НОВЫЙ ВАРИАНТ MdtH И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-ФОСФОСЕРИНА, ЦИСТЕИНА И ПРОИЗВОДНОГО ЦИСТЕИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ Российский патент 2025 года по МПК C07K14/245 C12N15/70 C12P13/06 C12P13/12 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к варианту MdtH и способам получения О-фосфосерина и цистеина и производного цистеина с его применением.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

L-цистеин, представляющий собой аминокислоту, играющую важную роль в метаболизме серы у всех живых организмов, используется не только в синтезе in vivo таких белков, как кератин волос, глутатион, биотин, метионин и другие серосодержащие метаболиты, но также является предшественником биосинтеза кофермента А.

Что касается получения L-цистеинас применением микроорганизмов, раскрыты: 1) способ биологического превращения D,L-2-аминотиазолин-4-карбоновой кислоты (D,L-АТС) с применением микроорганизмов, 2) способ получения L-цистеина путем непосредственной ферментации с применением Е. coli (Европейский патент ЕР 0885962 В и Wada М and Takagi Н, Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006) и 3) способ получения О-фосфосерина (далее «OPS») посредством ферментации с применением микроорганизмов, а затем превращение OPS в L-цистеин посредством взаимодействия OPS с сульфидом при каталитическом действии (9-фосфосеринсульфгидрилазы (далее «OPSS») (Европейский патент ЕР 2444481).

Однако исследования эффективных способов получения L-цистеина по-прежнему необходимы, поскольку потребность в L-цистеине увеличивается. В частности, для получения цистеина с высоким выходом посредством способа 3) было необходимо избыточное получение предшественника OPS.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Техническая задача

В результате интенсивных попыток избыточного получения его предшественника, OPS, для получения цистеина с высоким выходом, авторы настоящего изобретения оформили настоящую заявку, подтвердив, что вариант MdtH увеличивает способность продуцировать OPS.

Техническое решение

В одном аспекте настоящего изобретения предложен вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий указанный вариант по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий указанный полинуклеотид по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен рекомбинантный микроорганизм рода Escherichia, содержащий вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения О-фосфосерина, включающий культивирование в среде микроорганизма, содержащего вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения цистеина или его производного, включающий: а) культивирование в среде микроорганизма, содержащего вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант, с получением таким образом О-фосфосерина или среды, содержащей (9-фосфосерин; и б) осуществление взаимодействия между сульфидом и (9-фосфосеринсульфгидрилазой (OPSS) или микроорганизмом, экспрессирующим OPSS, и (9-фосфосерином или средой, содержащей (9-фосфосерин, полученными на стадии а).

Полезные эффекты

Культура микроорганизма, обладающего способностью продуцировать OPS благодаря применению нового варианта полипептида, обладающего OPS-экспортирующей активностью, по настоящему изобретению, может продуцировать OPS с высоким выходом по сравнению с применением существующего немодифицированного или вариантного белка.

Далее следует подробное описание. Каждое из описаний и воплощений, изложенных в настоящей заявке, также может быть применено к другим описаниям и воплощениям. Таким образом, все комбинации различных элементов, изложенных в настоящей заявке, входят в объем настоящего изобретения. Более того, объем настоящего изобретения не ограничен конкретным описанием, приведенным ниже.

Согласно одному аспекту настоящего изобретения, предложен вариант MdtH, в котором аминокислота в положении, соответствующем положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту.

В одном воплощении указанная другая аминокислота может представлять собой изолейцин.

Вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором валин, аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1 в качестве родительской последовательности, заменена на изолейцин, и который имеет гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,7%, и менее 100% с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1. Например, вариант по настоящему изобретению может изолейцин в качестве аминокислоты, соответствующей положению 125 в аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, или может иметь или содержать аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5% или по меньшей мере 99,7%, и менее 100% с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, или может состоять или по существу состоять из указанной аминокислотной последовательности. Также очевидно, что даже вариант, имеющий аминокислотную последовательность с делецией, модификацией, заменой, консервативной заменой или вставкой в ее части, также может входить в объем настоящего изобретения, при условии, что аминокислотная последовательность имеет такую гомологию или идентичность и демонстрирует активность, соответствующую варианту по настоящему изобретению.

Например, на N-конце, С-конце и/или внутри аминокислотной последовательности может быть вставка или делеция последовательности, встречающаяся в природе мутация, молчащая мутация или консервативная замена, которая не изменяет функции варианта по настоящему изобретению.

«Консервативная замена» относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую схожие с ней структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена, как правило, может возникать на основании сходства в полярности, заряде, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Как правило, консервативная замена может оказывать незначительное влияние или не оказывать влияния на активность белка или полипептида.

В настоящем описании термин «вариант» относится к конкретному белку, который имеет последовательность, отличающуюся от родительской последовательности вследствие консервативной замены и/или модификации по меньшей мере одной аминокислоты в родительской последовательности, но при этом имеет неизмененные функции или свойства. Вариант отличается от установленной последовательности заменами, делециями или вставками нескольких аминокислот. Такой вариант, как правило, можно идентифицировать путем модификации по меньшей мере одной аминокислоты в аминокислотной последовательности конкретного белка и оценки свойств модифицированного белка. Таким образом, способность варианта может быть увеличена, не изменена или уменьшена по сравнению с нативным белком. Кроме того, некоторые варианты могут включать варианты, в которых удалена по меньшей мере одна часть, такая как N-концевая лидерная последовательность или транс мембранный домен. Другие варианты могут включать варианты, в которых удалена часть N-конца и/или С-конца зрелого белка. Термин «вариант» может также использоваться взаимозаменяемо с «модификацией», «модифицированным белком», «модифицированным полипептидом», «мутантом», «мутеином», «дивергентом» или тому подобным, и может использоваться любой термин, без ограничения, при условии что он используется в смысле «модифицированный». Для задачи настоящего изобретения вариант может относиться к варианту, в котором активность модифицированного белка увеличена по сравнению с встречающимся в природе белком дикого типа или немодифицированным белком, однако вариант не ограничивается этим.

Вариант может также содержать делеции или вставки аминокислот, которые оказывают минимальное влияние на свойства и вторичную структуру полипептида. Например, с N-концом варианта может быть конъюгирована сигнальная (или лидерная) последовательность, которая вовлечена в котрансляционную и посттрансляционную транслокацию белка. Кроме того, вариант может также быть конъюгирован с другой последовательностью или линкером для его идентификации, очистки или синтеза.

В настоящем описании термин «родительская последовательность» относится к эталонной последовательности, которая становится модифицированным полипептидом вследствие внедрения модификации. Таким образом, родительская последовательность, которая является стартовой последовательностью, может быть объектом, в который внедряют модификацию, такую как замена, вставка и/или делеция. Родительская последовательность может быть природной или дикого типа и может быть вариантом, имеющим по меньшей мере одну замену, вставку или делецию, возникающую в природной последовательности, или последовательности дикого типа, или искусственно синтезированной последовательности.

В настоящем описании термин «гомология» или «идентичность» относится к степени сходства двух заданных аминокислотных последовательностей или нуклеотидных последовательностей и может выражаться в процентах. Термины гомология и идентичность зачастую могут использоваться взаимозаменяемо.

Гомология или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотид о в или полипептидов можно определить с использованием стандартного алгоритма выравнивания, и можно применять значения штрафов за открытие гэпа, установленные в используемой программе по умолчанию в комбинации. По существу, гомологичные или идентичные последовательности обычно способны гибридизоваться в условиях умеренной или высокой жесткости со всей последовательностью или ее частью. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию с полинуклеотидом, содержащим типичный кодон или кодон, выбранный с учетом вырожденности кодонов.

Установить, имеют ли две любые полинуклеотидные или полипептидные последовательности гомологию, сходство или идентичность, можно, например, с использованием известного компьютерного алгоритма, такого как программа «FASTA» при использовании параметров по умолчанию, как описано в Pearson et al. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444. В альтернативном варианте гомологию, сходство или идентичность можно определить с использованием алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), используемого в программе Needleman пакета программ Европейского набора открытых программных средств для молекулярной биологии EMBOSS (версии 5.0.0 или более поздних) (Rice et al, 2000, Trends Genet. 16: 276-277) (включая пакет программ GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.E., et al, J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). Например, гомологию, сходство или идентичность можно определить с использованием BLAST или ClustalW Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI).

Гомологию, сходство или идентичность полинуклеотидов можно определить путем сравнения информации о последовательности, например с применением компьютерной программы GAP, например Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48: 443, как изложено Smith and Waterman, Adv. Appl Math (1981) 2: 482. Кратко, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность как значение, полученное путем деления количества одинаково выровненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) бинарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для неидентичности) и взвешенную матрицу сравнения, предложенную Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745 (или подстановочную матрицу EDNAFULL (EMBOSS версия NCBI NUC4.4), как изложено Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353 358 (1979); (2) штраф 3,0 за каждый гэп и дополнительный штраф 0,10 за каждый символ в каждом гэпе (или штраф за открытие гэпа 10, штраф за продолжение гэпа 0,5); и (3) отсутствие штрафа за концевые гэпы.

В настоящем описании термин «соответствующий» относится к аминокислотному остатку в положении, приведенном в полипептиде, или аминокислотному остатку, который схож с остатком, приведенным в полипептиде, идентичен или гомологичен ему. Идентификация аминокислоты в соответствующем положении может представлять собой определение конкретной аминокислоты в последовательности относительно конкретной последовательности. В настоящем описании «соответствующая область» обычно относится к схожему или соответствующему положению в родственном белке или эталонном белке.

Например, любую аминокислотную последовательность выравнивают с SEQ ID NO: 1, и на этом основании каждый аминокислотный остаток аминокислотной последовательности можно пронумеровать с указанием выраженного числом положенияаминокислотного остатка, соответствующего аминокислотному остатку SEQ ID NO: 1. Например, алгоритм выравнивания последовательностей, описанный в настоящем изобретении, может идентифицировать положение аминокислоты или положение, в котором возникает модификация, такая как замена, вставка или делеция, путем сравнения с запрашиваемой последовательностью (также обозначаемой как «эталонная последовательность»).

Для такого выравнивания можно использовать, например, алгоритм Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), программу Needle пакета EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et at, 2000, Trends Genet. 16: 276-277) или им подобные, без ограничения, и можно надлежащим образом использовать программу выравнивания последовательностей, алгоритм попарного сравнения последовательностей или тому подобные, которые известны в области техники.

В настоящем описании термин «MdtH» относится к виду переносчиков суперсемейства основных фасилитаторов (MFS), представляющих собой мембранные транспортные белки, облегчающие передвижение низкомолекулярных растворенных веществ через клеточные мембраны в ответ на хемиосмотические градиенты, и известных как белок, проявляющий OPS-экспортирующую активность в Е. coli, где ингибирование роста снимается в присутствии избытка OPS. В данном документе MdtH может означать мембранный белок, обладающий активностью экспорта О-фосфосерина (OPS) из клеток. Последовательность MdtH может быть получена из известной базы данных GenBank NCBI. Например, MdtH может представлять собой полипептид, обладающий OPS-экспортирующей активностью, кодируемый геном mdtH, но без ограничения этим.

Вариант по настоящему изобретению может обладать активностью увеличения OPS-экспортирующей способности по сравнению с полипептидом дикого типа.

В настоящем описании термин «О-фосфосерин» (далее «OPS») относится к сложному эфиру фосфорной кислоты и серина, служащему конститутивным компонентом для нескольких белков. OPS, являющийся предшественником L-цистеина, может быть конвертирован в цистеин посредством взаимодействия с сульфидом при каталитическом действии OPS-сульфгидрилазы (OPSS), но без ограничения этим (публикация заявки на патент США US 2012-0190081).

Вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором по меньшей мере одна из аминокислот, соответствующих положениям 60, 180 и 398 ваминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, дополнительно заменена на другую аминокислоту. Например, вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту и по меньшей мере одна, по меньшей мере две или по меньшей мере три из аминокислот, соответствующих положениям 60, 180 и 398 дополнительно заменены другими аминокислотами, но без ограничения этим.

В частности, вариант по настоящему изобретению может представлять собой модифицированный полипептид, демонстрирующий OPS-экспортирующую активность, в котором на N-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 1) валин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 125, заменен аминокислотным остатком, отличным от валина; или дополнительно 2) глутамин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 60, 3) фенилаланин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 180, и/или 4) лейцин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 398, все заменены другими аминокислотными остатками.

На N-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 аминокислота, отличная от 1) валина, аминокислотного остатка, соответствующего положению 125, может включать глицин, аланин, изолейцин, серии, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, аргинин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, лизин, гистидин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; аминокислотный остаток, отличный от 2) глутамина, аминокислотного остатка, соответствующего положению 60, может включать глицин, аланин, лейцин, изолейцин, серии, пролин, фенилаланин, триптофан, метионин, аргинин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, валин, лизин, гистидин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; аминокислота, отличная от 3) фенилаланина, аминокислотного остатка, соответствующего положению 180, может включать глицин, аланин, лейцин, изолейцин, серии, пролин, валин, триптофан, метионин, аргинин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, лизин, гистидин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; и/или аминокислота, отличная от 4) лейцина, аминокислотного остатка, соответствующего положению 398, может включать глицин, аланин, изолейцин, серии, пролин, фенилаланин, валин, триптофан, метионин, аргинин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, лизин, гистидин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, но без ограничения этим.

Более конкретно, в варианте по настоящему изобретению на N-концеаминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 1) валин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 125, может быть заменен на изолейцин; или дополнительно 2) аминокислотный остаток, соответствующий положению 60, может представлять собой глутамин или аргинин, 3) аминокислотный остаток, соответствующий положению 180, может представлять собой фенилаланин или лейцин и 4) аминокислотный остаток, соответствующий положению 398, может представлять собой лейцин или пролин.

Еще более конкретно, в варианте по настоящему изобретению на N-конце аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 1) валин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 125, может быть заменен на изолейцин; или дополнительно 2) глутамин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 60, может быть заменен на аргинин, 3) фенилаланин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 180, может быть заменен на лейцин и/или 4) лейцин, аминокислотный остаток, соответствующий положению 398, может быть заменен на пролин.

В одном воплощении вариант по настоящему изобретению может представлять собой вариант, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей идентичность по меньшей мере 99% с по меньшей мере любой одной аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

В качестве альтернативы вариант по настоящему изобретению может иметь, содержать, состоять из или по существу состоять из по меньшей мере любой одной аминокислотной последовательности, выбранной из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3, но без ограничения этим.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению.

Вариант является таким, как описано выше.

В настоящем описании термин «полинуклеотид» относится к полимеру из нуклеотидных звеньев, соединенных ковалентными связями в длинную цепь, и к цепи ДНК или РНК, имеющей заданную длину или более длинной. Более конкретно, термин относится к фрагменту полинуклеотида, кодирующему вариант.

Полинуклеотид, кодирующий вариант по настоящему изобретению, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3. В качестве примера настоящего изобретения полинуклеотид по настоящему изобретению может иметь или содержать последовательность нуклеотидов нуклеиновой кислоты SEQ IDNO: 4 или SEQ ID NO: 5. Кроме того, полинуклеотид по настоящему изобретению может состоять или по существу состоять из последовательности нуклеотидов нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5.

Полинуклеотид по настоящему изобретению может иметь различные модификации в его кодирующей области в том объеме, который не меняет аминокислотную последовательность варианта по настоящему изобретению, с учетом вырожденности кодонов или предпочтения кодонов в организме, в котором будет экспрессироваться вариант по настоящему изобретению. В частности, полинуклеотид по настоящему изобретению может иметь или содержать нуклеотидную последовательность, имеющую гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% и менее 100% с последовательностью нуклеотидов нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 или 5 или может состоять или по существу состоять из нуклеотидной последовательности, имеющей гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% и менее 100% с последовательностью нуклеотидов нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 4 или 5, но без ограничения этим. В последовательностях, имеющих гомологию или идентичность, кодон, кодирующий аминокислоту, которая соответствует положению 125 в SEQ ID NO: 1, может быть одним из кодонов, кодирующих изолейцин.

Кроме того, полинуклеотид по настоящему изобретению может включать, без ограничения, последовательность, которая может гибридизоваться в строгих условиях с зондом, который может быть получен из последовательности известного гена, например последовательностью, комплементарной части или всей полинуклеотид ной последовательности по настоящему изобретению. Термин «строгие условия» относится к условиям, при которых обеспечивается специфическая гибридизация между полинуклеотидами. Такие условия, в частности, описаны в литературе (см. J. Sambrook et at, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F. M. Ausubel et at, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Например, такие условия могут включать условия, при которых полинуклеотиды, имеющие высокиегомологию или идентичность, такие как полинуклеотиды, имеющие гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, или по меньшей мере 99%, гибридизуются друг с другом, но при которых полинуклеотиды, имеющие меньшие гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом; или условия отмывки для типичной гибридизации по Саузерну, где отмывка проводится при концентрации соли и температуре, соответствующих 60°С, 1×SSC (раствор цитрата и хлорида натрия), 0,1% SDS (додецилсульфат натрия), в частности 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, и более конкретно 68°С, 0,1×SSC и 0,1% SDS, однократно, в частности двукратно или трехкратно.

Для гибридизации необходимо, чтобы две нуклеиновые кислоты имели комплементарные последовательности, хотя возможны несовпадения между основаниями в зависимости от жесткости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для описания отношения между нуклеотидными основаниями, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, в случае ДНК аденин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, полинуклеотид по настоящему изобретению может также охватывать не только по существу схожие нуклеиновокислотные последовательности, но также и выделенные нуклеиновокислотные фрагменты, комплементарные полной последовательности.

В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом по настоящему изобретению, можно обнаружить с применением условий гибридизации, включающих стадию гибридизации при T_m 55°С, и с применением описанных выше условий. Кроме того, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но без ограничения этим, и может быть соответствующим образом проконтролировано специалистом в области техники в зависимости от задачи.

Надлежащая строгость для гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотида в и степени их комплементарности, и возможные значения хорошо известны в области техники (например, Sambrook et al. выше).

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению. Вектор может представлять собой экспрессирующий вектор для экспрессии полинуклеотида в клетке-хозяине, но без ограничения этим.

Полинуклеотид является таким, как описано выше.

Вектор по настоящему изобретению может включать ДНК-конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность полинуклеотида, кодирующего целевой полипептид, функционально связанную с подходящей областью, регулирующей экспрессию (или последовательностью, регулирующей экспрессию), так, чтобы целевой полипептид экспрессировался в подходящем хозяине. Область, регулирующая экспрессию, может включать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую последовательность оператора для контролирования такой транскрипции, последовательность, кодирующую подходящий сайт связывания рибосомы на мРНК (матричная РНК), и последовательность, контролирующую терминацию транскрипции и трансляции. После трансформации подходящего хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина или может быть интегрирован в сам геном.

Вектор, использованный в настоящем изобретении, не ограничивается каким-либо конкретным, и можно применять любой известный в области техники вектор. Примеры обычно используемых векторов могут включать встречающиеся в природе или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фаговых векторов или космидных векторов можно применять pWE15, М13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, Charon21A, а в качестве плазмидных векторов можно применять векторы на основе pBR, на основе pUC, на основе pBluescript II, на основе pGEM, на основе pTZ, на основе pCL, на основе pSK, на основе pSKH и на основе рЕТ. В частности, можно использовать pCL, pDC, pDCM2, pSK, pSKH130, pDZ, pACYC177, pACYC184, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC и другие векторы.

Например, полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, может быть встроен в хромосому посредством вектора для встраивания в хромосому клетки. Встраивание полинуклеотида в хромосому можно осуществлять с использованием любого способа, известного в области техники, например посредством гомологичной рекомбинации, но без ограничения этим. Вектор может дополнительно включать селективный маркер для идентификации встраивания в хромосому. Селективный маркер предназначен для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть для идентификации встраивания целевой молекулы нуклеиновой кислоты, и можно использовать маркеры, придающие селектируемый фенотип, такой как устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофия, устойчивость к цитотоксическим лекарственным средствам или экспрессия поверхностных полипептидов. В среде, обработанной селективным агентом, могутвыживать или демонстрировать отличающийся фенотип только клетки, экспрессирующие селективный маркер, и таким образом можно осуществлять отбор трансформированных клеток.

В настоящем описании термин «трансформация» означает, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой полипептид, внедрен в клетку-хозяина или микроорганизм для обеспечения экспрессии полипептида, кодируемого этим полинуклеотидом, в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может включать любой полинуклеотид, при условии, что он может экспрессироваться в клетке-хозяине, независимо от того, является ли полинуклеотид встроенным в хромосому и находящимся в ней или находится в клетке-хозяине за пределами хромосомы. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и/или РНК, кодирующие целевой белок. Полинуклеотид может быть внедрен в любой форме, при условии что полинуклеотид может быть внедрен в клетку-хозяина и экспрессироваться в ней. Например, полинуклеотид может быть внедрен в клетку-хозяина в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, включающую все элементы, необходимые для самостоятельной экспрессии. Как правило, экспрессионная кассета может включать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может быть в форме экспрессирующего вектора, обеспечивающего саморепликацию. Кроме того, полинуклеотид может быть внедрен в клетку-хозяина как таковой и быть функционально связанным с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, но без ограничения этим.

Кроме того, термин «функционально связан» относится к функциональной связи между последовательностью полипептида и последовательностью промотора для инициации и опосредования транскрипции полинуклеотида, кодирующего целевой белок по настоящему изобретению.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения, предложен микроорганизм рода Escherichia, включающий вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант.

Штамм по настоящему изобретению может включать модифицированный полипептид по настоящему изобретению, полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, и/или вектор, включающий полинуклеотид по настоящему изобретению.

Вариант, полинуклеотид и вектор являются такими, как описано выше.

В настоящем описании термин «микроорганизм (или штамм)» охватывает все микроорганизмы дикого типа или микроорганизмы со встречающимися в природе или искусственными генетическими модификациями и относится к микроорганизму, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие вставки экзогенного гена или усиления или ослабления активности эндогенного гена, при этом микроорганизм может иметь генетическую модификацию для продуцирования целевого полипептида, белка или продукта.

Штамм по настоящему изобретению может представлять собой: штамм, содержащий по меньшей мере один вариант по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению и вектор, содержащий полинуклеотид по настоящему изобретению; штамм, модифицированный, чтобы экспрессировать вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид по настоящему изобретению; штамм (например, рекомбинантный штамм), экспрессирующий вариант по настоящему изобретению или полинуклеотид по настоящему изобретению; или штамм (например, рекомбинантный штамм), обладающий активностью варианта по настоящему изобретению, но без ограничения этим.

Штамм по настоящему изобретению может представлять собой штамм, обладающий OPS-экспортирующей способностью.

Штамм по настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, от природы обладающий MdtH или OPS-экспортирующей способностью, или микроорганизм, полученный путем внедрения варианта по настоящему изобретению или полинуклеотида, кодирующего указанный вариант (или вектора, содержащего указанный полинуклеотид) в родительский штамм, не обладающий MdtH или OPS-экспортирующей способностью и/или микроорганизм, которому придана OPS-экспортирующая способность, но без ограничения этим.

Например, штамм по настоящему изобретению представляет собой клетку или микроорганизм, которые трансформированы вектором, содержащим полинуклеотид по настоящему изобретению, или полинуклеотидом, кодирующим вариант по настоящему изобретению, чтобы экспрессировать вариант по настоящему изобретению, и для задач настоящего изобретения штамм по настоящему изобретению может включать все микроорганизмы, способные экспортировать OPS, включая вариант по настоящему изобретению. Например, штамм по настоящему изобретению может представлять собойрекомбинантный штамм, обладающий увеличенной OPS-экспортирующей способностью благодаря экспрессии варианта MdtH посредством внедрения полинуклеотида, кодирующего вариант по настоящему изобретению во встречающийся в природе микроорганизм дикого типа или микроорганизм, экспортирующий OPS. Рекомбинантный штамм, обладающий увеличенной OPS-экспортирующей способностью, может представлять собой микроорганизм, в котором OPS-экспортирующая способность увеличена по сравнению со встречающимся в природе микроорганизмом дикого типа или микроорганизмом с немодифицированным MdtH (то есть микроорганизмом, экспрессирующим MdtH дикого типа (SEQ ID NO: 1) или микроорганизмом, не экспрессирующим модифицированный белок (SEQ ID NO: 2 или 3)), но без ограничения этим. Например, микроорганизм с немодифицированным MdtH, являющийся штаммом-объектом для сравнения увеличения OPS-экспортирующей способности, может представлять собой СА07-0012 (КССМ 11121Р, публикация заявки на европейский патент ЕР 2444481 или публикация заявки на патент US 2012-0190081), который представляет собой штамм, обладающий ослабленной эндогенной активностью фосфосеринфосфатазы (serB), но без ограничения этим.

Например, рекомбинантный штамм с увеличенной OPS-продуцирующей способностью вследствие увеличенной способности экспортировать OPS, может обладать OPS-продуцирующей способностью, которая увеличена на по меньшей мере приблизительно 1%, в частности по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 2,5%, по меньшей мере приблизительно 5%, по меньшей мере приблизительно 7,5%, по меньшей мере приблизительно 10%, по меньшей мере приблизительно 12,5%, по меньшей мере приблизительно 15%, по меньшей мере приблизительно 17,5%, по меньшей мере приблизительно 20%, по меньшей мере приблизительно 22,5%, по меньшей мере приблизительно 25%, по меньшей мере приблизительно 27,5%, по меньшей мере приблизительно 30%, по меньшей мере приблизительно 32,5%, по меньшей мере приблизительно 35%, по меньшей мере приблизительно 37,5%, по меньшей мере приблизительно 40%, по меньшей мере приблизительно 42,5%, по меньшей мере приблизительно 45%, по меньшей мере приблизительно 47,5%, по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 52,5%, по меньшей мере приблизительно 55%, по меньшей мере приблизительно 57,5%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 62,5%, по меньшей мере приблизительно 65%, по меньшей мереприблизительно 67,5%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 72,5%, по меньшей мере приблизительно 75%, по меньшей мере приблизительно 77,5%, по меньшей мере приблизительно 80%, по меньшей мере приблизительно 82,5%, по меньшей мере приблизительно 90%, по меньшей мере приблизительно 92,5%, по меньшей мере приблизительно 95%, по меньшей мере приблизительно 97,5%, по меньшей мере приблизительно 100%, по меньшей мере приблизительно 102,5%, по меньшей мере приблизительно 105%, по меньшей мере приблизительно 107,5%, по меньшей мере приблизительно 110%, по меньшей мере приблизительно 112,5%, по меньшей мере приблизительно 115%, по меньшей мере приблизительно 117,5%, по меньшей мере приблизительно 120%, по меньшей мере приблизительно 122,5%, по меньшей мере приблизительно 125%, по меньшей мере приблизительно 127,5%, по меньшей мере приблизительно 130%, по меньшей мере приблизительно 132,5%, по меньшей мере приблизительно 135% или по меньшей мере приблизительно 137% (верхняя граница не ограничена конкретной и верхняя граница может составлять, например, приблизительно 300%, самое большее приблизительно 200%, самое большее приблизительно 150%, самое большее приблизительно 100%, самое большее приблизительно 50%, самое большее приблизительно 40% или самое большее приблизительно 30%) по сравнению с OPS-продуцирующей способностью родительского штамма до модификации или немодифицированного микроорганизма, однако OPS-продуцирующая способность не ограничена этим, при условии, что она увеличена на положительное значение по сравнению с продуцирующей способностью родительского штамма до модификации или немодифицированного микроорганизма. В другом примере рекомбинантный штамм с увеличенной OPS-продуцирующей способностью вследствие увеличенной OPS-экспортирующей способности может обладать OPS-продуцирующей способностью, которая увеличена по меньшей мере приблизительно в 1,01 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,025 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,05 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,075 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,10 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,125 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,15 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,175 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,20 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,225 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,25 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,275 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,30 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,325 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,35 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,375 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,50 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,525 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,55 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,60 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,625 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,65 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,675 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,70 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,725 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,75 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,775 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,8 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,825 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,85 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,875 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,90 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,925 раза, по меньшей мере приблизительно в раза, 1,95 раза, по меньшей мере приблизительно в 1,975 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,0 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,025 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,05 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,075 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,10 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,125 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,15 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,175 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,20 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,225 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,25 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,275 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,30 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,325 раза, по меньшей мере приблизительно в 2,35 раза или по меньшей мере приблизительно в 2,37 раза (верхняя граница не ограничена конкретной и верхняя граница может, например, быть выше самое большее приблизительно в 10 раз, самое большее приблизительно в 5 раз, самое большее приблизительно в 3 раза или самое большее приблизительно в 2 раза) по сравнению с OPS-продуцирующей способностью родительского штамма до модификации или немодифицированного микроорганизма, но без ограничения этим. В настоящем описании термин «приблизительно» относится к диапазону, включающему ±0,5, ±0,4, ±0,3, ±0,2, ±0,1 и тому подобное, и поэтому включает все входящие в диапазон значения, которые являются эквивалентными или близкими значениям, указанным после этого термина, но без ограничения этим.

В настоящем описании термин «немодифицированный микроорганизм» может относиться к штамму дикого типа или штамму естественного происхождения как таковому или к штамму до изменения его признака вследствие генетической модификации, вызванной естественной или искусственной причиной, не исключая штаммы, содержащие встречающиеся в природе мутации в микроорганизмах. Например, немодифицированныймикроорганизм может относиться к штамму, в который не внедрен описанный в данном документе вариант MdtH или до внедрения варианта MdtH. «Немодифицированный микроорганизм» может использоваться взаимозаменяемо со «штаммом до модификации» или «микроорганизмом до модификации» «немутированным штаммом», «немодифицированным штаммом», «немодифицированным микроорганизмом» или «эталонным микроорганизмом».

В еще одном примере настоящего изобретения микроорганизм по настоящему изобретению не ограничен его конкретным типом, при условии, что он может продуцировать OPS, и микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой как прокариотическую клетку, так и эукариотическую клетку, и, в частности, прокариотическую клетку. Примеры прокариотических клеток могут включать штаммы микроорганизмов, относящиеся к роду Escherichia, роду Erwinia, роду Serratia, роду Providencia, роду Corynebacterium и роду Brevibacterium, и, в частности, прокариотическая клетка может представлять собой микроорганизм рода Escherichia, и более конкретно Escherichia coli, но без ограничения этим.

В частности, микроорганизм рода Escherichia по настоящему изобретению может продуцировать OPS и L-серин посредством SerA, SerC и SerB, которые являются ферментами пути биосинтеза L-серина (Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, Vol.3, 2012 October; Wendisch V. F. et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun; 9(3): 268-74; and Peters-Wendisch P. et a.l, Appl Environ Microbiol. 2005 Nov; 71(11): 7139 44). SerB, представляющий собой фосфосеринфосфатазу, обладает активностью для конвертации OPS в L-серин, таким образом микроорганизм, модифицированный, чтобы обладать ослабленной активностью SerB, имеет свойство накапливать OPS и, следовательно, может быть с успехом использован для продуцирования OPS. Например, микроорганизм по настоящему изобретению может представлять собой рекомбинантный микроорганизм, имеющий дополнительно ослабленную активность SerB по сравнению с его эндогенной активностью, в дополнение к внедрению варианта по настоящему изобретению.

SerB по настоящему изобретению может представлять собой белок, имеющий или содержащий аминокислотную последовательность, представленную в NCBI под регистрационным номером А АС77341.1, или белок, состоящий или по существу состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в ААС77341.1, но без ограничения этим. Кроме того, SerB по настоящему изобретению может иметь илисодержать аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 99% с аминокислотной последовательностью, представленной в ААС77341.1, при условии, что SerB по настоящему изобретению демонстрирует активность конвертирования OPS в L-серин. Кроме того, SerB по настоящему изобретению может состоять или по существу состоять из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 99% с аминокислотной последовательностью, представленной в ААС77341.1, но без ограничения этим.

Кроме того, полинуклеотид, кодирующий SerB по настоящему изобретению, может иметь или содержать аминокислотную, приведенную в NCBI NP_415583.4. Полинуклеотид, кодирующий SerB по настоящему изобретению, может иметь или содержать аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 99% и менее 100% с нуклеотидной последовательностью NP_415583.4. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий SerB по настоящему изобретению, может состоять или по существу состоять из аминокислотной последовательности, имеющей гомологию или идентичность по меньшей мере 70%, 80%, 90%, 95% или 99% и менее 100% с нуклеотидной последовательностью NP_415583.4, но без ограничения этим.

В настоящем описании термин «усиление» активности полипептида относится к увеличению активности полипептида по сравнению с его эндогенной активностью. Усиление может использоваться взаимозаменяемо с активацией, повышающей регуляцией, сверхэкспрессией, увеличением и тому подобными. Активация, усиление, повышающая регуляция, сверхэкспрессия и увеличение могут включать как проявление активности, которая исходно отсутствовала, так и проявление активности, улучшенной по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации. «Эндогенная активность» относится к активности конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм до изменения его признака или немодифицированный микроорганизм, в случае когда признак изменяется вследствие генетической модификации, вызванной фактором естественного или искусственного происхождения. Данный термин может использоваться взаимозаменяемо с «активностью до модификации». «Усиление», «повышающая регуляция», «сверхэкспрессия» или «увеличение» активности полипептида по сравнению с его эндогенной активностью означает улучшение активности и/или концентрации (уровня экспрессии) конкретного полипептида, которой исходно обладал родительскийштамм до изменения его признака или немодифицированный микроорганизм.

Усиление может быть достигнуто посредством внедрения экзогенного полипептида или посредством усиления собственной активности полипептида и/или его концентрации (уровня экспрессии). Усиление активности полипептида можно идентифицировать по увеличению степени активности или уровня экспрессии соответствующего полипептида или по увеличению количества продукта, получаемого из соответствующего полипептида.

Усиление активности полипептида может быть достигнуто путем применения различных способов, хорошо известных в области техники, без ограничения, при условии, что способ может усиливать активность целевого полипептида по сравнению с микроорганизмом до модификации. В частности, можно применять генную инженерию и/или белковую инженерию, хорошо известные специалисту в области техники, которые являются рутинными способами молекулярной биологии, но без ограничения этим (например, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol.2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и так далее).

В частности, усиление активности полипептида в настоящем изобретении может представлять собой

1) увеличение внутриклеточного числа копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;

2) модификацию области, регулирующей экспрессию гена, на хромосоме, кодирующей полипептид;

3) модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR область (5'-нетранслируемую область) транскрипта гена, кодирующего полипептид;

4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида, так, чтобы активность полипептида усиливалась;

5) модификацию полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, так, чтобы активность полипептида усиливалась (например, модификацию полинуклеотид ной последовательности гена полипептида для кодирования модифицированного полипептида, так, чтобы активность полипептида усиливалась);

6) внедрение экзогенного полипептида, проявляющего активность указанного полипептида, или кодирующего его экзогенного полипептида;

7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;

8) модификацию или химическую модификацию экспонируемого сайта, отобранного при анализе третичной структуры полипептида; или

9) комбинацию двух или более выбранных из пунктов 1)-8), но без конкретного ограничения этим.

Более конкретно, это описано следующим образом.

Увеличение внутриклеточного числа копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, в пункте 1) может быть достигнуто посредством внедрения в клетку-хозяина вектора, с которым функционально связан полинуклеотид, кодирующий соответствующий полипептид, и который способен реплицироваться и функционировать независимо от хозяина. В качестве альтернативы, увеличение в пункте 1) может быть достигнуто путем внедрения одной копии или двух или более копий полинуклеотида, кодирующего соответствующий полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Внедрение в хромосому можно осуществить путем внедрения в клетку-хозяина вектора, который способен встраивать полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, но без ограничения этим. Вектор является таким, как описано выше.

Модификация области, регулирующей экспрессию гена (или последовательности, регулирующей экспрессию) на хромосоме, кодирующей полипептид, в пункте 2) может, например, представлять собой модификацию, возникающую в последовательности в результате делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации, или замену последовательностью или вставку последовательности, обладающей более высокой активностью, так, чтобы активность области, регулирующей экспрессию, дополнительно усилилась. Последовательность, регулирующая экспрессию, может включать промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, и тому подобные, но без конкретного ограничения этим. Например, это может быть замена нативного промотора более сильным промотором, но без ограничения этим.

Примерами известных сильных промоторов могут быть промоторы CJ1-CJ7 (патент US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL, промотор tet, промотор gap А, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (патент US 10584338 В2), промотор O2 (патент US 10273491 В2), промотор tkt и промотор усе А и им подобные, но без ограничения этим.

Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5-UTR область транскрипта гена, кодирующего полипептид, в пункте 3) может, например, представлять собой замену нуклеотидной последовательностью, кодирующей не эндогенный инициирующий кодон, а другой инициирующий кодон, имеющий более высокий уровень экспрессии полипептида, но без ограничения этим.

Модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности в пунктах 4) и 5) может представлять собой модификацию, возникающую в последовательности в результате делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации в аминокислотной последовательности полипептида или в полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или замену аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью, модифицированной для проявления более сильной активности, или аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью, модифицированной для увеличения активности, так, чтобы активность полипептида усиливалась, но без ограничения этим. В частности, замену можно осуществлять путем встраивания полинуклеотида в хромосому посредством гомологичной рекомбинации, но без ограничения этим. Используемый здесь вектор может дополнительно включать селективный маркер для идентификации встраивания в хромосому. Селективный маркер является таким, как описано выше.

Внедрение экзогенного полипептида, проявляющего активность полипептида, в пункте 6) может представлять собой внедрение в клетку-хозяина экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий такую же/схожую активность в отношении полипептида. Происхождение или последовательность экзогенного полинуклеотида не ограничены, при условии, что экзогенный полинуклеотид демонстрирует такую же/схожую активность в отношении полинуклеотида. Внедрение можно осуществлять посредством любого известного способа трансформации, надлежащим образом выбранного специалистом в области техники, и в результате экспрессии внедренного полинуклеотида в клетке-хозяине полипептид может продуцироваться, и его активность может усиливаться.

Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, в пункте 7) может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида, чтобы увеличить его транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине, или оптимизацию кодонов экзогенного полинуклеотида, чтобы обеспечить его оптимизированную транскрипцию или трансляцию в клетке-хозяине.

Модификация или химическая модификация экспонируемого сайта, отобранногопосредством анализа третичной структуры полипептида, в пункте 8) может, например, представлять собой сравнение информации о последовательности анализируемого полипептида с базой данных, в которой хранится информация об основных белках для определения кандидатов матричных белков согласно степени сходства последовательности с последующей идентификацией структур на основе указанных кандидатов и, таким образом, отбора экспонированного сайта для модификации или химической модификации, и затем экспонированный сайт модифицируют или химически модифицируют.

Такое усиление активности полипептида может означать, что активность, концентрация или уровень экспрессии соответствующего полипептида увеличены по сравнению с активностью или концентрацией полипептида, экспрессируемого в штамме микроорганизма дикого типа или микроорганизме до модификации, или увеличено количество продукта, получаемого из соответствующего полипептида, но без ограничения этим.

В настоящем описании термин «ослабление» активности полипептида представляет собой понятие, охватывающее все из уменьшения активности или отсутствия активности по сравнению с эндогенной активностью. Ослабление может использоваться взаимозаменяемо с инактивацией, дефицитом, понижающей регуляцией, уменьшением, снижением, аттенуацией или тому подобными.

Ослабление может также включать: случай, когда активность самого полипептида уменьшена или устранена по сравнению с активностью полипептида, исходно присущей микроорганизму, в результате модификации полинуклеотида, кодирующего полипептид, и тому подобного; случай, когда активность и/или концентрация (уровень экспрессии) всего полипептида в клетке ниже, чем у встречающегося в природе штамма вследствие ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего полипептид, или ингибирования трансляции в полипептид; случай, когда экспрессия полинуклеотида не происходит и/или случай, когда полипептид не обладает активностью даже несмотря на экспрессию полинуклеотида. «Эндогенная активность» относится к активности конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм до изменения его признака или микроорганизм дикого типа или немодифицированный микроорганизм, когда признак изменяется вследствие генетической модификации, вызванной нативной или искусственной причиной. Данный термин может использоваться взаимозаменяемо с «активностью до модификации». «Инактивация, дефицит, уменьшение, понижающая регуляция, снижение или аттенуация» активности полипептида по сравнению с егоэндогенной активностью означает, что активность полипептида снижена по сравнению с активностью конкретного полипептида, которой исходно обладал родительский штамм до изменения его признака или немодифицированный микроорганизм.

Ослабление активности полипептида может быть достигнуто любым способом, известным в области техники, но без ограничения этим, и может быть достигнуто путем применения различных способов, хорошо известных в области техники (например, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014; 15(2): 2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и так далее).

В частности, ослабление полипептида в настоящем изобретении может представлять собой:

1) делецию части гена или всего гена, кодирующего полипептид;

2) модификацию области, регулирующей экспрессию (или последовательности, регулирующей экспрессию) для уменьшения экспрессии гена, кодирующего полипептид;

3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, чтобы устранить или ослабить активность полипептида (например, делецию/замену/добавление по меньшей мере одной аминокислоты в аминокислотную последовательность);

4) модификацию генной последовательности, кодирующей полинуклеотид, таким образом, чтобы активность полипептида устранялась или ослаблялась (например, делецию/замену/вставку по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты в нуклеотидную последовательность гена полипептида, чтобы кодировать полипептид, модифицированный для устранения или ослабления активности полипептида);

5) модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5-UTR область транскрипта гена, кодирующего полипептид;

6) внедрение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), который комплементарно связывается с транскриптом гена, кодирующего полипептид;

7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, в направлении против хода транскрипции относительно последовательности Шайна-Дальгарно, чтобы образовать вторичную структуру, делающую присоединение рибосом невозможным;

8) добавление промотора, который будет транскрибироваться в обратном направлении, к 3'-концу открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия на основе обратной транскрипции, RTE); или9) комбинацию двух или более выбранных из пунктов 1)-8), но без конкретного ограничения этим.

Например, это описано следующим образом.

Делеция части гена или всего гена, кодирующего полипептид, в пункте 1) может представлять собой удаление из хромосомы всего полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой белок, замену полинуклеотидом с делецией некоторых нуклеотидов или заменой маркерным геном.

Модификация области, регулирующей экспрессию гена (или последовательности, регулирующей экспрессию) в пункте 2) может представлять собой модификацию, возникающую в области, регулирующей экспрессию гена (или последовательности, регулирующей экспрессию) в результате делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации, или замену последовательностью, обладающей более слабой активностью. Область, регулирующая экспрессию, включает промотор, последовательность оператора, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, и последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, но без ограничения этим.

Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или 5'-UTR область транскрипта гена, кодирующего полипептид, в пункте 5) может, например, представлять собой замену нуклеотидной последовательностью, кодирующей не эндогенный инициирующий кодон, а другой инициирующий кодон, обеспечивающий более низкий уровень экспрессии полипептида, но без ограничения этим.

Модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности в пунктах 3) и 4) может представлять собой модификацию, возникающую в последовательности в результате делеции, вставки, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации в аминокислотной последовательности полипептида или в полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, или замену аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью, модифицированной для проявления более слабой активности, или аминокислотной последовательностью или полинуклеотидной последовательностью, модифицированной, чтобы не обладать активностью, для ослабления активности полипептида, но без ограничения этим. Например, экспрессия гена может быть ингибирована или ослаблена в результате внедрения модификации в полинуклеотидную последовательность для образования терминирующего кодона.

Что касается внедрения анти смыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), комплементарно связывающегося с транскриптом гена, кодирующего полипептид, в пункте 6) можно обратиться, например, к документу Weintraub, Н. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986.

Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, в направлении против хода транскрипции относительно последовательности Шайна-Дальгарно с образованием вторичной структуры, делающей присоединение рибосом невозможным, в пункте 7) может сделать невозможной трансляцию мРНК или понизить ее скорость.

Добавление промотора, который будет транскрибироваться в обратном направлении, к 3'-концу открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующего полипептид (инженерия на основе обратной транскрипции, RTE) в пункте 8) может представлять собой создание антисмыслового нуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид, чтобы тем самым ослабить активность полипептида.

Модификация части полинуклеотидов или всех полинуклеотидов в микроорганизме по настоящему изобретению может быть индуцирована путем: (а) редактирования генома посредством гомологичной рекомбинации или модифицированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9) с применением вектора для встраивания в хромосому микроорганизма или и/или (б) обработки излучением, таким как ультрафиолетовое излучение и радиоактивное излучение, и/или химическими средствами, но без ограничения этим. Способ модификации части гена или всего гена может включать способ с применением технологии рекомбинации ДНК. Например, делеция части гена или всего гена может быть достигнута путем инъекции нуклеотидной последовательности или вектора, содержащего нуклеотидную последовательность, гомологичную целевому гену, в микроорганизм для осуществления гомологичной рекомбинации. Нуклеотидная последовательность или вектор для инъекции могут включать доминантный селективный маркер, но без ограничения этим.

Кроме того, микроорганизм может представлять собой микроорганизм, у которого дополнительно уменьшена способность включать OPS в клетки или разрушать OPS.

Что касается OPS-продуцирующих микроорганизмов, упомянутых выше, в качестве ссылочных материалов для настоящего изобретения можно использовать материалы, раскрытые в публикации заявки на европейский патент ЕР 2444481 илипубликации заявки на патент US 2012-0190081, но без ограничения этим.

В микроорганизме по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, OPS и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ получения О-фосфосерина, включающий культивирование в среде микроорганизма, содержащего вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант.

Способ получения OPS по настоящему изобретению может включать культивирование в среде микроорганизма, содержащего вариант по настоящему изобретению, полинуклеотид по настоящему изобретению или вектор по настоящему изобретению.

В настоящем описании термин «культура» означает выращивание микроорганизма по настоящему изобретению в регулируемых надлежащим образом условиях окружающей среды. Процесс культивирования по настоящему изобретению можно осуществлять в соответствии с подходящими средами или условиями культивирования, известными в области техники. Специалист в области техники может легко адаптировать такой процесс культивирования в зависимости от выбранного штамма и осуществлять его. В частности, культивирование может представлять собой периодическое культивирование, непрерывное культивирование и/или непрерывное культивирование с подпиткой, но без ограничения этим.

В настоящем описании термин «среда» относится к смеси, содержащей в качестве основных компонентов питательные вещества, необходимые для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, при этом среда обеспечивает питательные вещества, факторы роста и тому подобное, включая воду, необходимые для выживания и роста. В частности, в отношении среды и иных условий культивирования, применяемых для культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, можно использовать любую среду, используемую при стандартном культивировании микроорганизмов, без конкретного ограничения. Однако микроорганизмы по настоящему изобретению можно культивировать в аэробных условиях в обычной среде, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, регулируя температуру, рН и тому подобное.

Примеры источника углерода, присутствующего в среде, могут включать: сахаридыи углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, крахмал и целлюлоза; масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, касторовое масло и кокосовое масло; жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота; спирты, такие как глицерин и этанол; и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Такие материалы можно использовать в отдельности или в смеси, но без ограничения этим.

Примеры источника азота, присутствующего в среде, могут включать: источники органического азота, такие как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, мальтозный экстракт, кукурузный экстракт и соевую муку; и источники неорганического азота, такие как мочевина, сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Такие источники азота можно использовать в отдельности или в комбинации, но без ограничения этим.

В качестве источника фосфора, присутствующего в среде, могут содержаться однозамещенный фосфат калия, двузамещенный фосфат калия и соответствующие натрийсодержащие соли, но без ограничения этим.

Среда может содержать соли металлов, такие как сульфат магния и сульфат железа, и может дополнительно содержать аминокислоты, витамины и соответствующие предшественники. Такие среды или предшественники можно добавлять в культуры при периодическом или непрерывном культивировании, но без ограничения этим.

В процессе культивирования можно регулировать рН культур путем добавления к культурам надлежащим образом такого соединения как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота. Кроме того, для подавления образования пены можно добавлять пеногаситель, такой как сложный полигликолевый эфир жирной кислоты. Кроме того, для поддержания аэробного состояния среды в среду можно вводить кислород или кислородсодержащий газ, либо для поддержания анаэробного или не-аэробного состояния среды газ можно не вводить или можно вводить азот, водород или углекислый газ, но без ограничения этим.

Для культуры по настоящему изобретению температуру культивирования можно поддерживать от 20°С до 45°С, и в частности от 30°С до 35°С, и культивирование может продолжаться до получения желаемой продукции нужного вещества и, в частности, может составлять от 10 до 100 часов. Однако температура и продолжительность культивирования этим не ограничены.

OPS, продуцируемый культурой по настоящему изобретению, можетвысвобождаться в среду.

Способ получения OPS по настоящему изобретению может дополнительно включать получение микроорганизма по настоящему изобретению, получение среды для культивирования микроорганизма или их комбинацию (независимо от порядка, в любом порядке), например перед стадии культивирования или после нее.

Способ получения OPS по настоящему изобретению может дополнительно включать выделение OPS, полученного в результате культивирования, из среды (среды, в которой осуществляли культивирование) или микроорганизма по настоящему изобретению. Способ может дополнительно включать стадию выделения после стадии культивирования.

Способ выделения OPS может представлять собой сбор необходимого OPS с использованием подходящего способа, известного в области техники, в зависимости от способа культивирования микроорганизма по настоящему изобретению, например периодического культивирования, непрерывного культивирования или культивирования с подпиткой. Например, можно использовать центрифугирование, фильтрацию, обработку агентом для преципитации кристаллизованного белка (высаливание), экстракцию, разрушение ультразвуком, ультрафильтрацию, диализ, различные виды хроматографии, такие как хроматография молекулярных сит (гель-фильтрация), адсорбционную хроматографию, ионообменную хроматографию и аффинную хроматографию, HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография) и комбинацию этих способов, и желаемый OPS можно выделять из среды или микроорганизма с использованием соответствующего способа, известного в области техники.

Способ получения OPS по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию очистки. Очистку можно осуществлять соответствующим способом, известным в области техники. В одном примере, когда способ получения OPS по настоящему изобретению включает как стадию выделения, так и стадию очистки, стадию выделения и стадию очистки можно осуществлять непрерывно или с перерывами, вне зависимости от порядка, или можно осуществлять одновременно или путем объединения в одну стадию, но без ограничения этим.

В способе по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, штамм и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложен способ получения цистеина или его производного.

В частности, указанный способ может включать: а) культивирование в среде микроорганизма, содержащего вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант, с получением О-фосфосерина или среды, содержащей О-фосфосерин; и б) осуществление взаимодействия между сульфидом и О-фосфосеринсульфгидрилазой (OPSS) или микроорганизмом, экспрессирующим OPSS, и (9-фосфосерином или средой, содержащей (9-фосфосерин, полученными на стадии а).

В настоящем описании термин «производное» относится к схожему соединению, полученному путем химической модификации некоторого соединения и, как правило, термин относится к соединению, в котором атом водорода или конкретная группа атомов замещены другим атомом водорода или группой атомов.

В настоящем описании термин «производное цистеина» относится к соединению, в котором атом водорода или конкретная группа атомов в цистеине замещены другим атомом или группой атомов. Например, производное цистеина может иметь форму, в которой атом азота аминогруппы (-NH₂) или атом серы тиоловой группы (-SH) в цистеине имеет другой атом или группу атомов, присоединенные к нему. Примеры производного цистеина включают N-ацетилцистеин (NAC), S-карбоксиметилцистеин (SCMC), Вос-Cys(Me)-OH, (R)-S-(2-амино-2-карбоксиэтил)-L-гомоцистеин, (R)-2-амино-3-сульфопропионовую кислоту, D-2-амино-4-(этилтио)бутировую кислоту, 3-сульфино-L-аланин, Fmoc-Cys(Вос-метил)-ОН, селено-L-цистеин, S-(2-тиазолил)-L-цистеин, S-(2-тиенил)-L-цистеин и S-(4-толил)-L-цистеин, но без ограничения этим.

При получении цистеина согласно способу по настоящему изобретению превращение в различные производные цистеина может быть легко достигнуто любыми способами, хорошо известными в области техники.

В частности, способ получения производного цистеина может дополнительно включать превращение цистеина, полученного на стадии б), в производное цистеина. Например, можно осуществлять синтез N- ацетил цистеина (NAC) путем реакции цистеина с ацетилирующим агентом или можно осуществить синтез S-карбоксиметилцистеина (SCMC) путем реакции цистеина с галогенуксусной кислотой в щелочных условиях, но без ограничения этим.

Такие производные цистеина используют преимущественно в качестве исходных фармацевтических материалов для средств от кашля, уменьшающих кашель средств итерапевтических средств против бронхита, бронхиальной астмы, ларингофарингита и так далее.

В настоящем описании термин «О-фосфосеринсульфгидрилаза (OPSS)» относится к ферменту, катализирующему реакцию, в ходе которой OPS приобретает тиоловую группу (SH) с превращением OPS в цистеин. Фермент может быть таким, который первоначально обнаружили у Aeropyrum pernix, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium megmatis, Trichomonas vaginalis (Mino, K. and Ishikawa, K., FEBSletters, 551:133-138, 2003; и Bums, К. E. et al, J. Am. Chem. Soc, 127:11602-11603, 2005). Кроме того, OPSS включает не только белки OPSS дикого типа, но также вариант белка, который содержит делецию, замену или вставку в отношении части полинуклеотидной последовательности, кодирующей OPSS, и демонстрирует активность, эквивалентную биологической активности белка OPSS дикого типа или превосходящую ее, и может охватывать все белки OPSS и их варианты, раскрытые в публикации заявки на европейский патент ЕР 2444481 и публикации заявки на патент США US 9127324.

Сульфид может представлять собой любой сульфид, представленный не только в твердой форме, обычно используемой в области техники, но также в жидкой или газообразной форме вследствие разницы в рН, давлении или растворимости, и, таким образом, может быть конвертирован в тиоловую (SH) группу в форме, например, сульфида (S^2-) или тиосульфата (S₂O₃^2-). В частности, можно применять Na₂S, NaSH, H₂S, (NH₄)₂S и Na₂S₂O₃, которые обеспечивают тиоловую группу для OPS, но без ограничения этим. В ходе взаимодействия одна тиоловая группа обеспечивается для одной реакционноспособной группы OPS с образованием одного цистеина или производного цистеина. Отношение количества добавляемого сульфида к молярной концентрации OPS в реакции может составлять от 0,1 до 3, в частности от 1 до 2, но без ограничения этим.

Кроме того, настоящее изобретение может дополнительно включать выделение цистеина, полученного на стадии взаимодействия. Необходимый цистеин можно собирать путем разделения и очистки из реакционного раствора с применением подходящей реакции, известной в области техники.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложена композиция для получения OPS, содержащая: микроорганизм, содержащий вариант MdtH, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на другую аминокислоту, или полинуклеотид, кодирующий указанный вариант; среда для культивирования указанного микроорганизма иликомбинация двух или более из перечисленного.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать любой соответствующий эксципиент, который обычно применяют в композиции для получения OPS, и примерами эксципиента могут являться консервант, смачивающий агент, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буфер, стабилизатор или изотонический агент, но без ограничения этим.

В композиции по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, OPS и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение модифицированного полипептида, проявляющего OPS-экспортирующую активность, по настоящему изобретению для получения OPS, цистеина или производного цистеина.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение модифицированного полипептида, проявляющего OPS-экспортирующую активность, по настоящему изобретению для экспортирования OPS из микроорганизма.

В применениях по настоящему изобретению вариант, полинуклеотид, вектор, штамм, среда, OPS и тому подобное являются такими, как описано в других аспектах.

ВАРИАНТ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с отсылкой к примерам. Однако эти примеры приведены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения посредством примера, и объем настоящего изобретения не ограничен этими примерами.

Пример 1: конструирование и скрининг библиотеки mdtH

Для отбора варианта MdtH с увеличенной OPS-экспортирующей активностью конструировали плазмидную библиотеку вариантов гена mdtH. Конкретно процесс был следующим.

Любую PCR (полимеразная цепная реакция) для мутагенеза осуществляли с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10 (праймеры 3 и 8) с использованием в качестве матрицы геномной ДНК Е. coli К12 W3110 (Genbank:NC_007779.1) (набор для случайного мутагенеза посредством PCR Такага Diversify PCR random mutagenesis, кат.номер 630703).

PCR осуществляли с денатурацией при 94°С в течение 5 минут, 20 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты, и затем полимеризацией при 72°С в течение5 минут.

Для внедрения фрагментов мутантного гена, полученных таким образом в ходе указанной процедуры, в вектор pCL1920 (GenBank No. АВ236930) с промотором trc, вначале получали pCL_Ptrc. Для сохранения фрагмента промотора trc выполняли PCR с использованием пары праймеров с SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 (праймеры 1 и 2). PCR осуществляли с денатурацией при 94°С в течение 5 минут, 30 циклов денатурации при 94°С в течение 30 секунд, отжига при 55°С в течение 30 секунд и полимеризации при 72°С в течение 1 минуты, и затем полимеризацией при 72°С в течение 5 минут.

Использованные последовательности праймеров приведены в Табл. 1 ниже.

Фрагмент промотора trc клонировали в вектор pCL1920, расщепленный EcoRI и Sail, с использованием набора для клонирования in-fusion (Clontech Laboratories, Inc.) и сохраняли pCL_Ptrc. Сохраненный вектор pCL_Ptrc расщепляли PstI и EcoRV, а затем полученные посредством PCR фрагменты мутантного гена клонировали с использованием набора для клонирования infusion. Осуществляли клонирование при 50°С в течение 60 минут и в результате клонирования конструировали плазмидную библиотеку вариантов гена pCL_Ptrc-mdtH.

Сконструированной плазмидной библиотекой мутантного гена pCL_Ptrc-mdtH трансформировали СА07-0012 (КССМ 11121Р, публикация заявки на европейский патент ЕР 2444481 или публикация заявки на патент США №2012-0190081) посредством электропорации. Из них отбирали два вида штаммов, содержащих варианты, и получали из них плазмиды и анализировали их нуклеотидные последовательности посредством секвенирования.

В результате анализа нуклеотидных последовательностей два отобранных варианта идентифицировали как вариант, в котором 125-й аминокислотный остаток валин былзаменен на изолейцин в аминокислотной последовательности MdtH дикого типа [mdtH(V125D], и вариант, в котором 60-й аминокислотный остаток глутамин был заменен на аргинин, 125-й аминокислотный остаток валин был заменен на изолейцин, 180-й аминокислотный остаток фенилаланин был заменен на лейцин, и 398-й аминокислотный остаток лейцин был заменен на пролин [mdtH(Q60R, V125I, F180L, L398P)]. СА07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(V125I), представлявший собой штамм, трансформированный вариантом mdtH(V125I), обозначали как Е. coli СА07-0379, a CA07-0012/mdtH(Q60R, VI251, F180L, L398P), представлявший собой штамм, трансформированный вариантом mdtH(Q60R, V125I, F180L, L398P), обозначали как Е. coli СА07-0380.

Пример 2. Оценка способности продуцировать OPS у штаммов с внедренными вариантами MdtH

Оценивали способность продуцировать OPS у штаммов с внедренными вариантами MdtH с использованием следующей среды (Табл. 2).

В частности, для культивирования осуществляли посев каждого штамма на твердую среду LB, после чего культивировали в течение ночи в инкубаторе при 33°С.Осуществляли посев штамма, который культивировали в течение ночи на твердой среде LB, в 25 мл среды для титрования из Табл. 2 и культивировали в инкубаторе при температуре 33°С при 200 об/мин в течение 48 ч. Оценивали способность продуцировать OPS, и результаты показаны в Табл. 3.

В результате CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(V125I), представляющий собой штамм с внедренным mdtH (VI251), демонстрировал приблизительно 180% способность продуцировать по сравнению с CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH, представляющим собой штамм с внедренным mdtH дикого типа. Кроме того, CA07-0012/pCL Ptrc-mdtH(Q60R, V125I, F180L, L398P), представляющий собой штамм с внедренным mdtH(Q60R, V125I, F180L, L398P), демонстрировал приблизительно 237% способность продуцировать по сравнению со штаммом CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH.

CA07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(V125I) обозначали как СА07-0379, а СА07-0012/pCL_Ptrc-mdtH(Q60R, V125I, F180L, L398P) обозначали как СА07-0380.

На основании вышеизложенного специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение, поймут, что возможны и другие воплощения настоящего изобретения, не изменяющие технической концепции или существенных признаков настоящего изобретения. Таким образом, описанные выше воплощения следует рассматривать только в качестве примеров, не ограничивающих объем настоящего изобретения. Следует понимать, что объем настоящего изобретения охватывает все изменения или модификации, вытекающие из определений и объема формулы изобретения, а также их эквиваленты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CJ CheilJedang Corporation

<120> НОВЫЙ ВАРИАНТ MdtH И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-ФОСФОСЕРИНА,

ЦИСТЕИНА И ПРОИЗВОДНОГО ЦИСТЕИНА С ЕГО ПРИМЕНЕНИЕМ

<130> OPA21270-PCT

<150> KR 10-2021-0075859

<151> 2021-06-11

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> MdtH дикого типа

<400> 1

Met Ser Arg Val Ser Gln Ala Arg Asn Leu Gly Lys Tyr Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ile Asp Asn Met Leu Val Val Leu Gly Phe Phe Val Val Phe Pro Leu

20 25 30

Ile Ser Ile Arg Phe Val Asp Gln Met Gly Trp Ala Ala Val Met Val

35 40 45

Gly Ile Ala Leu Gly Leu Arg Gln Phe Ile Gln Gln Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Phe Gly Gly Ala Ile Ala Asp Arg Phe Gly Ala Lys Pro Met Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Met Leu Met Arg Ala Ala Gly Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala

85 90 95

His Glu Pro Trp Leu Leu Trp Phe Ser Cys Leu Leu Ser Gly Leu Gly

100 105 110

Gly Thr Leu Phe Asp Pro Pro Arg Ser Ala Leu Val Val Lys Leu Ile

115 120 125

Arg Pro Gln Gln Arg Gly Arg Phe Phe Ser Leu Leu Met Met Gln Asp

130 135 140

Ser Ala Gly Ala Val Ile Gly Ala Leu Leu Gly Ser Trp Leu Leu Gln

145 150 155 160

Tyr Asp Phe Arg Leu Val Cys Ala Thr Gly Ala Val Leu Phe Val Leu

165 170 175

Cys Ala Ala Phe Asn Ala Trp Leu Leu Pro Ala Trp Lys Leu Ser Thr

180 185 190

Val Arg Thr Pro Val Arg Glu Gly Met Thr Arg Val Met Arg Asp Lys

195 200 205

Arg Phe Val Thr Tyr Val Leu Thr Leu Ala Gly Tyr Tyr Met Leu Ala

210 215 220

Val Gln Val Met Leu Met Leu Pro Ile Met Val Asn Asp Val Ala Gly

225 230 235 240

Ala Pro Ser Ala Val Lys Trp Met Tyr Ala Ile Glu Ala Cys Leu Ser

245 250 255

Leu Thr Leu Leu Tyr Pro Ile Ala Arg Trp Ser Glu Lys His Phe Arg

260 265 270

Leu Glu His Arg Leu Met Ala Gly Leu Leu Ile Met Ser Leu Ser Met

275 280 285

Met Pro Val Gly Met Val Ser Gly Leu Gln Gln Leu Phe Thr Leu Ile

290 295 300

Cys Leu Phe Tyr Ile Gly Ser Ile Ile Ala Glu Pro Ala Arg Glu Thr

305 310 315 320

Leu Ser Ala Ser Leu Ala Asp Ala Arg Ala Arg Gly Ser Tyr Met Gly

325 330 335

Phe Ser Arg Leu Gly Leu Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Tyr Ile Gly

340 345 350

Gly Gly Trp Leu Phe Asp Leu Gly Lys Ser Ala His Gln Pro Glu Leu

355 360 365

Pro Trp Met Met Leu Gly Ile Ile Gly Ile Phe Thr Phe Leu Ala Leu

370 375 380

Gly Trp Gln Phe Ser Gln Lys Arg Ala Ala Arg Arg Leu Leu Glu Arg

385 390 395 400

Asp Ala ***

<210> 2

<211> 403

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MdtH(V125I)

<400> 2

Met Ser Arg Val Ser Gln Ala Arg Asn Leu Gly Lys Tyr Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ile Asp Asn Met Leu Val Val Leu Gly Phe Phe Val Val Phe Pro Leu

20 25 30

Ile Ser Ile Arg Phe Val Asp Gln Met Gly Trp Ala Ala Val Met Val

35 40 45

Gly Ile Ala Leu Gly Leu Arg Gln Phe Ile Gln Arg Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Phe Gly Gly Ala Ile Ala Asp Arg Phe Gly Ala Lys Pro Met Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Met Leu Met Arg Ala Ala Gly Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala

85 90 95

His Glu Pro Trp Leu Leu Trp Phe Ser Cys Leu Leu Ser Gly Leu Gly

100 105 110

Gly Thr Leu Phe Asp Pro Pro Arg Ser Ala Leu Val Ile Lys Leu Ile

115 120 125

Arg Pro Gln Gln Arg Gly Arg Phe Phe Ser Leu Leu Met Met Gln Asp

130 135 140

Ser Ala Gly Ala Val Ile Gly Ala Leu Leu Gly Ser Trp Leu Leu Gln

145 150 155 160

Tyr Asp Phe Arg Leu Val Cys Ala Thr Gly Ala Val Leu Phe Val Leu

165 170 175

Cys Ala Ala Phe Asn Ala Trp Leu Leu Pro Ala Trp Lys Leu Ser Thr

180 185 190

Val Arg Thr Pro Val Arg Glu Gly Met Thr Arg Val Met Arg Asp Lys

195 200 205

Arg Phe Val Thr Tyr Val Leu Thr Leu Ala Gly Tyr Tyr Met Leu Ala

210 215 220

Val Gln Val Met Leu Met Leu Pro Ile Met Val Asn Asp Val Ala Gly

225 230 235 240

Ala Pro Ser Ala Val Lys Trp Met Tyr Ala Ile Glu Ala Cys Leu Ser

245 250 255

Leu Thr Leu Leu Tyr Pro Ile Ala Arg Trp Ser Glu Lys His Phe Arg

260 265 270

Leu Glu His Arg Leu Met Ala Gly Leu Leu Ile Met Ser Leu Ser Met

275 280 285

Met Pro Val Gly Met Val Ser Gly Leu Gln Gln Leu Phe Thr Leu Ile

290 295 300

Cys Leu Phe Tyr Ile Gly Ser Ile Ile Ala Glu Pro Ala Arg Glu Thr

305 310 315 320

Leu Ser Ala Ser Leu Ala Asp Ala Arg Ala Arg Gly Ser Tyr Met Gly

325 330 335

Phe Ser Arg Leu Gly Leu Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Tyr Ile Gly

340 345 350

Gly Gly Trp Leu Phe Asp Leu Gly Lys Ser Ala His Gln Pro Glu Leu

355 360 365

Pro Trp Met Met Leu Gly Ile Ile Gly Ile Phe Thr Phe Leu Ala Leu

370 375 380

Gly Trp Gln Phe Ser Gln Lys Arg Ala Ala Arg Arg Leu Leu Glu Arg

385 390 395 400

Asp Ala ***

<210> 3

<211> 403

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MdtH(Q60R, V125I, F180L, L398P)

<400> 3

Met Ser Arg Val Ser Gln Ala Arg Asn Leu Gly Lys Tyr Phe Leu Leu

1 5 10 15

Ile Asp Asn Met Leu Val Val Leu Gly Phe Phe Val Val Phe Pro Leu

20 25 30

Ile Ser Ile Arg Phe Val Asp Gln Met Gly Trp Ala Ala Val Met Val

35 40 45

Gly Ile Ala Leu Gly Leu Arg Gln Phe Ile Gln Arg Gly Leu Gly Ile

50 55 60

Phe Gly Gly Ala Ile Ala Asp Arg Phe Gly Ala Lys Pro Met Ile Val

65 70 75 80

Thr Gly Met Leu Met Arg Ala Ala Gly Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala

85 90 95

His Glu Pro Trp Leu Leu Trp Phe Ser Cys Leu Leu Ser Gly Leu Gly

100 105 110

Gly Thr Leu Phe Asp Pro Pro Arg Ser Ala Leu Val Ile Lys Leu Ile

115 120 125

Arg Pro Gln Gln Arg Gly Arg Phe Phe Ser Leu Leu Met Met Gln Asp

130 135 140

Ser Ala Gly Ala Val Ile Gly Ala Leu Leu Gly Ser Trp Leu Leu Gln

145 150 155 160

Tyr Asp Phe Arg Leu Val Cys Ala Thr Gly Ala Val Leu Phe Val Leu

165 170 175

Cys Ala Ala Leu Asn Ala Trp Leu Leu Pro Ala Trp Lys Leu Ser Thr

180 185 190

Val Arg Thr Pro Val Arg Glu Gly Met Thr Arg Val Met Arg Asp Lys

195 200 205

Arg Phe Val Thr Tyr Val Leu Thr Leu Ala Gly Tyr Tyr Met Leu Ala

210 215 220

Val Gln Val Met Leu Met Leu Pro Ile Met Val Asn Asp Val Ala Gly

225 230 235 240

Ala Pro Ser Ala Val Lys Trp Met Tyr Ala Ile Glu Ala Cys Leu Ser

245 250 255

Leu Thr Leu Leu Tyr Pro Ile Ala Arg Trp Ser Glu Lys His Phe Arg

260 265 270

Leu Glu His Arg Leu Met Ala Gly Leu Leu Ile Met Ser Leu Ser Met

275 280 285

Met Pro Val Gly Met Val Ser Gly Leu Gln Gln Leu Phe Thr Leu Ile

290 295 300

Cys Leu Phe Tyr Ile Gly Ser Ile Ile Ala Glu Pro Ala Arg Glu Thr

305 310 315 320

Leu Ser Ala Ser Leu Ala Asp Ala Arg Ala Arg Gly Ser Tyr Met Gly

325 330 335

Phe Ser Arg Leu Gly Leu Ala Ile Gly Gly Ala Ile Gly Tyr Ile Gly

340 345 350

Gly Gly Trp Leu Phe Asp Leu Gly Lys Ser Ala His Gln Pro Glu Leu

355 360 365

Pro Trp Met Met Leu Gly Ile Ile Gly Ile Phe Thr Phe Leu Ala Leu

370 375 380

Gly Trp Gln Phe Ser Gln Lys Arg Ala Ala Arg Arg Leu Pro Glu Arg

385 390 395 400

Asp Ala ***

<210> 4

<211> 1209

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mdtH(V125I)

<400> 4

atgtcccgcg tgtcgcaggc gaggaacctg ggtaaatatt tcctgctcat cgataatatg 60

ctggtcgtgc tggggttctt tgttgtcttc ccgctgatct ctatccgctt cgttgatcaa 120

atgggctggg ccgccgtcat ggtcggtatt gctctcggtc tacgccaatt tattcagcaa 180

ggtctgggta ttttcggcgg tgcaattgcc gaccgctttg gtgccaaacc gatgattgtt 240

accggtatgc tgatgcgcgc cgccggattc gccacaatgg gtatcgccca cgaaccgtgg 300

ctattgtggt tttcatgcct gctctcggga ctcggtggca cgttgtttga tccgccgcgt 360

tcggcgctgg tgattaaatt aatccgtcca cagcagcgtg gtcgtttttt ctcgctgttg 420

atgatgcagg acagtgccgg tgcggtcatt ggcgcattgt tggggagctg gctgttgcaa 480

tacgactttc gcctggtctg cgccacaggg gcagttctat ttgtgctatg tgcggcgttc 540

aatgcgtggt tgttaccagc atggaaactc tccaccgtac gcacgcccgt tcgcgaaggc 600

atgacccgcg tgatgcgtga caagcgtttt gtcacctatg ttctgacgct ggcgggttac 660

tacatgctgg ctgtacaagt gatgctgatg ctgccaatta tggtcaacga cgtggctggc 720

gcgccctctg ccgttaaatg gatgtatgcc attgaagcgt gtctgtcgtt aacgttgctc 780

taccctatcg cccgctggag tgaaaagcat tttcgtctgg aacaccggtt gatggctggg 840

ctgttgataa tgtcattaag catgatgccg gtgggcatgg tcagcggcct gcaacaactt 900

ttcaccctga tttgtctgtt ttatatcggg tcgatcattg ccgagcctgc gcgtgaaacc 960

ttaagtgctt cgctggcgga cgcaagagct cgcggcagct atatggggtt tagccgtctg 1020

ggtctggcga ttggcggcgc tattggttat atcggtggcg gctggctgtt tgacctgggc 1080

aaatcggcgc accagccaga gcttccgtgg atgatgctgg gcattattgg catcttcact 1140

ttccttgcgc tgggttggca gtttagccag aaacgcgccg cgcgtcgttt gcttgaacgc 1200

gacgcctga 1209

<210> 5

<211> 1209

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mdtH(Q60R, V125I, F180L, L398P)

<400> 5

atgtcccgcg tgtcgcaggc gaggaacctg ggtaaatatt tcctgctcat cgataatatg 60

ctggtcgtgc tggggttctt tgttgtcttc ccgctgatct ctatccgctt cgttgatcaa 120

atgggctggg ccgccgtcat ggtcggtatt gctctcggtc tacgccaatt tattcagcga 180

ggtctgggta ttttcggcgg tgcaattgcc gaccgctttg gtgccaaacc gatgattgtt 240

accggtatgc tgatgcgcgc cgccggattc gccacaatgg gtatcgccca cgaaccgtgg 300

ctattgtggt tttcatgcct gctctcggga ctcggtggca cgttgtttga tccgccgcgt 360

tcggcgctgg tgattaaatt aatccgtcca cagcagcgtg gtcgtttttt ctcgctgttg 420

atgatgcagg acagtgccgg tgcggtcatt ggcgcattgt tggggagctg gctgttgcaa 480

tacgactttc gcctggtctg cgccacaggg gcagttctat ttgtgctatg tgcggcgctc 540

aatgcgtggt tgttaccagc atggaaactc tccaccgtac gcacgcccgt tcgcgaaggc 600

atgacccgcg tgatgcgtga caagcgtttt gtcacctatg ttctgacgct ggcgggttac 660

tacatgctgg ctgtacaagt gatgctgatg ctgccaatta tggtcaacga cgtggctggc 720

gcgccctctg ccgttaaatg gatgtatgcc attgaagcgt gtctgtcgtt aacgttgctc 780

taccctatcg cccgctggag tgaaaagcat tttcgtctgg aacaccggtt gatggctggg 840

ctgttgataa tgtcattaag catgatgccg gtgggcatgg tcagcggcct gcaacaactt 900

ttcaccctga tttgtctgtt ttatatcggg tcgatcattg ccgagcctgc gcgtgaaacc 960

ttaagtgctt cgctggcgga cgcaagagct cgcggcagct atatggggtt tagccgtctg 1020

ggtctggcga ttggcggcgc tattggttat atcggtggcg gctggctgtt tgacctgggc 1080

aaatcggcgc accagccaga gcttccgtgg atgatgctgg gcattattgg catcttcact 1140

ttccttgcgc tgggttggca gtttagccag aaacgcgccg cgcgtcgttt gcctgaacgc 1200

gacgcctga 1209

<210> 6

<211> 1209

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> mdtH дикого типа

<400> 6

atgtcccgcg tgtcgcaggc gaggaacctg ggtaaatatt tcctgctcat cgataatatg 60

ctggtcgtgc tggggttctt tgttgtcttc ccgctgatct ctatccgctt cgttgatcaa 120

atgggctggg ccgccgtcat ggtcggtatt gctctcggtc tacgccaatt tattcagcaa 180

ggtctgggta ttttcggcgg tgcaattgcc gaccgctttg gtgccaaacc gatgattgtt 240

accggtatgc tgatgcgcgc cgccggattc gccacaatgg gtatcgccca cgaaccgtgg 300

ctattgtggt tttcatgcct gctctcggga ctcggtggca cgttgtttga tccgccgcgt 360

tcggcgctgg tggtgaaatt aatccgtcca cagcagcgtg gtcgtttttt ctcgctgttg 420

atgatgcagg acagtgccgg tgcggtcatt ggcgcattgt tggggagctg gctgttgcaa 480

tacgactttc gcctggtctg cgccacaggg gcagttctat ttgtgctatg tgcggcgttc 540

aatgcgtggt tgttaccagc atggaaactc tccaccgtac gcacgcccgt tcgcgaaggc 600

atgacccgcg tgatgcgtga caagcgtttt gtcacctatg ttctgacgct ggcgggttac 660

tacatgctgg ctgtacaagt gatgctgatg ctgccaatta tggtcaacga cgtggctggc 720

gcgccctctg ccgttaaatg gatgtatgcc attgaagcgt gtctgtcgtt aacgttgctc 780

taccctatcg cccgctggag tgaaaagcat tttcgtctgg aacaccggtt gatggctggg 840

ctgttgataa tgtcattaag catgatgccg gtgggcatgg tcagcggcct gcaacaactt 900

ttcaccctga tttgtctgtt ttatatcggg tcgatcattg ccgagcctgc gcgtgaaacc 960

ttaagtgctt cgctggcgga cgcaagagct cgcggcagct atatggggtt tagccgtctg 1020

ggtctggcga ttggcggcgc tattggttat atcggtggcg gctggctgtt tgacctgggc 1080

aaatcggcgc accagccaga gcttccgtgg atgatgctgg gcattattgg catcttcact 1140

ttccttgcgc tgggttggca gtttagccag aaacgcgccg cgcgtcgttt gcttgaacgc 1200

gacgcctga 1209

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 1

<400> 7

cacaggaaag atatcatgtc ccgcgtgtcg caggc 35

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 2

<400> 8

ttgcatgcct gcatcaggcg tcgcgttc 28

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 3

<400> 9

cacaggaaag atatcatgtc ccgcgtgtcg caggc 35

<210> 10

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> праймер 4

<400> 10

cttgcatgcc tgcagggcag taagggcagt gatc 34

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен полипептид, вовлеченный в получение O-фосфосерина, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на изолейцин. Также предложены полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, рекомбинантный микроорганизм рода Escherichia для получения O-фосфосерина, содержащий указанные полипептид или полинуклеотид. Также предложены способы получения О-фосфосерина, цистеина или производного цистеина с использованием указанного микроорганизма, и применение указанного полипептида для получения О-фосфосерина, для экскреции О-фосфосерина из микроорганизма, для получения цистеина или для получения производного цистеина. Изобретение обеспечивает продуцирование О-фосфосерина с высоким выходом. 10 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Полипептид, вовлеченный в получение O-фосфосерина, в котором аминокислота, соответствующая положению 125 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, заменена на изолейцин.

2. Полипептид по п. 1, где указанная аминокислота, соответствующая положению 125, представляет собой валин.

3. Полипептид по п. 1, где указанный вариант обладает O-фосфосерин-экспортирующей активностью.

4. Полипептид по п. 1, в котором аминокислота, соответствующая положению 60 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой глутамин или аргинин.

5. Полипептид по п. 1, в котором аминокислота, соответствующая положению 180 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой фенилаланин или лейцин.

6. Полипептид по п. 1, в котором аминокислота, соответствующая положению 398 в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой лейцин или пролин.

7. Полипептид по п. 1, где указанный вариант имеет идентичность последовательности не менее 80% и менее 100% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

8. Полипептид по п. 1, где указанный вариант состоит из полипептида, представленного в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.

9. Полинуклеотид, кодирующий полипептид по любому из пп. 1-8.

10. Рекомбинантный микроорганизм рода Escherichia для получения O-фосфосерина, содержащий полипептид по любому из пп. 1-8 или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид.

11. Рекомбинантный микроорганизм по п. 10, где указанный рекомбинантный микроорганизм дополнительно обладает активностью фосфосеринфосфатазы (SerB), ослабленной по сравнению с ее эндогенной активностью.

12. Способ получения O-фосфосерина, включающий культивирование в среде микроорганизма, содержащего полипептид по любому из пп. 1-8 или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид.

13. Способ получения цистеина, включающий:

а) культивирование в среде микроорганизма, содержащего полипептид по любому из пп. 1-8 или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, с получением таким образом O-фосфосерина или среды, содержащей O-фосфосерин; и

б) осуществление взаимодействия между сульфидом и О-фосфосеринсульфгидрилазой (OPSS) или микроорганизмом, экспрессирующим OPSS, и О-фосфосерином или средой, содержащей О-фосфосерин, полученными на стадии а).

14. Применение полипептида по любому из пп. 1-8 для получения О-фосфосерина.

15. Применение полипептида по любому из пп. 1-8 для экскреции О-фосфосерина из микроорганизма.

16. Способ получения производного цистеина, включающий:

а) культивирование в среде микроорганизма, содержащего полипептид по любому из пп. 1-8 или полинуклеотид, кодирующий указанный полипептид, с получением таким образом O-фосфосерина или среды, содержащей O-фосфосерин;

б) осуществление взаимодействия между сульфидом и О-фосфосеринсульфгидрилазой (OPSS) или микроорганизмом, экспрессирующим OPSS, и О-фосфосерином или средой, содержащей О-фосфосерин, полученными на стадии (а); и

в) превращение цистеина, полученного на стадии (б), в производное цистеина.

17. Применение полипептида по любому из пп. 1-8 для получения цистеина.

18. Применение полипептида по любому из пп. 1-8 для получения производного цистеина.