln Val Val Val Ser Arg Ser Gly Leu Ser Thr Pro His Val Asn Phe

465 470 475 480

Arg Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Ala Ile Val Glu His Pro

485 490 495

Leu Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Val Thr Gly Lys Lys Ile Thr

500 505 510

Arg Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Glu His Phe Gln Ser Cys Ser

515 520 525

Gln Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp

530 535 540

Arg Cys Val His Leu Glu Glu Cys Pro Thr Gly Ala Trp Thr Gln Glu

545 550 555 560

Val Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Glu Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu

565 570 575

Glu Gly Gly Thr Val Leu Thr Val Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg

580 585 590

Arg Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Lys Val Phe Leu Gly Asn

595 600 605

Glu Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Thr Asn Met Leu Lys

610 615 620

Cys Thr Val Gly Pro Ala Val Asn Glu His Phe Asn Ile Ser Ile Ile

625 630 635 640

Ile Ser Asn Gly Arg Gly Thr Ala Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val

645 650 655

Asp Pro Ile Ile Thr Ser Ile Ser Pro Ser Tyr Gly Pro Lys Asn Gly

660 665 670

Gly Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser

675 680 685

Arg His Ile Ser Met Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser

690 695 700

Asp Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Ala Thr Ala Thr Glu

705 710 715 720

Phe Pro Ile Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Met Asn Ser

725 730 735

Phe Ser Tyr Gln Glu Asp Pro Ile Val Tyr Ala Ile His Pro Thr Lys

740 745 750

Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Ala Val Gly Lys Asn Leu

755 760 765

Asn Ser Val Ser Val Leu Arg Met Val Ile Asp Val His Glu Thr Arg

770 775 780

Arg Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile

785 790 795 800

Cys Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu

805 810 815

Lys Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile His Ser Lys Tyr Phe

820 825 830

Asp Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro

835 840 845

Val Met Ile Ser Ile Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn

850 855 860

Asp Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn

865 870 875 880

Lys Ser Cys Glu Thr Ile Tyr Ser Asp Ser Lys Ala Val Leu Cys Lys

885 890 895

Val Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Asn Glu Leu Asn Ile Glu Trp

900 905 910

Lys Gln Ala Val Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro

915 920 925

Asp Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Ile Ser Ile Ser Thr

930 935 940

Ile Val Leu Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Trp Leu Lys Arg Lys Lys

945 950 955 960

Gln Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val

965 970 975

His Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro

980 985 990

Thr Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe

995 1000 1005

Pro Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg

1010 1015 1020

Gln Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Leu Ser Pro Met Leu Thr Ser

1025 1030 1035

Gly Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His

1040 1045 1050

Ile Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln

1055 1060 1065

His Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu

1070 1075 1080

Val Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu

1085 1090 1095

Leu Asp Asn Asp Asp Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu

1100 1105 1110

Asn Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu

1115 1120 1125

Gly Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu

1130 1135 1140

Leu Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu

1145 1150 1155

Pro Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu

1160 1165 1170

Thr His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln

1175 1180 1185

Val Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His

1190 1195 1200

Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr

1205 1210 1215

Val Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys

1220 1225 1230

Glu Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val

1235 1240 1245

Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr

1250 1255 1260

Lys Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met

1265 1270 1275

Thr Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile

1280 1285 1290

Thr Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr

1295 1300 1305

Cys Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro

1310 1315 1320

Arg Ala Glu Leu Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile

1325 1330 1335

Ser Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val

1340 1345 1350

Asn Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser

1355 1360 1365

Leu Leu Ser Ser Gln Asp Asn Ile Asp Gly Glu Gly Asp Thr

1370 1375 1380

<210> 113

<211> 1381

<212> PRT

<213> Macaca mulatta

<400> 113

Met Lys Ala Pro Ala Val Leu Val Pro Gly Ile Leu Val Leu Leu Phe

1 5 10 15

Thr Leu Val Gln Arg Ser Asn Gly Glu Cys Lys Glu Ala Leu Ala Lys

20 25 30

Ser Glu Met Asn Val Asn Met Lys Tyr Gln Leu Pro Asn Phe Thr Ala

35 40 45

Glu Thr Ala Ile Gln Asn Val Ile Leu His Glu His His Ile Phe Leu

50 55 60

Gly Ala Thr Asn Tyr Ile Tyr Val Leu Asn Glu Glu Asp Leu Gln Lys

65 70 75 80

Val Ala Glu Tyr Lys Thr Gly Pro Val Leu Glu His Pro Asp Cys Phe

85 90 95

Pro Cys Gln Asp Cys Ser Ser Lys Ala Asn Leu Ser Gly Gly Val Trp

100 105 110

Lys Asp Asn Ile Asn Met Ala Leu Val Val Asp Thr Tyr Tyr Asp Asp

115 120 125

Gln Leu Ile Ser Cys Gly Ser Val Asn Arg Gly Thr Cys Gln Arg His

130 135 140

Val Phe Pro His Asn His Thr Ala Asp Ile Gln Ser Glu Val His Cys

145 150 155 160

Ile Phe Ser Pro Gln Ile Glu Glu Pro Asn Gln Cys Pro Asp Cys Val

165 170 175

Val Ser Ala Leu Gly Ala Lys Val Leu Ser Ser Val Lys Asp Arg Phe

180 185 190

Ile Asn Phe Phe Val Gly Asn Thr Ile Asn Ser Ser Tyr Phe Pro His

195 200 205

His Pro Leu His Ser Ile Ser Val Arg Arg Leu Lys Glu Thr Lys Asp

210 215 220

Gly Phe Met Phe Leu Thr Asp Gln Ser Tyr Ile Asp Val Leu Pro Glu

225 230 235 240

Phe Arg Asp Ser Tyr Pro Ile Lys Tyr Ile His Ala Phe Glu Ser Asn

245 250 255

Asn Phe Ile Tyr Phe Leu Thr Val Gln Arg Glu Thr Leu Asn Ala Gln

260 265 270

Thr Phe His Thr Arg Ile Ile Arg Phe Cys Ser Leu Asn Ser Gly Leu

275 280 285

His Ser Tyr Met Glu Met Pro Leu Glu Cys Ile Leu Thr Glu Lys Arg

290 295 300

Lys Lys Arg Ser Thr Lys Lys Glu Val Phe Asn Ile Leu Gln Ala Ala

305 310 315 320

Tyr Val Ser Lys Pro Gly Ala Gln Leu Ala Arg Gln Ile Gly Ala Ser

325 330 335

Leu Asn Asp Asp Ile Leu Phe Gly Val Phe Ala Gln Ser Lys Pro Asp

340 345 350

Ser Ala Glu Pro Met Asp Arg Ser Ala Met Cys Ala Phe Pro Ile Lys

355 360 365

Tyr Val Asn Asp Phe Phe Asn Lys Ile Val Asn Lys Asn Asn Val Arg

370 375 380

Cys Leu Gln His Phe Tyr Gly Pro Asn His Glu His Cys Phe Asn Arg

385 390 395 400

Thr Leu Leu Arg Asn Ser Ser Gly Cys Glu Ala Arg Arg Asp Glu Tyr

405 410 415

Arg Ala Glu Phe Thr Thr Ala Leu Gln Arg Val Asp Leu Phe Met Gly

420 425 430

Gln Phe Ser Glu Val Leu Leu Thr Ser Ile Ser Thr Phe Val Lys Gly

435 440 445

Asp Leu Thr Ile Ala Asn Leu Gly Thr Ser Glu Gly Arg Phe Met Gln

450 455 460

Val Val Val Ser Arg Ser Gly Pro Ser Thr Pro His Val Asn Phe Leu

465 470 475 480

Leu Asp Ser His Pro Val Ser Pro Glu Val Ile Val Glu His Pro Leu

485 490 495

Asn Gln Asn Gly Tyr Thr Leu Val Val Thr Gly Lys Lys Ile Thr Lys

500 505 510

Ile Pro Leu Asn Gly Leu Gly Cys Arg His Phe Gln Ser Cys Ser Gln

515 520 525

Cys Leu Ser Ala Pro Pro Phe Val Gln Cys Gly Trp Cys His Asp Lys

530 535 540

Cys Val Arg Ser Glu Glu Cys Pro Ser Gly Thr Trp Thr Gln Gln Ile

545 550 555 560

Cys Leu Pro Ala Ile Tyr Lys Val Phe Pro Thr Ser Ala Pro Leu Glu

565 570 575

Gly Gly Thr Arg Leu Thr Ile Cys Gly Trp Asp Phe Gly Phe Arg Arg

580 585 590

Asn Asn Lys Phe Asp Leu Lys Lys Thr Arg Val Leu Leu Gly Asn Glu

595 600 605

Ser Cys Thr Leu Thr Leu Ser Glu Ser Thr Met Asn Thr Leu Lys Cys

610 615 620

Thr Val Gly Pro Ala Met Asn Lys His Phe Asn Met Ser Ile Ile Ile

625 630 635 640

Ser Asn Gly His Gly Thr Thr Gln Tyr Ser Thr Phe Ser Tyr Val Asp

645 650 655

Pro Ile Ile Thr Ser Ile Ser Pro Lys Tyr Gly Pro Met Ala Gly Gly

660 665 670

Thr Leu Leu Thr Leu Thr Gly Asn Tyr Leu Asn Ser Gly Asn Ser Arg

675 680 685

His Ile Ser Ile Gly Gly Lys Thr Cys Thr Leu Lys Ser Val Ser Asn

690 695 700

Ser Ile Leu Glu Cys Tyr Thr Pro Ala Gln Thr Ile Ser Thr Glu Phe

705 710 715 720

Ala Val Lys Leu Lys Ile Asp Leu Ala Asn Arg Glu Thr Ser Ile Phe

725 730 735

Ser Tyr Arg Glu Asp Pro Ile Val Tyr Glu Ile His Pro Thr Lys Ser

740 745 750

Phe Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ile Thr Gly Val Gly Lys Asn Leu His

755 760 765

Ser Val Ser Val Pro Arg Met Val Ile Asn Val His Glu Ala Gly Arg

770 775 780

Asn Phe Thr Val Ala Cys Gln His Arg Ser Asn Ser Glu Ile Ile Cys

785 790 795 800

Cys Thr Thr Pro Ser Leu Gln Gln Leu Asn Leu Gln Leu Pro Leu Lys

805 810 815

Thr Lys Ala Phe Phe Met Leu Asp Gly Ile Leu Ser Lys Tyr Phe Asp

820 825 830

Leu Ile Tyr Val His Asn Pro Val Phe Lys Pro Phe Glu Lys Pro Val

835 840 845

Met Ile Ser Met Gly Asn Glu Asn Val Leu Glu Ile Lys Gly Asn Asp

850 855 860

Ile Asp Pro Glu Ala Val Lys Gly Glu Val Leu Lys Val Gly Asn Lys

865 870 875 880

Ser Cys Glu Asn Ile His Leu His Ser Glu Ala Val Leu Cys Thr Val

885 890 895

Pro Asn Asp Leu Leu Lys Leu Asn Ser Glu Leu Asn Ile Glu Trp Lys

900 905 910

Gln Ala Ile Ser Ser Thr Val Leu Gly Lys Val Ile Val Gln Pro Asp

915 920 925

Gln Asn Phe Thr Gly Leu Ile Ala Gly Val Val Ser Ile Ser Ile Ala

930 935 940

Leu Leu Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Trp Leu Lys Lys Arg Lys Gln

945 950 955 960

Ile Lys Asp Leu Gly Ser Glu Leu Val Arg Tyr Asp Ala Arg Val His

965 970 975

Thr Pro His Leu Asp Arg Leu Val Ser Ala Arg Ser Val Ser Pro Thr

980 985 990

Thr Glu Met Val Ser Asn Glu Ser Val Asp Tyr Arg Ala Thr Phe Pro

995 1000 1005

Glu Asp Gln Phe Pro Asn Ser Ser Gln Asn Gly Ser Cys Arg Gln

1010 1015 1020

Val Gln Tyr Pro Leu Thr Asp Met Ser Pro Ile Leu Thr Ser Gly

1025 1030 1035

Asp Ser Asp Ile Ser Ser Pro Leu Leu Gln Asn Thr Val His Ile

1040 1045 1050

Asp Leu Ser Ala Leu Asn Pro Glu Leu Val Gln Ala Val Gln His

1055 1060 1065

Val Val Ile Gly Pro Ser Ser Leu Ile Val His Phe Asn Glu Val

1070 1075 1080

Ile Gly Arg Gly His Phe Gly Cys Val Tyr His Gly Thr Leu Leu

1085 1090 1095

Asp Asn Asp Gly Lys Lys Ile His Cys Ala Val Lys Ser Leu Asn

1100 1105 1110

Arg Ile Thr Asp Ile Gly Glu Val Ser Gln Phe Leu Thr Glu Gly

1115 1120 1125

Ile Ile Met Lys Asp Phe Ser His Pro Asn Val Leu Ser Leu Leu

1130 1135 1140

Gly Ile Cys Leu Arg Ser Glu Gly Ser Pro Leu Val Val Leu Pro

1145 1150 1155

Tyr Met Lys His Gly Asp Leu Arg Asn Phe Ile Arg Asn Glu Thr

1160 1165 1170

His Asn Pro Thr Val Lys Asp Leu Ile Gly Phe Gly Leu Gln Val

1175 1180 1185

Ala Lys Gly Met Lys Tyr Leu Ala Ser Lys Lys Phe Val His Arg

1190 1195 1200

Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Asp Glu Lys Phe Thr Val

1205 1210 1215

Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp Met Tyr Asp Lys Glu

1220 1225 1230

Tyr Tyr Ser Val His Asn Lys Thr Gly Ala Lys Leu Pro Val Lys

1235 1240 1245

Trp Met Ala Leu Glu Ser Leu Gln Thr Gln Lys Phe Thr Thr Lys

1250 1255 1260

Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Leu Met Thr

1265 1270 1275

Arg Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Asp Val Asn Thr Phe Asp Ile Thr

1280 1285 1290

Val Tyr Leu Leu Gln Gly Arg Arg Leu Leu Gln Pro Glu Tyr Cys

1295 1300 1305

Pro Asp Pro Leu Tyr Glu Val Met Leu Lys Cys Trp His Pro Lys

1310 1315 1320

Ala Glu Met Arg Pro Ser Phe Ser Glu Leu Val Ser Arg Ile Ser

1325 1330 1335

Ala Ile Phe Ser Thr Phe Ile Gly Glu His Tyr Val His Val Asn

1340 1345 1350

Ala Thr Tyr Val Asn Val Lys Cys Val Ala Pro Tyr Pro Ser Leu

1355 1360 1365

Leu Ser Ser Glu Asp Asn Ala Asp Asp Glu Val Asp Thr

1370 1375 1380

<210> 114

<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy Chain Sequence of hD12

<400> 114

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 115

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light Chain sequence of hD12

<400> 115

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Asn

20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 116

<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy Chain sequence of hD12 T289C

<400> 116

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Lys Pro Ser Thr Asp Asn Thr Glu Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Tyr Gly Asn Tyr Pro Leu Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Cys Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат связывающего агента и лекарственного средства для лечения субъекта, который имеет или предположительно имеет неопластическое заболевание, при котором экспрессируется фактор мезенхимально-эпителиального перехода (cMET) или экспрессирующий cMET рак (варианты). В одном из вариантов реализации изобретения конъюгат содержит связывающий агент и полезную нагрузку, где связывающий агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 105, 106, 107 и 108, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 46, 47, 48 и 49. Изобретение расширяет арсенал средств для лечения экспрессирующего cMET рака. 2 н. и 14 з.п. ф-лы, 33 ил., 12 табл., 16 пр.

1. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства для лечения субъекта, который имеет или предположительно имеет неопластическое заболевание, при котором экспрессируется фактор мезенхимально-эпителиального перехода (cMET), или экспрессирующий cMET рак, содержащий связывающий агент и полезную нагрузку,

где связывающий агент представляет собой:

(i) связывающий агент, содержащий

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 или 2,

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 или KVS,

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 26 или 27,

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 50 или 51,

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62 или 63, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79 или 80;

(ii) связывающий агент, содержащий

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 или 4,

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18 или GAS,

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 28 или 29,

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52 или 53,

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64 или 65, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81 или 82;

(iii) связывающий агент, содержащий

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5 или 6,

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20 или WAS,

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30 или 31,

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 54 или 55,

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 66 или 67, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 83 или 84;

(iv) связывающий агент, содержащий

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7 или 8,

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 или AAT,

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35,

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56 или 57,

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68 или 69, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 85 или 86;

(v) связывающий агент, содержащий

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 9: или 10,

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 24: или STS,

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35,

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 или 59,

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 или 71, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87 или 88;

(vi) a binding agent comprising

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12,

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или STS,

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35,

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 или 59,

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 74 или 75, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 90 или 91; или

(vii) связывающий агент, содержащий

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 или 12,

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или STS,

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35,

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 или 59,

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72 или 73, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 88 или 89;

а

полезная нагрузка включает пирролобензодиазепиновый токсин и линкер;

где пирролобензодиазепиновый токсин ковалентно связан с линкером, этот линкер ковалентно связан со связывающим агентом, а связывающий агент специфически связывается с внеклеточным доменом cMET.

2. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 1, где связывающий агент включает:

CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9 или 10;

CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24 или STS;

CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 34 или 35;

CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58 или 59;

CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 или 71, и

CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 87 или 88.

3. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства для лечения субъекта, который имеет или предположительно имеет неопластическое заболевание, при котором экспрессируется cMET, или экспрессирующий cMET рак, содержащий связывающий агент и полезную нагрузку, где связывающий агент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 105, 106, 107 и 108, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 46, 47, 48 и 49.

4. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 3, где последовательность легкой цепи содержит SEQ ID NO: 47, а последовательность тяжелой цепи содержит SEQ ID NO: 108.

5. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по любому из пп. 1-4, где пирролобензодиазепиновый токсин имеет структуру химической формулы I:

,

где

Z₁ и Z₂ оба представляют собой N;

Z₃ и Z₄ оба представляют собой C;

двойные линии с пунктиром представляют собой одинарную связь или двойную связь;

n составляет от 1 до 10; каждый из R₃ и R₄ независимо представляет собой H или C_1-4 алкоксил, а каждый из R₁ и R₂ независимо выбран из группы, состоящей из H, C_1-5 алкила, C_3-6 циклоалкила, C_2-5 алкенила и фенила, при необходимости замещенного R₅,

где R₅ выбран из группы, состоящей из –NH₂, –NHR₆ и пиперазинила, замещенного R₇, имеющего структуру

,

где R₆ включает линкер, а R₇ представляет собой H или C_1-5 алкил;

X₁ отсутствует, является защитной группой или включает линкер; X₂ отсутствует, является защитной группой или включает линкер; только один из X₁, X₂, R₁ и R₂ включает линкер, а каждый из Y₁ и Y₂ независимо отсутствует, является ОН или SO₃H;

при условии, что:

(i) когда Х₁ включает линкер, представляет собой N-С,

(ii) когда Х₂ включает линкер, представляет собой N-С,

(iii) когда Х₁ включает защитную группу, представляет собой N-С, и

(iv) когда Х₂ включает защитную группу, представляет собой N-С,

где отсутствие фрагмента указывает на его отсутствие или присутствие одного или нескольких атомов водорода для достижения необходимой валентности.

6. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства п. 5, где линкер включает структуру химической формулы A:

,

где звездочка указывает точку присоединения к пирролобензодиазепиновому токсину;

волнистой линией обозначена точка присоединения к связывающему агенту; m составляет от 1 до 20; q составляет от 0 до 10, а E является соединительной группой.

7. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 5, где линкер включает структуру химической формулы B:

,

где

звездочка указывает точку присоединения к пирролобензодиазепиновому токсину; волнистой линией обозначена точка присоединения к связывающему агенту; E представляет собой соединительную группу; v составляет от 0 до 10, а u равен 0 или 1;

где в случае, если u равен 1, t составляет от 1 до 10.

8. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 5, где защитная группа имеет следующую структуру (D):

,

где звездочка указывает точку присоединения к пирролобензодиазепиновому токсину, а w составляет от 1 до 5.

9. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по любому из пп. 1-4, где полезная нагрузка включает структуру, выбранную из группы, состоящей из

,

где m равен 8;

,

где m равен 8, p равен 3, а X₂ представляет собой защитную группу;

,

где m равен 8;

,

где t равен 8, а v равен 1, и

,

где волнистая линия указывает точку присоединения к связывающему агенту.

10. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 9, где защитная группа X₂ имеет следующую структуру (D):

,

где звездочка указывает точку присоединения к нагрузке, а w составляет от 1 до 5.

11. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по любому из пп. 1-4, где связывающий агент представляет собой антитело или его связывающий фрагмент.

12. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 11, где связывающий агент связывается специфически cMET человека, cMET обезьяны или cMET крысы.

13. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 12, где связывающий агент специфически связывается с внеклеточным доменом варианта cMET.

14. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 1, где неопластическое заболевание, при котором экспрессируется cMET, или экспрессирующий cMET рак включает карциному, саркому, нейробластому, глиобластому, миелому, лимфому, меланому или солидную опухоль или опухоль мягких тканей.

15. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 14, где неопластическое заболевание, при котором экспрессируется cMET, или экспрессирующий cMET рак включает рак мочевого пузыря, рак молочной железы, колоректальный рак, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак пищевода, рак печени, гепатоцеллюлярный рак, гипофарингеальный рак, рак легкого, аденокарциному, рак яичника или рак почки.

16. Конъюгат связывающего агента и лекарственного средства по п. 14, где неопластическое заболевание, при котором экспрессируется cMET, или экспрессирующий cMET рак включает аденокарциному поджелудочной железы, нейроэндокринный рак поджелудочной железы, колоректальную аденокарциному, злокачественное новообразование тонкой кишки, холангиокарциному, немелкоклеточный рак легкого (НМКРЛ), карциному щитовидной железы, рак пищевода или пищеводно-желудочного перехода (ПЖП), аденокарциному желудка, гепатоцеллюлярную карциному печени, плоскоклеточную карциному головы и шеи, злокачественное новообразование женских половых путей, карциному молочной железы, трижды негативный рак молочной железы, мелкоклеточную карциному легкого, карциному поверхностного эпителия яичника, ретроперитонеальную или перитонеальную саркому, аденокарциному простаты, нейроэндокринную опухоль, стромальную опухоль желудочно-кишечного тракта, глиобластому или неэпителиальный рак яичника.