Рекомбинантный микроорганизм для получения L-глутаминовой кислоты и способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием Российский патент 2024 года по МПК C12N1/21 C12N15/77 C07K14/195 C12P13/14 

[Область техники]

Настоящее изобретение относится к продуцирующим L-глутаминовую кислоту микроорганизмам, содержащим белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий белок SbtA, а также к способам получения L-глутаминовой кислоты с использованием указанных микроорганизмов.

[Предшествующий уровень техники]

L-глутаминовая кислота, представляющая собой типичную аминокислоту, получаемую путем ферментации, является одной из важных аминокислот, которые широко применяются в области пищевых продуктов благодаря своему уникальному характерному вкусу, а также в области медицинских продуктов и в области других кормов для животных. Известны способы получения L-глутаминовой кислоты с использованием микроорганизмов рода Corynebacterium, Escherichia coli, рода Bacillus, Streptomyces, Penicillium, Klebsiella, Erwinia или Pantoea и т.п. (патенты США №3220929 и 6682912).

В настоящее время проводятся различные исследования для разработки микроорганизмов и технологии процесса ферментации, которые обеспечивают получение L-глутаминовой кислоты с высокой эффективностью. Например, для повышения выработки L-глутаминовой кислоты в основном применяют подходы, специализированные для целевого вещества, такие как повышение экспрессии генов, кодирующих ферменты, участвующие в биосинтезе аминокислот, или удаление генов, которые не являются необходимыми для биосинтеза аминокислот, в микроорганизмах рода Corynebacterium (патенты США №9109242 В2 и 8030036 В2).

[Техническая проблема]

Авторы настоящего изобретения провели интенсивные исследования по получению L-глутаминовой кислоты в высокой концентрации, в результате которых разработали микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-глутаминовую кислоту в высокой концентрации благодаря введению в него экзогенного белка, создав, таким образом, настоящее изобретение.

[Техническое решение]

Задачей настоящего изобретения является обеспечение рекомбинантного микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-глутаминовую кислоту, где указанный рекомбинантный микроорганизм содержит белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA.

Задачей настоящего изобретения также является обеспечение способа получения L-глутаминовой кислоты, включающего культивирование в среде рекомбинантного микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-глутаминовую кислоту, где указанный рекомбинантный микроорганизм содержит белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA.

[Полезные эффекты]

Рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-глутаминовую кислоту и содержащий белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA, может продуцировать L-глутаминовую кислоту с высоким выходом и, таким образом, может быть с успехом использован в промышленном производстве L-глутаминовой кислоты.

[Краткое описание графических материалов]

ФИГ. 1 представляет собой схематическое изображение плазмиды pDCM2.

[Лучший вариант]

Настоящее изобретение будет конкретно описано следующим образом. Каждое описание и воплощение, раскрытое в настоящем документе, также может быть применено к другим описаниям и воплощениям. То есть все комбинации различных элементов, раскрытые в настоящем документе, входят в объем настоящего изобретения. Кроме того, объем настоящего изобретения не ограничивается приведенным ниже конкретным описанием. Также специалисты в данной области техники обнаружат или будут способны установить, используя лишь стандартные эксперименты, многие эквиваленты для конкретных воплощений настоящего изобретения, описанных в настоящем документе. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются настоящим изобретением.

В соответствии с одним из аспектом настоящего изобретения предложен рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-глутаминовую кислоту, где указанный рекомбинантный микроорганизм содержит белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA.

В настоящем документе термин «белок SbtA» относится, в качестве одного из переносчиков бикарбоната, к одному из белков, участвующих в ускорении переработки диоксида углерода (СО₂) путем стимулирования прохождения через мембраны бикарбоната НСО₃^-, для которого мембраны являются непроницаемыми, и экспрессирующихся для поглощения и эффективного использования диоксида углерода. Переносчики бикарбоната включают белок SbtA, белок BicA и т.п., которые транспортируют бикарбонат в клетки, что приводит к накоплению бикарбоната в клетках.

В настоящем изобретении белок SbtA может представлять собой белок, имеющий происхождение из микроорганизма, отличного от микроорганизма согласно настоящему изобретению, или может отличаться от белка, который изначально присутствует в микроорганизме согласно настоящему изобретению.

В настоящем изобретении белок SbtA может представлять собой белок, имеющий происхождение из цианобактерий, но не ограничивается этим. В частности, белок SbtA представлять собой белок, имеющий происхождение из микроорганизма рода Synechocystis, и, более конкретно, он может представлять собой белок, имеющий происхождение из Synechocystis sp.РСС 6803 или Synechocystis sp.РСС 6714.

Белок SbtA согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности последовательностей с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 1 может быть получена из известной базы данных GenBank Национального института здравоохранения США (NIH). В частности, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 1 согласно настоящему изобретению, может представлять собой аминокислотную последовательность, имеющую гомологию или идентичность с SEQ ID NO: 1, составляющую по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 96,26%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 97,5%, по меньшей мере 97,7%, по меньшей мере 97,8%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 98,5%, по меньшей мере 98,7%, по меньшей мере по меньшей мере 98,8%, по меньшей мере 99%, по меньшей мере 99,5%, по меньшей мере 99,7% или по меньшей мере 99,8%, но менее 100%. Например, аминокислотная последовательность, имеющая по меньшей мере 90%, но менее 100% гомологии или идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, может представлять собой аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 30. Также очевидно, что, когда аминокислотная последовательность имеет такую гомологию или идентичность и демонстрирует активность, эквивалентную или соответствующую активности белка SbtA или переносчика бикарбоната, то белок, содержащий такую аминокислотную последовательность, также подпадает под определение белка SbtA согласно настоящему изобретению даже несмотря на то, что часть его аминокислотной последовательности содержит делецию, модификацию, консервативную замену или добавление.

Белок SbtA согласно настоящему изобретению может содержать аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Кроме того, белок SbtA согласно настоящему изобретению может содержать, состоять из или состоять по существу из аминокислотной последовательности, имеющей по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. Белок SbtA согласно настоящему изобретению не исключает добавление несмысловой последовательности до или после аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1 (то есть добавление последовательности, которая не изменяет функции белка, к N-концу и/или С-концу аминокислотной последовательности), или природную мутацию, или молчащую мутацию, или консервативную замену.

В белке SbtA термин «консервативная замена» относится к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту, имеющую сходные структурные и/или химические свойства. Такая аминокислотная замена обычно может возникать на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы остатков. Как правило, консервативная замена может иметь незначительное влияние или не иметь влияния на активность белка или полипептида.

В настоящем изобретении полинуклеотид, кодирующий белок SbtA, может представлять собой ген sbtA. Кроме того, полинуклеотид, кодирующий белок SbtA, может иметь происхождение из цианобактерий. В частности, полинуклеотид, кодирующий белок SbtA согласно настоящему изобретению, может содержать нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. В частности, полинуклеотид, кодирующий белок SbtA согласно настоящему изобретению, может содержать нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31 или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с указанными последовательностями и кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, но не ограничивается этим. Полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, может представлять собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, или полинуклеотид, состоящий из или состоящий по существу из нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1.

В настоящем документе термин «полинуклеотид» относится к полимеру из нуклеотидов, в котором нуклеотидные мономеры соединены в форме цепи посредством ковалентных связей, и который представляет собой цепь ДНК, имеющую заданную или большую длину.

Очевидно, что, когда полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 31 или нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с указанными нуклеотидными последовательностями и кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1, то такой полинуклеотид подпадает под определение полинуклеотида согласно настоящему изобретению даже несмотря на присутствие делеции, модификации, консервативной замены или добавления в части каждой из указанных нуклеотидных последовательностей. В полинуклеотиде согласно настоящему изобретению термин «консервативная замена» относится к замене одного нуклеотида на другой нуклеотид, имеющий сходные структурные и/или химические свойства.

Полинуклеотид согласно настоящему изобретению может содержать различные модификации в его кодирующей области в тех пределах, в которых последовательность полинуклеотида не изменена вследствие вырожденности кодонов или при замене кодонов на предпочтительные для организма, в котором предполагается экспрессия полинуклеотида.

В частности, полинуклеотид согласно настоящему изобретению может представлять собой полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2.

Кроме того, полинуклеотид согласно настоящему изобретению может содержать, без ограничения, любую полинуклеотидную последовательность, которая может гибридизоваться с зондом, получаемым из известной последовательности гена sbtA, например, последовательность, комплементарную части или всей нуклеотидной последовательности в жестких условиях, при этом указанная полинуклеотидная последовательность может повышать способность продуцировать L-глутаминовую кислоту не будучи природной последовательностью, присутствующей в микроорганизме для введения.

В качестве альтернативы, полинуклеотид согласно настоящему изобретению может содержать, без ограничения, любую последовательность, которая может гибридизоваться с зондом, получаемым из известной последовательности гена, например, последовательность, комплементарную части или всей полинуклеотидной последовательности согласно настоящему изобретению в жестких условиях. Термин «жесткое условие» относится к условию, которое обеспечивает специфичную гибридизацию между полинуклеотидами. Эти условия подробно описаны в литературе (см. J. Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8). Примеры жестких условий могут включать: условие, при котором полинуклеотиды, имеющие более высокую гомологию или идентичность, например, полинуклеотиды, имеющие по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 76%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% гомологии или идентичности гибридизуются друг с другом, но полинуклеотиды, имеющие более низкую гомологию или идентичность, не гибридизуются друг с другом; или условие, при котором промывку выполняют один раз, в частности два или три раза, при концентрации соли и температуре, составляющим 60°С, 1×раствор цитрата и хлорида натрия (SSC), 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), в частности 60°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, и, более конкретно, 68°С, 0,1×SSC, 0,1% SDS, что соответствует условиям промывки для типичной гибридизации по Саузерну.

Для гибридизации требуются две нуклеиновые кислоты, имеющие комплементарные последовательности, хотя возможны ошибочные спаривания между нуклеотидами в зависимости от строгости гибридизации. Термин «комплементарный» используется для иллюстрации взаимосвязи между нуклеотидами, которые могут гибридизоваться друг с другом. Например, что касается ДНК, то аденин комплементарен тимину, а цитозин комплементарен гуанину. Таким образом, полинуклеотид согласно настоящему изобретению также может содержать не только по существу сходные последовательности нуклеиновых кислот, но также и выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, комплементарные всей последовательности.

В частности, полинуклеотид, имеющий гомологию или идентичность с полинуклеотидом согласно настоящему изобретению, можно детектировать с использованием описанных выше условий и с использованием условий гибридизации, включая стадию гибридизации при T_m 55°С. Кроме того, значение T_m может составлять 60°С, 63°С или 65°С, но не ограничивается этим, и может регулироваться соответствующим образом в зависимости от цели специалистом в данной области техники.

Надлежащая строгость гибридизации полинуклеотидов зависит от длины полинуклеотидов и степени комплементарности между ними, и определяющие строгость переменные величины хорошо известны в данной области техники (например, Sambrook et al., см. выше).

В настоящем документе термин «гомология» или «идентичность» относится к степени сходства между двумя заданными аминокислотными последовательностями или нуклеотидными последовательностями и может быть выражен в процентах. Термины гомология и идентичность часто могут использоваться взаимозаменяемо.

Гомология или идентичность последовательностей консервативных полинуклеотидов или полипептидов может быть определена с использованием стандартного алгоритма выравнивания, и штрафы за пропуски, установленные по умолчанию в используемой программе, могут использоваться вместе. По существу, гомологичные или идентичные последовательности обычно могут гибридизоваться друг с другом полностью или частично в условиях умеренной или высокой жесткости. Очевидно, что гибридизация также включает гибридизацию с полинуклеотидом, содержащим обычные кодоны или кодоны, используемые с учетом вырожденности кодонов в полинуклеотиде.

Наличие гомологии, сходства или идентичности каких-либо двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей можно определить с использованием известного компьютерного алгоритма, такого как программа «FASTA», с использованием параметров по умолчанию, как описано в Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444. В качестве альтернативы, это может быть определено с помощью алгоритма Нидлмана-Вунша (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443-453), который выполняется так же, как и в программе Нидлмана из Европейского открытого пакета программного обеспечения для молекулярной биологии (EMBOSS) (Rice et al. 2000, Trends Genet. 16:276-277) (версия 5.0.0 или более поздние версии) (включая программный пакет GCG (Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. et al. J MOLEC BIOL 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994 и CARILLO et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Например, гомология, сходство или идентичность могут быть определены с использованием алгоритмов BLAST или ClustalW Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Гомология, сходство или идентичность полинуклеотидов или полипептидов могут быть определены путем сравнения информации о последовательностях с помощью компьютерной программы GAP, например, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443, как известно в Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482. Вкратце, программа GAP определяет гомологию, сходство или идентичность как значение, полученное путем деления числа одинаковым образом выравненных символов (то есть нуклеотидов или аминокислот) на общее количество символов в более короткой из двух последовательностей. Параметры по умолчанию для программы GAP могут включать: (1) унарную матрицу сравнения (содержащую значение 1 для идентичности и 0 для не идентичности) и взвешенную матрицу сравнения согласно Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, как раскрыто в Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp.353-358 (1979) (или версию матрицы замещения EMOSSS NUC4.4 NCBI);

(2) штраф за каждый пропуск 3,0 и дополнительный штраф за каждый символ в каждом пропуске 0,10 (или штраф за открытие пропуска 10 и штраф за продление пропуска 0,5); и

(3) отсутствие штрафа за внесение концевого пропуска.

Белок SbtA, содержащийся в рекомбинантном микроорганизме согласно настоящему изобретению, может быть экспрессирован в микроорганизме рода Corynebacterium с применением обычного способа, известного в данной области техники.

В настоящем документе термин «экспрессия» применительно к белку относится к состоянию, в котором целевой белок введен в микроорганизм или целевой белок модифицирован для экспрессии в микроорганизме. Для целей настоящего изобретения «целевой белок» может представлять собой описанный выше белок SbtA.

В настоящем документе термин «введение» применительно к белку относится к введению активности конкретного белка в микроорганизм, в котором отсутствует активность этого белка. Этот термин также может быть выражен как повышение активности конкретного белка в микроорганизме, в котором отсутствует активность этого белка.

Введение белка может быть осуществлено путем введения в клетку-хозяина экзогенного полинуклеотида, кодирующего белок, демонстрирующий эквивалентную целевому белку/сходную с целевым белком активность, или оптимизированного по кодонам полинуклеотида мутантного типа. Экзогенный полинуклеотид может быть применен без ограничений по его происхождению или последовательности при условии, что этот экзогенный полинуклеотид демонстрирует эквивалентную целевому белку/сходную с целевым белком активность. Кроме того, для оптимизации транскрипции и трансляции введенного экзогенного полинуклеотида в клетке-хозяине его кодон может быть оптимизирован и введен в клетку-хозяина. Введение может быть осуществлено с применением любого известного способа трансформации, выбранного соответствующим образом специалистом в данной области техники, и посредством экспрессии введенного полинуклеотида в клетке-хозяине продуцируется белок, активность которого может быть повышена.

В настоящем документе термин «повышение» активности полипептида относится к увеличению активности полипептида по сравнению с его эндогенной активностью. «Повышение» может использоваться взаимозаменяемо с терминами «активация», «повышающая регуляция», «сверхэкспрессия», «увеличение» и т.п. В настоящем документе «активация», «повышение», «повышающая регуляция», «сверхэкспрессия» и «увеличение» могут включать все из следующего: проявление изначально отсутствующей активности; или проявление активности, улучшенной по сравнению с эндогенной активностью или активностью до модификации. «Эндогенная активность» относится к активности конкретного полипептида, изначально присущей родительскому штамму до модификации, или активности немодифицированного микроорганизма, когда трансформация происходит вследствие генетической вариации, вызванной природными или искусственными факторами. Указанный термин может использоваться взаимозаменяемо с «активностью до модификации». «Повышение», «повышающая регуляция», «сверхэкспрессия» или «увеличение» активности полипептида по сравнению с его собственной активностью означает повышение активности и/или концентрации (уровня экспрессии) конкретного полипептида, изначально присущей родительскому штамму до модификации или немодифицированному микроорганизму.

Такое повышение может быть обеспечено путем введения экзогенного полипептида или повышения присущей полипептиду активности и/или его концентрации (уровня экспрессии). Повышение активности полипептида можно идентифицировать по увеличению степени активности или уровня экспрессии соответствующего полипептида или количества продукта, получаемого с помощью соответствующего полипептида.

Повышение активности полипептида может быть обеспечено путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники, и не ограничивается ими при условии, что активность целевого полипептида повышена по сравнению с микроорганизмом до модификации. В частности, можно использовать генетическую и/или белковую инженерию, хорошо известную специалисту в данной области техники, которая является стандартным методом молекулярной биологии, но не ограничиваясь этим (например, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 и т.д.).

В частности, повышение активности полипептида согласно настоящему изобретению может представлять собой:

1) увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид;

2) замену области, регулирующей экспрессию гена, на хромосоме, кодирующей полипептид, на последовательность с высокой активностью;

3) модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или область 5-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид;

4) модификацию аминокислотной последовательности полипептида для повышения активности полипептида;

5) модификацию полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, для повышения активности полипептида (например, модификацию полинуклеотидной последовательности гена полипептида, таким образом, чтобы он кодировал полипептид, модифицированный для повышения активности);

6) введение экзогенного полипептида, демонстрирующего активность целевого полипептида, или кодирующего его экзогенного полинуклеотида;

7) оптимизацию кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид;

8) модификацию или химическую модификацию подвергаемого воздействию участка, выбранного с помощью анализа третичной структуры полипептида; или

9) комбинацию двух или более пунктов, выбранных из пунктов (1)-(8), без ограничения конкретно ими.

Приведенные пункты более конкретно описаны следующим образом.

Увеличение числа внутриклеточных копий полинуклеотида, кодирующего полипептид, согласно пункту (1) может быть обеспечено путем введения в клетку-хозяина вектора, с которым функционально связан полинуклеотид, кодирующий соответствующий полипептид, и который может реплицироваться и функционировать независимо от хозяина. В качестве альтернативы, пункт (1) может быть обеспечен путем введения одной копии или двух или более копий полинуклеотида, кодирующего соответствующий полипептид, в хромосому клетки-хозяина. Введение в хромосому может быть осуществлено путем введения в клетку-хозяина вектора, способного встраивать полинуклеотид в хромосому клетки-хозяина, но не ограничивается этим.

Замена области, регулирующей экспрессию гена, на хромосоме, кодирующей полипептид, на последовательность с высокой активностью согласно пункту (2) может представлять собой, например, мутацию, вводимую в последовательность путем делеции, инсерции, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации для дополнительного повышения активности регулирующей экспрессию области, либо замену последовательностью, обладающей более высокой активностью. Регулирующая экспрессию область может содержать, но не ограничивается конкретно этим, промотор, операторную последовательность, последовательность, кодирующую сайт связывания рибосомы, последовательность, регулирующую терминацию транскрипции и трансляции, и т.п. Например, замена может представлять собой замену исходного промотора на сильный промотор, но не ограничивается этим.

Известными примерами сильного промотора могут являться промоторы CJ1-CJ7 (US 7662943 В2), промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор PR фага лямбда, промотор PL фага лямбда, промотор tet, промотор gapA, промотор SPL7, промотор SPL13 (sm3) (US 10584338 В2), промотор 02 (US 10273491 В2), промотор tkt, промотор уссА и т.п., но не ограничиваются этим.

Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или область 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид, согласно пункту (3) может представлять собой, например, замену на нуклеотидную последовательность, кодирующую инициирующий кодон, обеспечивающий более высокую скорость экспрессии полипептида по сравнению с эндогенным инициирующим кодоном, но не ограничивается этим.

Модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности согласно пунктам (4) и (5) может представлять собой мутацию, вводимую путем делеции, инсерции, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации в аминокислотную последовательность полипептида или полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид, для повышения активности полипептида, или замену на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для усиления активности, или на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для повышения активности, но не ограничивается этим. В частности, замена может быть осуществлена путем встраивания полинуклеотида в хромосому посредством гомологичной рекомбинации, но не ограничивается этим. Вектор, применяемый в настоящем изобретении, может дополнительно содержать селективный маркер для проверки встраивания в хромосому. Селективный маркер используют для отбора клеток, трансформированных вектором, то есть для подтверждения того, что целевая молекула нуклеиновой кислоты была встроена, и могут быть применены маркеры, которые обеспечивают селектируемые фенотипы (например, устойчивость к лекарственным средствам, ауксотрофию, устойчивость к цитотоксическим агентам, экспрессию поверхностно-модифицированных белков и т.д.). В условиях обработки селективными агентами только клетки, способные экспрессировать селективные маркеры, могут выживать или демонстрировать другие фенотипические признаки, что обеспечивает легкую селекцию трансформированных клеток.

Введение экзогенного полипептида, демонстрирующего активность целевого полипептида, согласно пункту (6) может представлять собой введение в клетку-хозяина экзогенного полинуклеотида, кодирующего полипептид, демонстрирующий эквивалентную целевому полипептиду/сходную с целевым полипептидом активность. Экзогенный полинуклеотид не имеет ограничений по его происхождению или последовательности при условии, что экзогенный полинуклеотид демонстрирует эквивалентную целевому полипептиду/сходную с целевым полипептидом активность. Введение может быть осуществлено с применением любого известного способа трансформации, выбранного соответствующим образом специалистом в данной области техники, и посредством экспрессии введенного полинуклеотида в клетке-хозяине продуцируется полипептид, активность которого может быть повышена.

Оптимизация кодонов полинуклеотида, кодирующего полипептид, согласно пункту (7) может представлять собой оптимизацию кодонов эндогенного полинуклеотида для увеличения его транскрипции или трансляции в клетке-хозяине или оптимизацию кодонов экзогенного полинуклеотида для оптимизации его транскрипции или трансляции в клетке-хозяине.

Модификация или химическая модификация подвергаемого воздействию участка, выбранного с помощью анализа третичной структуры полипептида, согласно пункту (8) может быть осуществлена, например, таким образом, что эталонные белки-кандидаты определяют в соответствии со степенью сходства последовательностей путем сравнения информации о последовательности подлежащего анализу полипептида с информацией о последовательностях белков, хранящейся в базе данных, подвергаемый воздействию участок, подлежащий модификации или химической модификации, выбирают путем идентификации структуры на основе кандидатов, и подвергаемый воздействию участок модифицируют или химически модифицируют.

Такое повышение активности полипептида может означать увеличение активности или концентрации (уровня экспрессии) соответствующего полипептида по сравнению с активностью или концентрацией полипептида, экспрессируемого в штаммах микроорганизмов дикого типа или немодифицированных штаммах; или увеличение количества продукта, получаемого с помощью соответствующего полипептида, но не ограничивается этим.

Модификация части или всего полинуклеотида в микроорганизме согласно настоящему изобретению может быть обусловлена: (а) редактированием генома с применением гомологичной рекомбинации или сконструированной нуклеазы (например, CRISPR-Cas9) с использованием вектора для хромосомного встраивания в микроорганизм и/или (б) обработку светом, таким как ультрафиолетовый свет и излучение, и/или химическими веществами, без ограничения этим. Способ модифицирования части или всего гена может включать способ с использованием технологии рекомбинантной ДНК. Например, нуклеотидная последовательность или вектор, содержащие нуклеотидную последовательность, гомологичную целевому гену, могут быть введены в микроорганизм для обеспечения гомологичной рекомбинации, приводящей к делеции части или всего гена. Вводимые нуклеотидная последовательность или вектор могут содержать доминантный селективный маркер, но не ограничиваются этим.

В настоящем документе термин «вектор» относится к конструкции ДНК, которая содержит целевую полинуклеотидную последовательность, функционально связанную с подходящей регуляторной последовательностью таким образом, что целевой ген может быть введен соответствующему хозяину. Регуляторная последовательность может содержать промотор, способный инициировать транскрипцию, любую операторную последовательность для регуляции транскрипции, последовательность для кодирования подходящего сайта связывания рибосомы с мРНК и последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции. После трансформации в подходящего хозяина вектор может реплицироваться или функционировать независимо от генома хозяина, либо может интегрироваться в сам геном. Например, целевой полинуклеотид в хромосоме может быть заменен на модифицированный полинуклеотид с помощью вектора для хромосомного встраивания в клетку. Встраивание полинуклеотида в хромосому может быть осуществлено с использованием любого способа, известного в данной области техники, например, гомологичной рекомбинации, но не ограничивается этим.

Вектор согласно настоящему изобретению конкретно не ограничивается, и может быть использован любой вектор, известный в данной области техники. Примеры широко используемых векторов могут включать природные или рекомбинантные плазмиды, космиды, вирусы и бактериофаги. Например, в качестве фаговых векторов или космидных векторов могут быть использованы pWE15, М13, MBL3, MBL4, ГХII, ASHII, АРII, t10, t11, Charon4A, Charon21 А и т.п.; и векторы на основе pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL и pET могут быть использованы в качестве плазмидных векторов. В частности, может быть использован вектор pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118 или pCC1BAC. Более конкретно, вектор, применяемый в настоящем изобретении, может представлять собой pDCM2 (ФИГ. 1, SEQ ID NO: 32), сконструированный для встраивания и замены гена в хромосоме Corynebacterium, но не ограничивающийся конкретно этим, и может быть применен известный вектор экспрессии.

В настоящем документе термин «трансформация» означает, что вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий целевой белок, вводят в клетку-хозяина для экспрессии кодируемого полинуклеотидом белка в клетке-хозяине. Трансформированный полинуклеотид может включать любой полипептид, который может экспрессироваться в клетке-хозяине, независимо от того, встроен ли полинуклеотид в хромосому и расположен в ней или расположен вне хромосомы клетки-хозяина. Кроме того, полинуклеотид включает ДНК и РНК, кодирующие целевые белки. Полинуклеотид может быть введен в любой форме при условии, что он может быть введен в клетку-хозяина и экспрессирован в ней. Например, полинуклеотид может быть введен в форме экспрессионной кассеты, которая представляет собой генетическую конструкцию, содержащую все факторы, необходимые для автономной экспрессии. Экспрессионная кассета обычно может содержать промотор, функционально связанный с полинуклеотидом, сигнал терминации транскрипции, сайт связывания рибосомы и сигнал терминации трансляции. Экспрессионная кассета может находиться в форме вектора экспрессии, обеспечивающего автономную репликацию. Кроме того, полинуклеотид может быть введен введен в клетку-хозяина сам по себе и функционально связан с последовательностью, необходимой для экспрессии в клетке-хозяине, без ограничения этим.

В настоящем документе термин «функционально связанный» относится к функциональной связи между последовательностью гена и промоторной последовательностью для инициации и обеспечения транскрипции полинуклеотида, кодирующего целевой белок согласно настоящему изобретению.

Способ трансформации вектором согласно настоящему изобретению включает любой способ введения нуклеиновой кислоты в клетку, и любая подходящая стандартная методика, известная в данной области техники, может быть выбрана и выполнена в зависимости от клетки-хозяина. Примерами методик могут являться электропорация, осаждение фосфатом кальция (CaPO₄), осаждение хлоридом кальция (CaCl₂), микроинъекция, метод с использованием полиэтиленгликоля (PEG), метод с использованием DEAE (диэтиламиноэтил)-декстрана, метод катионных липосом, метод с использованием ацетата лития-DMSO (диметилсульфоксид) и т.п., но не ограничиваясь этим.

В настоящем документе термин «рекомбинантный микроорганизм» включает все микроорганизмы с искусственными генетическими модификациями и относится к микроорганизму, в котором конкретный механизм ослаблен или усилен вследствие встраивания экзогенного гена для экспрессии экзогенного белка или усиления или ослабления активности эндогенного гена и который может представлять собой микроорганизм, содержащий генетическую модификацию для получения целевого белка или продукта.

Например, рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой: микроорганизм, генетически модифицированный с помощью любого из белка SbtA или полинуклеотида, кодирующего белок SbtA, и вектора, содержащего полинуклеотид; микроорганизм, модифицированный для экспрессии данного белка или полинуклеотида, кодирующего данный белок; рекомбинантный микроорганизм, экспрессирующий данный белок или кодирующий его полинуклеотид; или рекомбинантный микроорганизм, обладающий активностью данного белка, но не ограничивается этим.

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм, обладающий повышенной способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту за счет дополнительного усиления активности некоторых белков в пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты или дополнительного ослабления активности некоторых белков в пути деградации L-глутаминовой кислоты.

В частности, микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм с дополнительно ослабленной функцией белка OdhA. Более конкретно, микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой микроорганизм с делетированным геном OdhA. Последовательности белка OdhA могут быть получены из известной базы данных GenBank NCBI и, например, могут иметь номер доступа в базе данных GenBank WP 060564343.1, но не ограничиваются этим, и могут включать последовательности, демонстрирующие эквивалентную активность, без ограничения.

Ослабление функции белка OdhA или делеция гена OdhA являются лишь одним из примеров, и, не ограничиваясь этим, микроорганизм согласно настоящему изобретению может включать различные микроорганизмы, в которых повышена активность белков в пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты или снижена активность белков в пути деградации L-глутаминовой кислоты.

В качестве еще одного примера, рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть использован в качестве родительского штамма микроорганизма, обработанного соединением для обеспечения продуцирования L-глутаминовой кислоты, и указанное соединение может представлять собой, в частности, N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG), но не ограничивается этим.

Для целей настоящего изобретения рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению относится к микроорганизму с улучшенной способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту по сравнению с родительским штаммом до модификации, или к немодифицированному микроорганизму. «Немодифицированный микроорганизм» не исключает штамм, содержащий встречающуюся в микроорганизмах природную мутацию, и может представлять собой природный микроорганизм как таковой, микроорганизм дикого типа как таковой, или микроорганизм до регуляции уровня экспрессии гена, участвующего в пути биосинтеза L-глутаминовой кислоты, или микроорганизм до введения гена sbtA, который эндогенно не присутствует.

В настоящем изобретении родительский штамм может представлять собой Corynebacterium glutamicum дикого типа АТСС13869, Corynebacterium glutamicum со сниженной функцией OdhA в Corynebacterium glutamicum АТСС13869, штамм с делетированным OdhA в Corynebacterium glutamicum АТСС13869 или Corynebacterium glutamicum BL2 (номер доступа KFCC-11074, патент Кореи №10-0292299), полученный путем обработки штамма Corynebacterium glutamicum KFCC 10656 мутагенным агентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин (NTG).

В настоящем документе термин «ослабление» полипептида имеет смысл, включающий снижение или отсутствие активности по сравнению с характерной для полипептида активностью. «Ослабление» может использоваться взаимозаменяемо с «инактивацией», «недостаточностью», «понижающей регуляцией», «уменьшением», «снижением», «ослаблением» и т.п.

Ослабление функции также может включать: случай, когда активность самого полипептида снижена или устранена по сравнению с активностью самого полипептида, которой обладает исходный микроорганизм, вследствие мутации полинуклеотида, кодирующего этот полипептид, или подобного мутации события; случай, когда активность и/или концентрация (уровень экспрессии) целых полипептидов в клетке снижена по сравнению с природным штаммом за счет ингибирования экспрессии гена полинуклеотида, кодирующего этот полипептид, или ингибирования трансляции в этот полипептид; случай, когда экспрессия полинуклеотида не происходит; и/или случай, когда полипептид не обладает активностью несмотря на экспрессию полинуклеотида. «Эндогенная активность» относится к активности конкретного полипептида, изначально присущего родительскому штамму до модификации, или микроорганизму дикого типа или немодифицированному микроорганизму, когда трансформация происходит вследствие генетической вариации, вызванной природными или искусственными факторами. Этот термин может использоваться взаимозаменяемо с «активностью до модификации». «Ослабление функции», «инактивация», «недостаточность», «уменьшение», «понижающая регуляция», «снижение» или «ослабление» активности полипептида по сравнению с эндогенной активностью означает, что активность полипептида снижена по сравнению с активностью конкретного полипептида, изначально присущего родительскому штамму до модификации, или немодифицированному микроорганизму.

Снижение активности полипептида может быть обеспечено любым способом, известным в данной области техники, но не ограничивается этим, и может быть обеспечено путем применения различных способов, хорошо известных в данной области техники (например, Nakashima N et al. Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int JMolSci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, и т.д.).

В частности, ослабление функции полипептида согласно настоящему изобретению может представлять собой:

1) делецию части или всего гена, кодирующего полипептид;

2) модификацию регулирующей экспрессию области (или регулирующей экспрессию последовательности) для снижения экспрессии гена, кодирующего полипептид;

3) модификацию аминокислотной последовательности, составляющей полипептид, для устранения или снижения активности полипептида (например делецию/замену/добавление по меньшей мере одной аминокислоты в аминокислотной последовательности);

4) модификацию последовательности гена, кодирующего полинуклеотид, для устранения или снижения активности полипептида (например, делецию/замену/добавление по меньшей мере одного нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена полипептида, так что указанный ген кодирует полипептид, модифицированный для устранения или снижения его активности);

5) модификацию нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или область 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид;

6) введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), комплементарно связывающегося с транскриптом гена, кодирующего полипептид;

7) добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для формирования вторичной структуры, делающей невозможным присоединение рибосом;

8) добавление промотора, обеспечивающего транскрипцию в обратном направлении, к 3'-концу открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующей полипептид (инженерия с транскрипцией в обратном направлении, RTE); или

9) комбинацию двух или более пунктов, выбранных из пунктов (1)-(8), без ограничения конкретно ими.

Например, приведенные пункты описаны следующим образом.

Делеция части или всего гена, кодирующего полипептид, согласно пункту (1) может представлять собой удаление всего полинуклеотида, кодирующего эндогенный целевой белок в хромосоме, замену на полинуклеотид с делецией некоторых нуклеотидов или замену на маркерный ген.

Модификация регулирующей экспрессию области (или регулирующей экспрессию последовательности) согласно пункту (2) может представлять собой мутацию, вводимую в регулирующую экспрессию область (или регулирующую экспрессию последовательность) путем делеции, инсерции, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации, или замену на последовательность, обладающую более низкой активностью. Регулирующая экспрессию область включает промотор, операторную последовательность, последовательность для кодирования сайта связывания рибосомы и последовательность для регуляции терминации транскрипции и трансляции, но не ограничивается этим.

Модификация нуклеотидной последовательности, кодирующей инициирующий кодон или область 5'-UTR транскрипта гена, кодирующего полипептид, согласно пункту (5) может представлять собой, например, замену на нуклеотидную последовательность, кодирующую вместо эндогенного инициирующего кодона другой инициирующий кодон, обеспечивающий более низкую скорость экспрессии полипептида, но не ограничивается этим.

Модификация аминокислотной последовательности или полинуклеотидной последовательности согласно пунктам (3) и (4) может представлять собой модификацию последовательности посредством делеции, инсерции, неконсервативной или консервативной замены или их комбинации в аминокислотной последовательности полипептида или полинуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид, для снижения активности полипептида, или замену на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для снижения активности, или на аминокислотную последовательность или полинуклеотидную последовательность, модифицированную для устранения активности, но не ограничивается этим. Например, экспрессия гена может быть ингибирована или ослаблена путем введения мутации в полинуклеотидную последовательность с образованием терминирующего кодона.

Введение антисмыслового олигонуклеотида (например, антисмысловой РНК), комплементарно связывающегося с транскриптом гена, кодирующего полипептид, согласно пункту (6) можно найти, например, в литературе (Weintraub, Н. et al. Antisense-RNA as a Genetics, Vol. 1(1) 1986).

Добавление последовательности, комплементарной последовательности Шайна-Дальгарно, перед последовательностью Шайна-Дальгарно гена, кодирующего полипептид, для формирования вторичной структуры, делающей невозможным присоединение рибосом, согласно пункту (7) может сделать невозможной трансляцию мРНК или снизить ее скорость.

Добавление промотора, обеспечивающего транскрипцию в обратном направлении, к 3'-концу открытой рамки считывания (ORF) последовательности гена, кодирующей полипептид (инженерия с транскрипцией в обратном направлении, RTE), согласно пункту (8) может обеспечить образование антисмыслового полинуклеотида, комплементарного транскрипту гена, кодирующего полипептид, для снижения таким образом активности полипептида.

Рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению может представлять собой Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium deserti, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium callunae, Corynebacterium stationis, Corynebacterium singulare, Corynebacterium halotolerans, Corynebacterium striatum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium pollutisoli, Corynebacterium imitans, Corynebacterium testudinoris или Corynebacterium flavescens и, более конкретно, Corynebacterium glutamicum, но не ограничивается этим.

Рекомбинантный микроорганизм согласно настоящему изобретению может обладать повышенной или улучшенной способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту по сравнению с немодифицированными микроорганизмами.

В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, включающий культивирование рекомбинантного микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-глутаминовую кислоту, где указанный рекомбинантный микроорганизм содержит белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA.

«Белок SbtA», «полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA», и «рекомбинантный микроорганизм» имеют значения, описанные выше.

Белок SbtA может иметь происхождение из цианобактерий, но не ограничивается этим, как описано выше.

Белок SbtA может иметь по меньшей мере 90% идентичности с SEQ ID NO: 1, но не ограничивается этим, как описано выше.

Рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium может представлять собой Corynebacterium glutamicum, но не ограничивается этим, как описано выше.

В рекомбинантном микроорганизме функция OdhA может быть дополнительно снижена или OdhA может быть удален. Кроме того, OdhA может содержать аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, но не ограничивается этим, как описано выше.

Кроме того, рекомбинантный микроорганизм может быть применен в качестве родительского штамма для обработанного NTG микроорганизма, но не ограничивается этим, как описано выше.

В настоящем документе термин «культура» относится к выращиванию микроорганизма в надлежащим образом подобранных условиях. Процедура культивирования согласно настоящему изобретению может быть выполнена с использованием подходящих сред или условий культивирования, известных в данной области техники. Эта процедура культивирования может быть легко изменена и использована специалистом в данной области техники в зависимости от штамма. В частности, культивирование может представлять собой периодическое культивирование, непрерывное культивирование и культивирование с периодическим добавлением питательной среды, но не ограничивается этим.

В настоящем документе термин «среда» относится к смеси, содержащей в качестве основных ингредиентов питательные вещества, необходимые для культивирования микроорганизма, при этом среда обеспечивает питательные вещества, факторы роста и т.п., включая воду, необходимые для выживания и роста. В частности, что касается среды и других условий культивирования, применяемых для культивирования микроорганизма согласно настоящему изобретению, то любая среда, используемая для обычного культивирования микроорганизмов, может быть применена без конкретных ограничений. Однако микроорганизмы согласно настоящему изобретению можно культивировать в аэробных условиях в обычной среде, содержащей подходящие источники углерода, источники азота, источники фосфора, неорганические соединения, аминокислоты и/или витамины, при этом корректируют температуру, рН и т.п. В частности, культуральную среду для рода Corynebacterium можно найти в литературе ("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)).

В настоящем изобретении источники углерода могут включать: углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, сахароза и мальтоза; сахарные спирты, такие как маннит и сорбит; органические кислоты, такие как пировиноградная кислота, молочная кислота и лимонная кислота; и аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и лизин. Кроме того, могут использоваться природные органические источники питательных веществ, такие как гидролизаты крахмала, меласса, тростниковая меласса, рисовые отруби, маниока, багасса сахарного тростника и кукурузный экстракт и, в частности, углеводы, такие как глюкоза и стерильная предварительно обработанная меласса (то есть меласса, превращенная в восстановленные сахара), и подходящие количества других источников углерода могут использоваться без ограничения. Эти источники углерода могут использоваться по отдельности или в комбинации из двух или более источников, без ограничения этим.

Что касается источников азота, могут быть использованы неорганические источники азота, такие как аммиак, сульфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония; аминокислоты, такие как глутаминовая кислота, метионин и глутамин; и органические источники азота, такие как пептон, NZ-амин, мясные экстракты, дрожжевые экстракты, солодовые экстракты, кукурузный экстракт, гидролизаты казеина, рыба или продукты ее переработки, обезжиренный соевый жмых или продукты его переработки и т.п. Эти источники азота могут использоваться по отдельности или в комбинации из двух или более источников, без ограничения этим.

Источники фосфора могут включать одноосновный фосфат калия, двухосновный фосфат калия и соответствующие содержащие натрий соли. Что касается неорганических соединений, то могут быть использованы хлорид натрия, хлорид кальция, хлорид железа, сульфат магния, сульфат железа, сульфат марганца, карбонат кальция и т.п., и дополнительно могут быть включены аминокислоты, витамины и/или подходящие предшественники. Эти составляющие ингредиенты или предшественники можно добавлять в среду периодическим или непрерывным способом. Однако среда согласно настоящему изобретению не ограничивается этим.

рН среды можно регулировать путем добавления таких соединений как гидроксид аммония, гидроксид калия, аммиак, фосфорная кислота и серная кислота в среду подходящим способом в процессе культивирования микроорганизма. Кроме того, для подавления пенообразования может быть добавлен предупреждающий вспенивание агент, такой как полигликолевый эфир жирной кислоты. Кроме того, в среду может быть введен кислород или кислородсодержащий газ для поддержания аэробного состояния среды, или, для поддержания анаэробного или неаэробного состояния среды, может быть введен азот, водород или диоксид углерода, или газ можно не вводить, без ограничения этим.

Температура среды может составлять от 20°С до 45°С и, в частности, от 25°С до 40°С, но не ограничивается этим. Период культивирования может продолжаться до тех пор, пока не будет получено желаемое количество продуцируемого полезного вещества, и он может составлять, в частности, от 10 до 160 часов, но не ограничивается этим.

L-глутаминовая кислота, продуцируемая культурой, может высвобождаться в среду или может оставаться в клетках без высвобождения.

Способ получения L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению может дополнительно включать стадию получения рекомбинантного микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-глутаминовую кислоту, перед стадией культивирования или стадию приготовления среды для культивирования рекомбинантного микроорганизма.

Кроме того, способ получения L-глутаминовой кислоты согласно настоящему изобретению может дополнительно включать стадию извлечения L-глутаминовой кислоты из рекомбинантного микроорганизма или среды после стадии культивирования.

Способ извлечения L-глутаминовой кислоты может представлять собой сбор целевой L-глутаминовой кислоты с использованием подходящего способа, известного в данной области техники, в соответствии со способом культивирования микроорганизма согласно настоящему изобретению, например, способом периодического культивирования, непрерывного культивирования и культивирования с периодическим добавлением питательной среды. Например, могут быть использованы центрифугирование, фильтрование, анионообменная хроматография, кристаллизация, ВЭЖХ и т.п., и целевая L-глутаминовая кислота может быть извлечена из среды или микроорганизма с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.

Кроме того, стадия извлечения может включать процесс очистки и может быть проведена с использованием подходящего способа, известного в данной области техники.

Извлеченная L-глутаминовая кислота может находиться в очищенной форме или может представлять собой ферментационную жидкость, полученную при культивировании микроорганизма, содержащую L-глутаминовую кислоту, но не ограничивается этим.

В соответствии с еще одним аспектом настоящего изобретения предложена композиция для получения L-глутаминовой кислоты, содержащая: рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-глутаминовую кислоту, где указанный рекомбинантный микроорганизм содержит белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA; или среду, содержащую культивируемый в ней рекомбинантный микроорганизм.

«Белок SbtA», «полинуклеотид, кодирующий белок SbtA», «рекомбинантный микроорганизм» и «среда» имеют значения, описанные выше.

Композиция согласно настоящему изобретению может дополнительно содержать любой подходящий эксципиент, который обычно используют в композиции для получения L-глутаминовой кислоты, и примерами эксципиента могут являться консервирующий агент, смачивающий агент, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буфер, стабилизирующий агент или изотонический агент, но не ограничиваются этим.

[Осуществление изобретения]

Далее настоящее изобретение будет подробно описано со ссылкой на иллюстративные воплощения. Однако эти иллюстративные воплощения представляют собой исключительно предпочтительные воплощения для иллюстрации настоящего изобретения и, таким образом, не предназначены для ограничения объема прав настоящего изобретения. Между тем, технические вопросы, не описанные в настоящем документе, могут быть в достаточной степени поняты и легко реализованы специалистом в данной области техники или технических областях, сходных с областью, к которой относится настоящее изобретение.

Пример 1: Конструирование плазмиды

Была сконструирована плазмида (pDCM2, ФИГ. 1, SEQ ID NO: 32) для встраивания и замены гена в хромосоме Corynebacterium, и указанная плазмида была синтезирована с участием службы синтеза генов компании BIONICS Co., Ltd. Плазмида была сконструирована таким образом, что она содержала сайты для рестриктаз, облегчающие использование при клонировании, в соответствии со статьей, касающейся общеизвестной системы sacB (Gene, 145 (1994) 69-73). Синтезированная таким образом плазмида pDCM2 имела следующие характеристики.

1) Плазмида содержит точку начала репликации, функционирующую только в Е. coli, и, таким образом, ее автономная репликация возможна в Е. coli, но невозможна в Corynebacterium.

2) Плазмида содержит ген устойчивости к канамицину в качестве селективного маркера.

3) Плазмида содержит ген левансахарозы (sacB) в качестве маркера для вторичной позитивной селекции.

4) В окончательно сконструированном штамме не остается никакой генетической информации, полученной из плазмиды pDCM2.

Пример 2: Конструирование векторов для экспрессии переносчиков бикарбоната, полученных из цианобактерий

Для исследования улучшения способности продуцировать L-глутаминовую кислоту, когда при введении в штаммы генов sbtA и bicA, кодирующих переносчики бикарбоната (НСО₃^-), имеющие происхождение из цианобактерий, в частности Synechocystis sp. РСС6803, сначала были сконструированы векторы для экспрессии sbtA или bicA.

Для встраивания двух генов в Corynebacterium glutamicum была синтезирована последовательность полученного из Synechocystis sp. РСС6803 sbtA (SEQ ID NO: 3), оптимизированная по кодонам для Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 2), и последовательность полученного из Synechocystis sp. PCC6803 bicA (SEQ ID NO: 6), оптимизированная по кодонам для Corynebacterium glutamicum (SEQ ID NO: 5).

Вектор pDCM2 использовали для встраивания этих двух генов, и в качестве промотора для экспрессии использовали синтетический промотор CJ7 (патент Кореи №10-0620092 и WO 2006-065095).

В частности, вектор pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA и вектор pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA были сконструированы, соответственно, с использованием сайтов BBD29_01410 (в дальнейшем называемом CglE0286) и BBD29_00440 (в дальнейшем называемом CglE0085) в транспозазах или интегразах Corynebacterium glutamicum в качестве сайтов хромосомной гомологичной рекомбинации.

В частности, фрагменты гена из вышележащей и нижележащей областей CglE0286, где происходит хромосомная гомологичная рекомбинация, были получены с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы вместе с набором праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу Solg™ Pfu-X, и условия ПЦР-амплификации представляли собой следующие: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 58°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 60 секунд; и затем полимеризация при 72°С в течение 5 минут.

Амплифицированные вышележащую и нижележащую области CglE0286 и вектор pDCM2 для хромосомной трансформации, расщепленный рестриктазами EcoRI и SalI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона (DG Gibson et al. NATURE METHODS, Vol.6 No. 5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix) с получением таким образом рекомбинантной плазмиды, которая затем была названа pDCM2-ΔCglE0286. Клонирование выполняли путем смешивания реагента Гибсона для сборки фрагментов и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующим выдерживанием при 50°С в течение 1 часа.

ПЦР проводили с использованием синтезированного CJ7-sbtA, имеющего последовательность SEQ ID NO: 11, в качестве матрицы вместе с праймерами, имеющими последовательности SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, и фрагмент гена CJ7-sbtA получали с помощью ПЦР. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу Solg™ Pfu-X, и условия ПЦР-амплификации представляли собой следующие: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 58°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 60 секунд; и затем полимеризация при 72°С в течение 5 минут.

Амплифицированный CJ7-sbtA и вектор pDCM2-ΔCglE0286 для хромосомной трансформации, расщепленный рестриктазой SeaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением таким образом рекомбинантной плазмиды, которая затем была названа pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA. Клонирование выполняли путем смешивания реагента Гибсона для сборки фрагментов и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующим выдерживанием при 50°С в течение 1 часа.

Кроме того, фрагменты гена из вышележащей и нижележащей областей CglE0085, где происходит хромосомная гомологичная рекомбинация, были получены с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы вместе с набором праймеров, имеющих последовательности SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу Solg™ Pfu-X, и условия ПЦР-амплификации представляли собой следующие: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 58°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 60 секунд; и затем полимеризация при 72°С в течение 5 минут.

Амплифицированные вышележащую и нижележащую области CglE0085 и вектор pDCM2 для хромосомной трансформации, расщепленный рестриктазами EcoRI и SalI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением таким образом рекомбинантной плазмиды, которая затем была названа pDCM2-ΔCglE0085. Клонирование выполняли путем смешивания реагента Гибсона для сборки фрагментов и каждого из фрагментов гена в рассчитанном количестве молей с последующим выдерживанием при 50°С в течение 1 часа.

ПЦР проводили с использованием синтезированного CJ7-bicA, имеющего последовательность SEQ ID NO: 18, в качестве матрицы вместе с праймерами, имеющими последовательности SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13, с получением таким образом генного фрагмента CJ7-bicA. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу Solg™ Pfu-X, и условия ПЦР-амплификации представляли собой следующие: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 58°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 60 секунд; и затем полимеризация при 72°С в течение 5 минут.

Амплифицированный CJ7-bicA и вектор pDCM2-ΔCglE0085 для хромосомной трансформации, расщепленный рестриктазой ScaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением таким образом рекомбинантной плазмиды, которая затем была названа pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA. Клонирование выполняли путем смешивания реагента Гибсона для сборки фрагментов и каждого из генных фрагментов в рассчитанном количестве молей с последующим выдерживанием при 50°С в течение 1 часа.

Последовательности праймеров, применяемых в настоящем изобретении, представлены в Таблице 1 ниже.

Вектор pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA и вектор pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA, сконструированные таким образом, вводили в штаммы согласно следующим примерам.

Пример 3: Получение продуцирующего L-глутаминовую кислоту штамма, имеющего происхождение из Corynebacterium glutamicum дикого типа, и получение штаммов с введенными в них переносчиками бикарбоната

Пример 3-1: Получение Corynebacterium glutamicum, происходящего из Corynebacterium glutamicum дикого типа и обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту Для получения штамма, происходящего из Corynebacterium glutamicum АТСС13869 и обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, получали штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13869ΔodhA с делецией гена odhA на основании предшествующего уровня техники (Appl Environ Microbiol. 2007 Feb;73(4): 1308-19. Epub 2006 Dec 8.)

В частности, для осуществления делеции odhA вышележащую и нижележащую области гена odhA получали с помощью ПЦР с использованием хромосомной ДНК Corynebacterium glutamicum АТСС13869 в качестве матрицы вместе с набором праймеров с SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22. В качестве полимеразы использовали ДНК-полимеразу Solg™ Pfu-X, и условия ПЦР-амплификации представляли собой следующие: денатурация при 95°С в течение 5 минут; 30 циклов, включающих денатурацию при 95°С в течение 30 секунд, отжиг при 58°С в течение 30 секунд и полимеризацию при 72°С в течение 60 секунд; и затем полимеризация при 72°С в течение 5 минут.

Амплифицированные вышележащую и нижележащую области odhA и вектор pDCM2 для хромосомной трансформации, расщепленный рестриктазой SmaI, клонировали с использованием метода сборки Гибсона с получением таким образом рекомбинантной плазмиды, которая затем была названа pDCM2-ΔodhA. Клонирование выполняли путем смешивания реагента Гибсона для сборки фрагментов и каждого из генных фрагментов в рассчитанном количестве молей с последующим выдерживанием при 50°С в течение 1 часа.

Сконструированным вектором pDCM2-ΔodhA трансформировали штамм Corynebacterium glutamicum АТСС13869 путем электропорации с последующим вторичным кроссинговером с получением таким образом штамма с делецией гена odhA на хромосоме. Делецию гена идентифицировали с помощью ПЦР с использованием SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 24 и секвенирования генома, и полученный штамм был назван ATCC13869ΔodhA.

Последовательности использованных праймеров представлены в Таблице 2 ниже.

Пример 3-2: Получение штаммов с введенными в них переносчиками бикарбоната, имеющих происхождение из Corynebacterium glutamicum и обладающих способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту

Влияние введения переносчика бикарбоната на способность продуцировать L-глутаминовую кислоту исследовали путем введения вектора pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA и вектора pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA, сконструированных согласно примеру 2, в штамм ATCC13869ΔodhA, полученный согласно примеру 3-1.

В частности, сконструированным согласно примеру 2 вектором pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA трансформировали штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13869ΔodhA путем электропорации с последующим вторичным кроссинговером с получением таким образом штамма с инсерцией CJ7-sbtA в сайт CglE0286 на хромосоме.

Соответствующая генная манипуляция была идентифицирована с помощью ПЦР с использованием SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, обеспечивающих амплификацию внешних сайтов вышележащей и нижележащей областей гомологичной рекомбинации, в которые был введен ген CJ7-sbtA, и путем секвенирования генома, и полученный штамм был назван СА02-1474.

Кроме того, вектором pDCM2-ΔCglE0085::CJ7-bicA согласно примеру 2 трансформировали штамм Corynebacterium glutamicum ATCC13869ΔodhA путем электропорации с последующим вторичным кроссинговером с получением таким образом штамма с инсерцией CJ7-bicA в сайт CglE0085 на хромосоме.

Соответствующая генная манипуляция была идентифицирована с помощью ПЦР с использованием SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 28, обеспечивающих амплификацию внешних сайтов вышележащей и нижележащей областей гомологичной рекомбинации, в которые был введен ген CJ7-bicA, и путем секвенирования генома, и полученный штамм был назван СА02-1475.

Последовательности использованных праймеров представлены в Таблице 3 ниже.

Штаммы СА02-1474 и СА02-1475, полученные, как описано выше, культивировали следующим способом для исследования их способности продуцировать L-глутаминовую кислоту, при этом штамм ATCC13869ΔodhA использовали в качестве контроля.

Каждый штамм инокулировали в чашку со средой, состоящей из среды для посева, и культивировали при 30°С в течение 20 часов. Затем материал штамма с одной петли инокулировали в колбу с угловыми элементами объемом 250 мл, содержащую 25 мл среды для получения продукта, как указано ниже, и культивировали со встряхиванием при 30°С при 200 об./мин в течение 40 часов. После завершения культивирования количество полученной L-глутаминовой кислоты определяли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), и результаты определений представлены в Таблице 4.

<Среда для посева>

1% глюкозы, 0,5% говяжьего экстракта, 1% полипептона, 0,25% хлорида натрия, 0,5% дрожжевого экстракта, 2% агара, 0,2% мочевины, рН 7,2.

<Среда для получения продукта>

6% сахара-сырца, 5% карбоната кальция, 2,25% сульфата аммония, 0,1% монофосфата калия, 0,04% сульфата магния, 10 мг/л сульфата железа, 0,2 мг/л тиамина гидрохлорида, 50 мкг/л биотина.

Как показано в Таблице 4, концентрация L-глутаминовой кислоты была значительно повышена в штамме СА02-1474 с введенным в него геном sbtA по сравнению с АТСС13869ΔodhA геном или штаммом СА02-1475 с введенным в него геном bicA.

СА02-1474 был депонирован в Корейском центре хранения микроорганизмов, полномочие на хранение в соответствии с Будапештским договором от 28 июля 2020 года, и ему был присвоен номер доступа KССМ12775Р.

Пример 4: Получение штамма Corynebacterium glutamicum с введенным в него переносчиком бикарбоната, имеющего происхождение из N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидинового (NTG) мутанта и обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту

Для определения того, демонстрировал ли исследуемый ген эквивалентный эффект даже в штамме, имеющем происхождение из NTG мутанта Corynebacterium sp.и также обладающим повышенной способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, в дополнение к штамму, имеющему происхождение из Corynebacterium sp. дикого типа, ген был введен в штамм KFCC11074 (патент Кореи №10-0292299), известный как продуцирующий L-глутаминовую кислоту NTG мутант.

Вектором pDCM2-ΔCglE0286::CJ7-sbtA согласно примеру 2 трансформировали штамм KFCC11074 путем электропорации с последующим вторичным кроссинговером с получением таким образом штамма с инсерцией гена на хромосоме. Соответствующая генная манипуляция была идентифицирована с помощью ПЦР с использованием SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 и путем секвенирования генома, и штамм был назван СА02-1476.

Полученные штаммы СА02-1476 и Corynebacterium glutamicum KFCC11074 подвергали титриметрическому анализу в процессе ферментации в соответствии со следующим методом.

Каждый штамм инокулировали в чашку со средой, состоящей из среды для посева, и культивировали при 30°С в течение 20 часов. Затем материал штамма с одной петли инокулировали в колбу с угловыми элементами объемом 250 мл, содержащую 25 мл среды для получения продукта, и культивировали со встряхиванием при 30°С при 200 об/мин в течение 40 часов. После завершения культивирования количество полученной L-глутаминовой кислоты определяли посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), и результаты определений представлены в таблице 5.

<Среда для посева>

1% глюкозы, 0,5% говяжьего экстракта, 1% полипептона, 0,25% хлорида натрия, 0,5% дрожжевого экстракта, 2% агара, 0,2% мочевины, рН 7,2.

<Среда для получения продукта>

6% сахара-сырца, 5% карбоната кальция, 2,25% сульфата аммония, 0,1% монофосфата калия, 0,04% сульфата магния, 10 мг/л сульфата железа, 0,2 мг/л тиамина гидрохлорида, 500 мкг/л биотина.

Как показано в Таблице 5, штамм СА02-1476 демонстрировал повышение концентрации L-глутаминовой кислоты на 34,8% по сравнению со штаммом KFCC11074.

Из приведенного выше описания специалист в области техники, к которой относится настоящее изобретение, сможет понять, что настоящее изобретение может быть воплощено в других конкретных формах без отступления от его технической сущности или существенных признаков. В этом отношении иллюстративные воплощения, раскрытые в настоящем документе, предназначены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничивающие объем настоящего изобретения. Следует понимать, что все изменения или модификации, вытекающие из определений и объема формулы изобретения и их эквивалентов, входят в объем настоящего изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> СИДЖЕЙ ЧЕИЛДЖЕДАНГ КОРПОРЕЙШН

<120> Рекомбинантный микроорганизм для получения l-глутаминовой кислоты и

способ получения L-глутаминовой кислоты с его использованием

<130> OPA21083-PCT

<150> KR 10-2020-0115570

<151> 2020-09-09

<160> 32

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 374

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> SbtA

<400> 1

Met Asp Phe Leu Ser Asn Phe Leu Thr Asp Phe Val Gly Gln Leu Gln

1 5 10 15

Ser Pro Thr Leu Ala Phe Leu Ile Gly Gly Met Val Ile Ala Ala Leu

20 25 30

Gly Thr Gln Leu Val Ile Pro Glu Ala Ile Ser Thr Ile Ile Val Phe

35 40 45

Met Leu Leu Thr Lys Ile Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Ile Arg Asn

50 55 60

Ser Asn Leu Thr Glu Met Leu Leu Pro Val Ala Phe Ser Val Ile Leu

65 70 75 80

Gly Ile Leu Ile Val Phe Ile Ala Arg Phe Thr Leu Ala Lys Leu Pro

85 90 95

Asn Val Arg Thr Val Asp Ala Leu Ala Thr Gly Gly Leu Phe Gly Ala

100 105 110

Val Ser Gly Ser Thr Met Ala Ala Ala Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser

115 120 125

Lys Ile Ser Tyr Glu Ala Trp Ala Gly Ala Leu Tyr Pro Phe Met Asp

130 135 140

Ile Pro Ala Leu Val Thr Ala Ile Val Val Ala Asn Ile Tyr Leu Asn

145 150 155 160

Lys Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ala Ala Ser Ile Glu Glu Ser Phe Ser

165 170 175

Lys Gln Pro Val Ala Ala Gly Asp Tyr Gly Asp Gln Thr Asp Tyr Pro

180 185 190

Arg Thr Arg Gln Glu Tyr Leu Ser Gln Gln Glu Pro Glu Asp Asn Arg

195 200 205

Val Lys Ile Trp Pro Ile Ile Glu Glu Ser Leu Gln Gly Pro Ala Leu

210 215 220

Ser Ala Met Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly Ile Phe Thr Lys Pro Glu

225 230 235 240

Ser Val Tyr Glu Gly Phe Tyr Asp Pro Leu Phe Arg Gly Leu Leu Ser

245 250 255

Ile Leu Met Leu Ile Met Gly Met Glu Ala Trp Ser Arg Ile Gly Glu

260 265 270

Leu Arg Lys Val Ala Gln Trp Tyr Val Val Tyr Ser Leu Ile Ala Pro

275 280 285

Ile Val His Gly Phe Ile Ala Phe Gly Leu Gly Met Ile Ala His Tyr

290 295 300

Ala Thr Gly Phe Ser Leu Gly Gly Val Val Val Leu Ala Val Ile Ala

305 310 315 320

Ala Ser Ser Ser Asp Ile Ser Gly Pro Pro Thr Leu Arg Ala Gly Ile

325 330 335

Pro Ser Ala Asn Pro Ser Ala Tyr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Ile Gly

340 345 350

Thr Pro Ile Ala Ile Gly Val Cys Ile Pro Leu Phe Ile Gly Leu Ala

355 360 365

Gln Thr Leu Gly Ala Gly

370

<210> 2

<211> 1125

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Оптимизированный по кодонам sbtA

<400> 2

atggattttc tttctaattt cttgaccgac ttcgtgggtc aactgcagtc acccactctg 60

gcgtttctga tcggcggtat ggtaatcgcc gctctgggaa ctcaattggt tattcccgaa 120

gccatctcaa cgattatcgt tttcatgttg cttactaaaa ttggacttac cggaggtatg 180

gcgattcgga atagcaacct gaccgagatg cttttgcccg tggccttctc cgtcattttg 240

ggaattttga tcgtatttat cgcgcgtttc actttggcta agctccccaa tgtgcgcact 300

gtggacgccc ttgctacggg tggtctcttc ggtgcggtgt caggaagcac gatggccgcc 360

gccctgacta cgcttgagga atcaaaaatt tcatatgaag catgggcagg agctttgtac 420

ccttttatgg atattccggc cttggtcacg gcaattgttg ttgccaacat ctatttgaat 480

aaacggaaac gtaaaagcgc cgcagcatca atcgaagaga gcttctcgaa gcagcccgta 540

gcggctggcg actatggaga tcagactgat tatccacgta cccgtcagga atacctctct 600

cagcaagagc cggaggacaa tcgcgtcaaa atttggccaa tcattgaaga gtcgcttcaa 660

ggcccagccc tttcagctat gttgttggga cttgcactgg gtattttcac gaaacctgaa 720

tcggtgtatg agggattcta cgatcctctt tttcgcggac tcctgtcgat tctgatgctg 780

attatgggca tggaagcctg gagccgtatc ggcgagcttc gtaaggtagc tcagtggtat 840

gtcgtttact ctttgatcgc tccgatcgta cacggattta tcgcttttgg actgggtatg 900

atcgcccatt acgctacggg attcagcctc ggtggagtgg tcgttctggc cgtaattgcc 960

gcatcttctt ctgatatctc tggcccacct accctgcgtg ccggcattcc gagcgcaaat 1020

ccgtcggcat atatcggtag ctctactgca atcggaaccc ccatcgcaat cggtgtgtgt 1080

attcctctct tcatcggtct cgcccagacg cttggcgcgg gctaa 1125

<210> 3

<211> 1125

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> sbtA

<400> 3

atggattttt tgtccaattt cttgacggac ttcgtgggac aattgcagtc cccaacccta 60

gcctttctga ttggggggat ggttattgcc gcccttggca cccaattggt aattccagag 120

gcgatttcta cgatcatcgt ctttatgttg ctcactaaga ttggcctaac cgggggcatg 180

gcaattcgga actccaactt gacggaaatg ctcctacccg tggcattctc tgtgatattg 240

ggaattctta ttgtcttcat cgcccgtttt accctggcta aactgcctaa cgtcagaacc 300

gtggatgccc tggccaccgg cggcttgttt ggggcagtca gtggctctac aatggctgcc 360

gccctcacta cgttggaaga atcaaaaatt tcctacgaag cctgggctgg tgctctgtat 420

ccctttatgg atattcctgc cctggtaacg gcgatcgtcg tagctaatat ttatctcaat 480

aagagaaaac gtaagtctgc tgctgctagt attgaggaat cgttcagcaa gcaacccgtt 540

gccgccgggg attatggcga ccaaacggat tatcctcgta cccgccaaga gtatttaagc 600

cagcaagaac cggaagataa tcgggtcaaa atctggccaa ttatcgaaga aagtttacaa 660

ggccctgccc tatcagccat gttgttaggt cttgccctgg gcatatttac caagccggaa 720

agtgtctatg aaggttttta tgatcctctt tttcgaggac tactttccat cttgatgctg 780

attatgggca tggaagcttg gtccagaatt ggtgaactac gtaaagtagc tcaatggtat 840

gtggtctata gcctaatagc tcccatagtg cacgggttta ttgcctttgg tcttggtatg 900

attgcccact atgctacggg tttcagtctg ggtggtgtgg tagttttagc agttatcgcc 960

gcttctagct ctgatatctc cgggcctcct accttgcgag caggtatccc atctgccaac 1020

ccctctgcct atatcggttc atccaccgcc atcggtactc ccattgccat cggcgtgtgc 1080

ataccgcttt tcattgggct tgcccagacc cttggtgcag gttaa 1125

<210> 4

<211> 564

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> BicA

<400> 4

Met Gln Ile Thr Asn Lys Ile His Phe Arg Asn Leu Gln Gly Asp Leu

1 5 10 15

Phe Gly Gly Val Thr Ala Ala Val Ile Ala Leu Pro Met Ala Leu Ala

20 25 30

Phe Gly Ile Ala Ser Gly Ala Gly Ala Thr Ala Gly Leu Trp Gly Ala

35 40 45

Val Ile Val Gly Phe Phe Ala Ala Leu Phe Gly Gly Thr Pro Thr Leu

50 55 60

Ile Ser Glu Pro Thr Gly Pro Met Thr Val Val Gln Thr Ala Val Ile

65 70 75 80

Ala Ser Leu Val Ala Ala Asp Pro Asp Asn Gly Leu Ala Met Ala Phe

85 90 95

Thr Val Val Met Met Ala Gly Leu Phe Gln Ile Ala Phe Gly Leu Leu

100 105 110

Lys Leu Gly Lys Tyr Val Thr Met Met Pro Tyr Thr Val Ile Ser Gly

115 120 125

Phe Met Ser Gly Ile Gly Ile Ile Leu Val Ile Leu Gln Leu Ala Pro

130 135 140

Phe Leu Gly Gln Ala Ser Pro Lys Gly Gly Val Ile Gly Thr Leu Gln

145 150 155 160

Ala Leu Pro Asn Leu Val Ser Asn Val Arg Pro Val Glu Thr Leu Leu

165 170 175

Ala Leu Met Thr Val Gly Ile Ile Trp Phe Met Pro Ser Arg Trp Lys

180 185 190

Lys Phe Ala Pro Pro Gln Leu Val Ala Leu Val Leu Gly Thr Ile Ile

195 200 205

Ser Ile Thr Leu Phe Gly Asp Leu Asp Ile Arg Arg Ile Gly Glu Ile

210 215 220

Gln Ala Gly Leu Pro Ala Leu Gln Leu Pro Val Phe Gln Ala Asp Gln

225 230 235 240

Leu Gln Arg Met Leu Ile Asp Ala Ala Val Leu Gly Met Leu Gly Cys

245 250 255

Ile Asp Ala Leu Leu Thr Ser Val Val Ala Asp Ser Leu Thr Arg Thr

260 265 270

Glu His Asn Ser Asn Lys Glu Leu Val Gly Gln Gly Ile Gly Asn Val

275 280 285

Met Ser Gly Leu Phe Gly Gly Leu Gly Gly Ala Gly Ala Thr Met Gly

290 295 300

Thr Val Val Asn Ile Gln Ser Gly Gly Arg Thr Ala Leu Ser Gly Leu

305 310 315 320

Ile Arg Ala Met Val Leu Leu Val Val Ile Leu Gly Ala Ala Lys Leu

325 330 335

Ala Ala Thr Ile Pro Leu Ala Val Leu Ala Gly Ile Ala Phe Lys Val

340 345 350

Gly Val Asp Ile Ile Asp Trp Gly Phe Leu Lys Arg Ala His His Val

355 360 365

Ser Ile Lys Gly Ala Leu Ile Met Tyr Ala Val Ile Val Leu Thr Val

370 375 380

Leu Val Asp Leu Ile Ala Ala Val Gly Ile Gly Val Phe Ile Ala Asn

385 390 395 400

Ile Leu Thr Ile Asp Arg Met Ser Ala Leu Gln Ser Lys Ala Val Lys

405 410 415

Ser Ile Ser Asp Ala Asp Asp Glu Ile Leu Leu Ser Ala Asn Glu Lys

420 425 430

Arg Trp Leu Asp Glu Gly Asn Gly Arg Val Leu Leu Phe Gln Leu Ser

435 440 445

Gly Pro Met Ile Phe Gly Val Ala Lys Ala Ile Ala Arg Glu His Asn

450 455 460

Ala Ile Gln Glu Cys Ala Ala Ile Val Phe Asp Leu Ser Asp Val Pro

465 470 475 480

His Leu Gly Val Thr Ala Ser Leu Ala Leu Glu Asn Ala Ile Glu Glu

485 490 495

Ala Ala Glu Lys Gly Arg Ala Val Tyr Ile Val Gly Ala Thr Gly Gln

500 505 510

Thr Lys Arg Arg Leu Glu Lys Leu Gln Val Phe Arg Phe Val Pro Glu

515 520 525

Ser Asn Cys Tyr Asp Asp Arg Ser Glu Ala Leu Lys Asp Ala Val Leu

530 535 540

Ala Leu Gly Pro His Glu Ser Glu Asp Ser Pro Ser Ser Ser Ser Val

545 550 555 560

Gln Thr Thr Tyr

<210> 5

<211> 1695

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Оптимизированный по кодонам bicA

<400> 5

atgcagatta cgaacaagat tcactttcgt aatttgcagg gtgatctttt tggcggcgtt 60

acggccgctg ttattgcatt gcctatggct ttggcttttg gaattgcatc gggtgcgggt 120

gccacggccg gactctgggg agccgtaatt gtgggcttct tcgccgcact gttcggagga 180

acccctacgc ttatttcaga gccaaccgga cccatgaccg ttgtgcagac cgccgtgatc 240

gcttctcttg tagctgcgga tcccgataac ggccttgcta tggcattcac ggtggtgatg 300

atggccggtt tgtttcagat tgccttcggt ctgctcaaac ttggaaaata tgtgaccatg 360

atgccatata cggtaatctc tggctttatg tccggcattg gtattatttt ggtaattctg 420

caacttgcgc ccttccttgg acaagcttct ccgaaaggag gcgtgatcgg aacgctgcaa 480

gcacttccca acctcgtgtc gaatgtacgg cccgtagaaa cgttgctggc attgatgacc 540

gtcggtatta tctggttcat gccttctcgt tggaagaaat tcgcgcctcc gcaactcgta 600

gccctggtac tcggcacgat tatttctatc acccttttcg gagatcttga cattcgccgg 660

atcggagaaa tccaagcggg cttgccagcc cttcaactcc cggttttcca agccgatcag 720

ttgcagcgga tgctgatcga tgcagcagtc ctcggaatgc ttggatgtat tgacgccctc 780

cttacgtcgg tagttgccga ttctctgacc cgcaccgagc ataactcgaa taaagaactc 840

gttggccaag gtatcggaaa cgtaatgtca ggcttgttcg gtggtctggg cggcgccggc 900

gcaacgatgg gcactgtggt gaacatccaa tccggaggcc gcacggccct gtctggtttg 960

attcgcgcta tggttctgct ggtggtcatc ttgggagctg caaagctggc agccaccatt 1020

ccgcttgctg tgcttgctgg aattgcgttt aaggtaggtg tagacattat cgactggggc 1080

tttctgaagc gcgcacacca tgtgtcaatt aagggcgcac ttatcatgta tgctgttatc 1140

gtcctcactg tcctggtaga tctcatcgcc gcggttggta ttggagtctt tatcgcgaac 1200

attcttacca tcgaccggat gtcggccttg caatcaaaag cggtgaaatc aatttctgat 1260

gcagatgacg aaattctttt gtctgccaat gaaaaacgtt ggttggacga aggcaatggt 1320

cgcgtcttgc tctttcagtt gagcggacct atgatctttg gagtggcaaa agcgatcgca 1380

cgggaacaca atgcgatcca ggaatgtgct gccatcgtat ttgacttgag cgacgttccc 1440

catctcggtg tcaccgcatc attggctctt gagaacgcaa ttgaagaggc agcagagaag 1500

ggacgtgccg tttatatcgt gggcgccacc ggacagacca agcgccgttt ggagaaactt 1560

caagtctttc gcttcgtccc agaaagcaac tgttacgacg accgctctga ggcgcttaaa 1620

gacgccgtgc tcgcgttggg accccatgag tcggaagatt cgccgagcag ctcttccgtg 1680

cagaccactt attga 1695

<210> 6

<211> 1695

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> bicA

<400> 6

atgcaaataa ctaacaaaat tcattttagg aacctgcagg gggacctttt tggcggggtt 60

acagcggcgg ttattgccct gcccatggcc ttagccttcg ggattgcttc cggagcaggg 120

gctacggccg gactctgggg ggcggtgatc gtagggtttt tcgcggcctt atttggcggc 180

acccccacct taatttccga accgactggg cccatgacgg tggtgcaaac ggcggttatt 240

gctagtttag tggcggcaga tcccgacaat ggcttggcca tggccttcac tgtggtaatg 300

atggcggggt tgttccagat tgcctttggt ctgctcaaat tgggcaaata tgtcaccatg 360

atgccctaca cagtcatttc cggctttatg tccggcattg ggattatttt ggtgattttg 420

caactggctc cctttcttgg ccaagctagt cccaagggag gggtaatcgg caccctccag 480

gccctcccta acctagtaag caatgtcagg ccggtggaaa ccctattggc gctcatgacg 540

gtgggcatta tttggtttat gccttcccgt tggaaaaagt ttgctccgcc ccaattggtg 600

gctttagtgt tggggacaat tatttccatc accctatttg gcgatctgga tatccgtcgc 660

attggggaaa ttcaggccgg tttgcccgct ctacagctac cagtgtttca ggctgatcaa 720

ttacagagaa tgctgattga tgcggctgtt ctgggaatgc tgggctgtat tgatgccctc 780

ctgacttcgg tggtggctga tagcttgacc cgcacagaac ataactccaa caaggaatta 840

gtcggccagg gcatcggcaa tgtaatgtcc ggtttatttg gtggcttggg gggagctggg 900

gccaccatgg ggacggtggt aaatatccag tccgggggac gcacagctct gtctggcttg 960

atccgggcga tggtgttgct ggtggtaatt ttaggcgcag ctaaattggc ggctaccatt 1020

cccctagccg tattggctgg tattgcgttc aaagttgggg tggacattat tgattggggg 1080

ttcctcaagc gggctcacca tgtctccatc aaaggggcct tgattatgta tgccgtcatt 1140

gtcctgacgg tgttggtgga tttaattgcg gcagtaggta ttggtgtatt tattgccaat 1200

attctcacca ttgaccgtat gagtgcgttg cagtccaaag ctgtgaaaag tattagcgat 1260

gccgacgacg aaattctcct ttccgccaat gagaaacgtt ggctagatga gggcaatggc 1320

cgggtcttgc ttttccaact cagtggccca atgatttttg gggtggccaa ggcgatcgcc 1380

agggaacata atgccattca agaatgtgcc gccattgttt ttgatctgag cgatgtgccc 1440

catttgggag taaccgcttc cctggccctg gaaaatgcca ttgaagaagc ggcggaaaaa 1500

ggtcgggccg tttacattgt gggggcaaca gggcaaacca agcgacgctt ggaaaaattg 1560

caagtgttcc gctttgttcc tgaaagtaat tgctatgacg accgttctga agctctcaag 1620

gacgctgtcc tagctttggg acctcatgaa agtgaggact ccccttccag ttcttccgtc 1680

cagaccacat actga 1695

<210> 7

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0286_up_F

<400> 7

aacgacggcc agtgaattcc ggacgtttac gctgat 36

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0286_up_R

<400> 8

agtactaaac cggaagggcc tgtaaaggcc 30

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0286_down_F

<400> 9

ccttccggtt tagtactaaa caggaagagc cccttta 37

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0286_down_R

<400> 10

tgcatgcctg caggtcgacc gcatgtggtg gcaaaa 36

<210> 11

<211> 1477

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-sbtA

<400> 11

ggcccttccg gtttagtaga aacatcccag cgctactaat agggagcgtt gaccttcctt 60

ccacggaccg gtaatcggag tgcctaaaac cgcatgcggc ttaggctcca agataggttc 120

tgcgcggccg ggtaatgcat cttctttagc aacaagttga ggggtaggtg caaataagaa 180

cgacatagaa atcgtctcct ttctgttttt aatcaacata caccaccacc taaaaattcc 240

ccgaccagca agttcacagt attcgggcac aatatcgttg ccaaaatatt gtttcggaat 300

atcatgggat acgtacccaa cgaaaggaaa cactcatgga ttttctttct aatttcttga 360

ccgacttcgt gggtcaactg cagtcaccca ctctggcgtt tctgatcggc ggtatggtaa 420

tcgccgctct gggaactcaa ttggttattc ccgaagccat ctcaacgatt atcgttttca 480

tgttgcttac taaaattgga cttaccggag gtatggcgat tcggaatagc aacctgaccg 540

agatgctttt gcccgtggcc ttctccgtca ttttgggaat tttgatcgta tttatcgcgc 600

gtttcacttt ggctaagctc cccaatgtgc gcactgtgga cgcccttgct acgggtggtc 660

tcttcggtgc ggtgtcagga agcacgatgg ccgccgccct gactacgctt gaggaatcaa 720

aaatttcata tgaagcatgg gcaggagctt tgtacccttt tatggatatt ccggccttgg 780

tcacggcaat tgttgttgcc aacatctatt tgaataaacg gaaacgtaaa agcgccgcag 840

catcaatcga agagagcttc tcgaagcagc ccgtagcggc tggcgactat ggagatcaga 900

ctgattatcc acgtacccgt caggaatacc tctctcagca agagccggag gacaatcgcg 960

tcaaaatttg gccaatcatt gaagagtcgc ttcaaggccc agccctttca gctatgttgt 1020

tgggacttgc actgggtatt ttcacgaaac ctgaatcggt gtatgaggga ttctacgatc 1080

ctctttttcg cggactcctg tcgattctga tgctgattat gggcatggaa gcctggagcc 1140

gtatcggcga gcttcgtaag gtagctcagt ggtatgtcgt ttactctttg atcgctccga 1200

tcgtacacgg atttatcgct tttggactgg gtatgatcgc ccattacgct acgggattca 1260

gcctcggtgg agtggtcgtt ctggccgtaa ttgccgcatc ttcttctgat atctctggcc 1320

cacctaccct gcgtgccggc attccgagcg caaatccgtc ggcatatatc ggtagctcta 1380

ctgcaatcgg aacccccatc gcaatcggtg tgtgtattcc tctcttcatc ggtctcgccc 1440

agacgcttgg cgcgggctaa actaaacagg aagagcc 1477

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-sbtA_F

<400> 12

ggcccttccg gtttagt 17

<210> 13

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-sbtA_R

<400> 13

ggctcttcct gtttagt 17

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0085_up_F

<400> 14

aacgacggcc agtgaattcg ctcgaatgcc tgactgaca 39

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0085_up_R

<400> 15

gtttagtact aaaccggaag ggccaaagga cgacttcacg gtta 44

<210> 16

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0085_down_F

<400> 16

ccggtttagt actaaacagg aagagccatt gaggatgcga aactgt 46

<210> 17

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CglE0085_down_R

<400> 17

tgcatgcctg caggtcgacg taatcgaatc accggccag 39

<210> 18

<211> 2047

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-bicA

<400> 18

ggcccttccg gtttagtaga aacatcccag cgctactaat agggagcgtt gaccttcctt 60

ccacggaccg gtaatcggag tgcctaaaac cgcatgcggc ttaggctcca agataggttc 120

tgcgcggccg ggtaatgcat cttctttagc aacaagttga ggggtaggtg caaataagaa 180

cgacatagaa atcgtctcct ttctgttttt aatcaacata caccaccacc taaaaattcc 240

ccgaccagca agttcacagt attcgggcac aatatcgttg ccaaaatatt gtttcggaat 300

atcatgggat acgtacccaa cgaaaggaaa cactcatgca gattacgaac aagattcact 360

ttcgtaattt gcagggtgat ctttttggcg gcgttacggc cgctgttatt gcattgccta 420

tggctttggc ttttggaatt gcatcgggtg cgggtgccac ggccggactc tggggagccg 480

taattgtggg cttcttcgcc gcactgttcg gaggaacccc tacgcttatt tcagagccaa 540

ccggacccat gaccgttgtg cagaccgccg tgatcgcttc tcttgtagct gcggatcccg 600

ataacggcct tgctatggca ttcacggtgg tgatgatggc cggtttgttt cagattgcct 660

tcggtctgct caaacttgga aaatatgtga ccatgatgcc atatacggta atctctggct 720

ttatgtccgg cattggtatt attttggtaa ttctgcaact tgcgcccttc cttggacaag 780

cttctccgaa aggaggcgtg atcggaacgc tgcaagcact tcccaacctc gtgtcgaatg 840

tacggcccgt agaaacgttg ctggcattga tgaccgtcgg tattatctgg ttcatgcctt 900

ctcgttggaa gaaattcgcg cctccgcaac tcgtagccct ggtactcggc acgattattt 960

ctatcaccct tttcggagat cttgacattc gccggatcgg agaaatccaa gcgggcttgc 1020

cagcccttca actcccggtt ttccaagccg atcagttgca gcggatgctg atcgatgcag 1080

cagtcctcgg aatgcttgga tgtattgacg ccctccttac gtcggtagtt gccgattctc 1140

tgacccgcac cgagcataac tcgaataaag aactcgttgg ccaaggtatc ggaaacgtaa 1200

tgtcaggctt gttcggtggt ctgggcggcg ccggcgcaac gatgggcact gtggtgaaca 1260

tccaatccgg aggccgcacg gccctgtctg gtttgattcg cgctatggtt ctgctggtgg 1320

tcatcttggg agctgcaaag ctggcagcca ccattccgct tgctgtgctt gctggaattg 1380

cgtttaaggt aggtgtagac attatcgact ggggctttct gaagcgcgca caccatgtgt 1440

caattaaggg cgcacttatc atgtatgctg ttatcgtcct cactgtcctg gtagatctca 1500

tcgccgcggt tggtattgga gtctttatcg cgaacattct taccatcgac cggatgtcgg 1560

ccttgcaatc aaaagcggtg aaatcaattt ctgatgcaga tgacgaaatt cttttgtctg 1620

ccaatgaaaa acgttggttg gacgaaggca atggtcgcgt cttgctcttt cagttgagcg 1680

gacctatgat ctttggagtg gcaaaagcga tcgcacggga acacaatgcg atccaggaat 1740

gtgctgccat cgtatttgac ttgagcgacg ttccccatct cggtgtcacc gcatcattgg 1800

ctcttgagaa cgcaattgaa gaggcagcag agaagggacg tgccgtttat atcgtgggcg 1860

ccaccggaca gaccaagcgc cgtttggaga aacttcaagt ctttcgcttc gtcccagaaa 1920

gcaactgtta cgacgaccgc tctgaggcgc ttaaagacgc cgtgctcgcg ttgggacccc 1980

atgagtcgga agattcgccg agcagctctt ccgtgcagac cacttattga actaaacagg 2040

aagagcc 2047

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> odhA_up_F

<400> 19

tgaattcgag ctcggtaccc ttgaacggaa ttgggtgg 38

<210> 20

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> odhA_up_R

<400> 20

cccaggtggc atcggtacct tcacccagcg ccacgcag 38

<210> 21

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> odhA_down_F

<400> 21

cgctgggtga aggtaccgat gccacctggg ttggtcaag 39

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> odhA_down_R

<400> 22

gtcgactcta gaggatcccc ggacaaggaa tggagaga 38

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> odhA_del_F

<400> 23

cttaccgttg ttgccctt 18

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> odhA_del_R

<400> 24

ctccttcacc cacatcatt 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-sbtA_confirm_F

<400> 25

caagcagcaa gtgccacac 19

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-sbtA_confirm_R

<400> 26

ccaactgctc cgacgaag 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-bicA_confirm_F

<400> 27

attcccaaag gtgccagc 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CJ7-bicA_confirm_R

<400> 28

cagtgcgcaa aaggcctc 18

<210> 29

<211> 1221

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> OdhA

<400> 29

Met Ser Ser Ala Ser Thr Phe Gly Gln Asn Ala Trp Leu Val Asp Glu

1 5 10 15

Met Phe Gln Gln Phe Gln Lys Asp Pro Lys Ser Val Asp Lys Glu Trp

20 25 30

Arg Glu Leu Phe Glu Ala Gln Gly Gly Pro Asn Ala Thr Pro Ala Thr

35 40 45

Thr Glu Ala Gln Pro Ser Ala Pro Lys Glu Ser Ala Lys Pro Ala Pro

50 55 60

Lys Ala Ala Pro Ala Ala Lys Ala Ala Pro Arg Val Glu Thr Lys Pro

65 70 75 80

Ala Ala Lys Thr Ala Pro Lys Ala Lys Glu Ser Ser Val Pro Gln Gln

85 90 95

Pro Lys Leu Pro Glu Pro Gly Gln Thr Pro Ile Arg Gly Ile Phe Lys

100 105 110

Ser Ile Ala Lys Asn Met Asp Ile Ser Leu Glu Ile Pro Thr Ala Thr

115 120 125

Ser Val Arg Asp Met Pro Ala Arg Leu Met Phe Glu Asn Arg Ala Met

130 135 140

Val Asn Asp Gln Leu Lys Arg Thr Arg Gly Gly Lys Ile Ser Phe Thr

145 150 155 160

His Ile Ile Gly Tyr Ala Met Val Lys Ala Val Met Ala His Pro Asp

165 170 175

Met Asn Asn Ser Tyr Asp Val Ile Asp Gly Lys Pro Thr Leu Ile Val

180 185 190

Pro Glu His Ile Asn Leu Gly Leu Ala Ile Asp Leu Pro Gln Lys Asp

195 200 205

Gly Ser Arg Ala Leu Val Val Ala Ala Ile Lys Glu Thr Glu Lys Met

210 215 220

Asn Phe Ser Glu Phe Leu Ala Ala Tyr Glu Asp Ile Val Thr Arg Ser

225 230 235 240

Arg Lys Gly Lys Leu Thr Met Asp Asp Tyr Gln Gly Val Thr Val Ser

245 250 255

Leu Thr Asn Pro Gly Gly Ile Gly Thr Arg His Ser Val Pro Arg Leu

260 265 270

Thr Lys Gly Gln Gly Thr Ile Ile Gly Val Gly Ser Met Asp Tyr Pro

275 280 285

Ala Glu Phe Gln Gly Ala Ser Glu Asp Arg Leu Ala Glu Leu Gly Val

290 295 300

Gly Lys Leu Val Thr Ile Thr Ser Thr Tyr Asp His Arg Val Ile Gln

305 310 315 320

Gly Ala Val Ser Gly Glu Phe Leu Arg Thr Met Ser Arg Leu Leu Thr

325 330 335

Asp Asp Ser Phe Trp Asp Glu Ile Phe Asp Ala Met Asn Val Pro Tyr

340 345 350

Thr Pro Met Arg Trp Ala Gln Asp Val Pro Asn Thr Gly Val Asp Lys

355 360 365

Asn Thr Arg Val Met Gln Leu Ile Glu Ala Tyr Arg Ser Arg Gly His

370 375 380

Leu Ile Ala Asp Thr Asn Pro Leu Ser Trp Val Gln Pro Gly Met Pro

385 390 395 400

Val Pro Asp His Arg Asp Leu Asp Ile Glu Thr His Ser Leu Thr Ile

405 410 415

Trp Asp Leu Asp Arg Thr Phe Ser Val Gly Gly Phe Gly Gly Lys Glu

420 425 430

Thr Met Thr Leu Arg Glu Val Leu Ser Arg Leu Arg Ala Ala Tyr Thr

435 440 445

Leu Lys Val Gly Ser Glu Tyr Thr His Ile Leu Asp Arg Asp Glu Arg

450 455 460

Thr Trp Leu Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gly Met Pro Lys Pro Thr Gln

465 470 475 480

Ala Glu Gln Lys Tyr Ile Leu Gln Lys Leu Asn Ala Ala Glu Ala Phe

485 490 495

Glu Asn Phe Leu Gln Thr Lys Tyr Val Gly Gln Lys Arg Phe Ser Leu

500 505 510

Glu Gly Ala Glu Ala Leu Ile Pro Leu Met Asp Ser Ala Ile Asp Thr

515 520 525

Ala Ala Gly Gln Gly Leu Asp Glu Val Val Ile Gly Met Pro His Arg

530 535 540

Gly Arg Leu Asn Val Leu Phe Asn Ile Val Gly Lys Pro Leu Ala Ser

545 550 555 560

Ile Phe Asn Glu Phe Glu Gly Gln Met Glu Gln Gly Gln Ile Gly Gly

565 570 575

Ser Gly Asp Val Lys Tyr His Leu Gly Ser Glu Gly Gln His Leu Gln

580 585 590

Met Phe Gly Asp Gly Glu Ile Lys Val Ser Leu Thr Ala Asn Pro Ser

595 600 605

His Leu Glu Ala Val Asn Pro Val Met Glu Gly Ile Val Arg Ala Lys

610 615 620

Gln Asp Tyr Leu Asp Lys Gly Val Asp Gly Lys Thr Val Val Pro Leu

625 630 635 640

Leu Leu His Gly Asp Ala Ala Phe Ala Gly Leu Gly Ile Val Pro Glu

645 650 655

Thr Ile Asn Leu Ala Lys Leu Arg Gly Tyr Asp Val Gly Gly Thr Ile

660 665 670

His Ile Val Val Asn Asn Gln Ile Gly Phe Thr Thr Thr Pro Asp Ser

675 680 685

Ser Arg Ser Met His Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Lys Ala Phe Gly Cys

690 695 700

Pro Val Phe His Val Asn Gly Asp Asp Pro Glu Ala Val Val Trp Val

705 710 715 720

Gly Gln Leu Ala Thr Glu Tyr Arg Arg Arg Phe Gly Lys Asp Val Phe

725 730 735

Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Leu Arg Gly His Asn Glu Ala Asp Asp

740 745 750

Pro Ser Met Thr Gln Pro Lys Met Tyr Glu Leu Ile Thr Gly Arg Glu

755 760 765

Thr Val Arg Ala Gln Tyr Thr Glu Asp Leu Leu Gly Arg Gly Asp Leu

770 775 780

Ser Asn Glu Asp Ala Glu Ala Val Val Arg Asp Phe His Asp Gln Met

785 790 795 800

Glu Ser Val Phe Asn Glu Val Lys Glu Gly Gly Lys Lys Gln Ala Glu

805 810 815

Ala Gln Thr Gly Ile Thr Gly Ser Gln Lys Leu Pro His Gly Leu Glu

820 825 830

Thr Asn Ile Ser Arg Glu Glu Leu Leu Glu Leu Gly Gln Ala Phe Ala

835 840 845

Asn Thr Pro Glu Gly Phe Asn Tyr His Pro Arg Val Ala Pro Val Ala

850 855 860

Lys Lys Arg Val Ser Ser Val Thr Glu Gly Gly Ile Asp Trp Ala Trp

865 870 875 880

Gly Glu Leu Leu Ala Phe Gly Ser Leu Ala Asn Ser Gly Arg Leu Val

885 890 895

Arg Leu Ala Gly Glu Asp Ser Arg Arg Gly Thr Phe Thr Gln Arg His

900 905 910

Ala Val Ala Ile Asp Pro Ala Thr Ala Glu Glu Phe Asn Pro Leu His

915 920 925

Glu Leu Ala Gln Ser Lys Gly Asn Asn Gly Lys Phe Leu Val Tyr Asn

930 935 940

Ser Ala Leu Thr Glu Tyr Ala Gly Met Gly Phe Glu Tyr Gly Tyr Ser

945 950 955 960

Val Gly Asn Glu Asp Ser Val Val Ala Trp Glu Ala Gln Phe Gly Asp

965 970 975

Phe Ala Asn Gly Ala Gln Thr Ile Ile Asp Glu Tyr Val Ser Ser Gly

980 985 990

Glu Ala Lys Trp Gly Gln Thr Ser Lys Leu Ile Leu Leu Leu Pro His

995 1000 1005

Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Asp His Ser Ser Ala Arg Ile Glu Arg

1010 1015 1020

Phe Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gly Ser Met Thr Val Ala Gln Pro Ser

1025 1030 1035 1040

Thr Pro Ala Asn His Phe His Leu Leu Arg Arg His Ala Leu Ser Asp

1045 1050 1055

Leu Lys Arg Pro Leu Val Ile Phe Thr Pro Lys Ser Met Leu Arg Asn

1060 1065 1070

Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Glu Asp Phe Thr Glu Val Thr Lys Phe

1075 1080 1085

Gln Ser Val Ile Asp Asp Pro Asn Val Ala Asp Ala Ala Lys Val Lys

1090 1095 1100

Lys Val Met Leu Val Ser Gly Lys Leu Tyr Tyr Glu Leu Ala Lys Arg

1105 1110 1115 1120

Lys Glu Lys Asp Gly Arg Asp Asp Ile Ala Ile Val Arg Ile Glu Met

1125 1130 1135

Leu His Pro Ile Pro Phe Asn Arg Ile Ser Glu Ala Leu Ala Gly Tyr

1140 1145 1150

Pro Asn Ala Glu Glu Val Leu Phe Val Gln Asp Glu Pro Ala Asn Gln

1155 1160 1165

Gly Pro Trp Pro Phe Tyr Gln Glu His Leu Pro Glu Leu Ile Pro Asn

1170 1175 1180

Met Pro Lys Met Arg Arg Val Ser Arg Arg Ala Gln Ser Ser Thr Ala

1185 1190 1195 1200

Thr Gly Val Ala Lys Val His Gln Leu Glu Glu Lys Gln Leu Ile Asp

1205 1210 1215

Glu Ala Phe Glu Ala

1220

<210> 30

<211> 373

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> SbtA

<400> 30

Met Asp Phe Leu Ser His Phe Leu Thr Asp Phe Val Gly Gln Leu Gln

1 5 10 15

Ser Pro Thr Leu Ala Phe Leu Ile Gly Gly Met Val Ile Ala Ala Leu

20 25 30

Gly Thr Gln Leu Val Ile Pro Glu Ala Ile Ser Thr Ile Ile Val Phe

35 40 45

Met Leu Leu Thr Lys Ile Gly Leu Thr Gly Gly Met Ala Ile Arg Asn

50 55 60

Ser Asn Leu Thr Glu Met Leu Leu Pro Met Ile Phe Ser Val Ile Leu

65 70 75 80

Gly Ile Leu Ile Val Phe Ile Ala Arg Phe Thr Leu Ala Lys Leu Pro

85 90 95

Asn Val Lys Thr Val Asp Ala Leu Ala Thr Gly Gly Leu Phe Gly Ala

100 105 110

Val Ser Gly Ser Thr Met Ala Ala Ala Leu Thr Thr Leu Glu Glu Ser

115 120 125

Lys Ile Ser Tyr Glu Ala Trp Ala Gly Ala Leu Tyr Pro Phe Met Asp

130 135 140

Ile Pro Ala Leu Val Thr Ala Ile Val Val Ala Asn Ile Tyr Leu Asn

145 150 155 160

Lys Lys Lys Arg Arg Ala Ala Ala Ala Ile Glu Gly Ser Leu Ser Lys

165 170 175

Gln Pro Val Ala Ala Gly Asp Tyr Gly Asp Gln Gln Asp Tyr Pro Arg

180 185 190

Thr Arg Gln Glu Tyr Leu Ser Gln Gln Glu Pro Glu Asp Asn Arg Val

195 200 205

Lys Ile Trp Pro Ile Ile Glu Glu Ser Leu Gln Gly Pro Ala Leu Ser

210 215 220

Ala Met Leu Leu Gly Leu Ala Leu Gly Ile Phe Thr Lys Pro Glu Ser

225 230 235 240

Val Tyr Glu Gly Phe Tyr Asp Pro Leu Phe Arg Gly Leu Leu Ser Ile

245 250 255

Leu Met Leu Ile Met Gly Met Glu Ala Trp Ser Arg Ile Gly Glu Leu

260 265 270

Arg Lys Val Ala Gln Trp Tyr Val Val Tyr Ser Leu Val Ala Pro Ile

275 280 285

Val His Gly Phe Ile Ala Phe Gly Leu Gly Met Ile Ala His Tyr Thr

290 295 300

Thr Gly Phe Ser Leu Gly Gly Val Val Val Leu Ala Val Ile Ala Ala

305 310 315 320

Ser Ser Ser Asp Ile Ser Gly Pro Pro Thr Leu Arg Ala Gly Ile Pro

325 330 335

Ser Ala Asn Pro Ser Ala Tyr Ile Gly Ala Ser Thr Ala Ile Gly Thr

340 345 350

Pro Ile Ala Ile Gly Val Cys Ile Pro Leu Phe Ile Gly Leu Ala Gln

355 360 365

Thr Leu Gly Ala Gly

370

<210> 31

<211> 1119

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> SbtA

<400> 31

atggattttt tatcccactt tttaacggat tttgttggac agttgcagtc cccaacccta 60

gcctttttga ttggggggat ggttattgcc gcccttggta cccaattggt aattccagag 120

gcgatttcta cgatcatcgt ctttatgttg ctcactaaga ttggcctgac cgggggcatg 180

gcaattcgca actccaactt aacggaaatg ctcctgccga tgatattctc cgtaatattg 240

ggaattctaa ttgtattcat cgcccgtttt accctggcta aacttcccaa tgttaaaacc 300

gtggatgccc ttgccactgg tggcttgttt ggggcagtta gtggttctac gatggccgcc 360

gccctaacta cgttggaaga atcaaaaatt tcctacgaag cttgggctgg tgccctctat 420

ccttttatgg atattcctgc cctagtaacg gcgatcgtag tggccaatat ttatctcaat 480

aagaagaagc gtcgtgccgc ggccgccatt gagggatctt taagcaagca acccgttgcc 540

gcaggggatt atggcgatca gcaggattat cctcgtaccc gccaggagta tttgagccag 600

caggaaccgg aggataatcg ggtcaagatc tggccgatca tcgaagaaag tttacaaggt 660

cccgccctgt cagccatgtt attaggtctt gcccttggca tatttaccaa gccggaaagt 720

gtctatgaag gtttctatga tcctcttttt cgaggcctac tttctatctt gatgctcatt 780

atggggatgg aggcttggtc cagaattggc gaactacgta aagtagctca atggtatgtg 840

gtctatagcc tggtagctcc gatagtgcac gggtttattg cctttggtct tggtatgatt 900

gcccactaca ctacgggatt cagcctgggc ggtgtcgtag ttttagcagt catcgccgct 960

tctagttctg atatctccgg cccccccacc ttgcgagccg gtatcccgtc ggccaatccc 1020

tctgcttata ttggtgcatc caccgctatc ggtactccca ttgccatcgg cgtgtgcata 1080

ccgcttttca ttgggcttgc ccagaccctt ggtgcaggt 1119

<210> 32

<211> 5803

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pDCM2

<400> 32

gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg ccatgtaagc ccactgcaag 60

ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca gatagcccag tagctgacat 120

tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta cgtgttccgc ttcctttagc 180

agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgaagctag cttttatcgc cattcgccat 240

tcaggctgcg caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc 300

tggcgaaagg gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt 360

cacgacgttg taaaacgacg gccagtgaat tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag 420

tcgacctgca ggcatgcaag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 480

tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 540

ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 600

tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 660

ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 720

ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 780

gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 840

gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 900

cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 960

ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 1020

tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct caatgctcac gctgtaggta tctcagttcg 1080

gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 1140

tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 1200

ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 1260

ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 1320

ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 1380

accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 1440

tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 1500

cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttgggg 1560

tgggcgaaga actccagcat gagatccccg cgctggagga tcatccagcc ctgatagaaa 1620

cagaagccac tggagcacct caaaaacacc atcatacact aaatcagtaa gttggcagca 1680

tcacccgacg cactttgcgc cgaataaata cctgtgacgg aagatcactt cgcagaataa 1740

ataaatcctg gtgtccctgt tgataccggg aagccctggg ccaacttttg gcgaaaatga 1800

gacgttgatc ggcacgtaag aggttccaac tttcaccata atgaaataag atcactaccg 1860

ggcgtatttt ttgagttatc gagattttca ggagctgata gaaacagaag ccactggagc 1920

acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc agcatcaccc gacgcacttt 1980

gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga ataaataaat cctggtgtcc 2040

ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa atgagacgtt gatcggcacg 2100

taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact accgggcgta ttttttgagt 2160

tatcgagatt ttcaggagct ctttggcatc gtctctcgcc tgtcccctca gttcagtaat 2220

ttcctgcatt tgcctgtttc cagtcggtag atattccaca aaacagcagg gaagcagcgc 2280

ttttccgctg cataaccctg cttcggggtc attatagcga ttttttcggt atatccatcc 2340

tttttcgcac gatatacagg attttgccaa agggttcgtg tagactttcc ttggtgtatc 2400

caacggcgtc agccgggcag gataggtgaa gtaggcccac ccgcgagcgg gtgttccttc 2460

ttcactgtcc cttattcgca cctggcggtg ctcaacggga atcctgctct gcgaggctgg 2520

ccggctaccg ccggcgtaac agatgagggc aagcggatgg ctgatgaaac caagccaacc 2580

aggaagggca gcccacctat caaggtgtac tgccttccag acgaacgaag agcgattgag 2640

gaaaaggcgg cggcggccgg catgagcctg tcggcctacc tgctggccgt cggccagggc 2700

tacaaaatca cgggcgtcgt ggactatgag cacgtccgcg agggcgtccc ggaaaacgat 2760

tccgaagccc aacctttcat agaaggcggc ggtggaatcg aaatctcgtg atggcaggtt 2820

gggcgtcgct tggtcggtca tttcgaaaaa ggttaggaat acggttagcc atttgcctgc 2880

ttttatatag ttcantatgg gattcacctt tatgttgata agaaataaaa gaaaatgcca 2940

ataggatatc ggcattttct tttgcgtttt tatttgttaa ctgttaattg tccttgttca 3000

aggatgctgt ctttgacaac agatgttttc ttgcctttga tgttcagcag gaagctcggc 3060

gcaaacgttg attgtttgtc tgcgtagaat cctctgtttg tcatatagct tgtaatcacg 3120

acattgtttc ctttcgcttg aggtacagcg aagtgtgagt aagtaaaggt tacatcgtta 3180

ggcggatcaa gatccatttt taacacaagg ccagttttgt tcagcggctt gtatgggcca 3240

gttaaagaat tagaaacata accaagcatg taaatatcgt tagacgtaat gccgtcaatc 3300

gtcatttttg atccgcggga gtcagtgaac aggtaccatt tgccgttcat tttaaagacg 3360

ttcgcgcgtt caatttcatc tgttactgtg ttagatgcaa tcagcggttt catcactttt 3420

ttcagtgtgt aatcatcgtt tagctcaatc ataccgagag cgccgtttgc taactcagcc 3480

gtgcgttttt tatcgctttg cagaagtttt tgactttctt gacggaagaa tgatgtgctt 3540

ttgccatagt atgctttgtt aaataaagat tcttcgcctt ggtagccatc ttcagttcca 3600

gtgtttgctt caaatactaa gtatttgtgg cctttatctt ctacgtagtg aggatctctc 3660

agcgtatggt tgtcgcctga gctgtagttg ccttcatcga tgaactgctg tacattttga 3720

tacgtttttc cgtcaccgtc aaagattgat ttataatcct ctacaccgtt gatgttcaaa 3780

gagctgtctg atgctgatac gttaacttgt gcagttgtca gtgtttgttt gccgtaatgt 3840

ttaccggaga aatcagtgta gaataaacgg atttttccgt cagatgtaaa tgtggctgaa 3900

cctgaccatt cttgtgtttg gtcttttagg atagaatcat ttgcatcgaa tttgtcgctg 3960

tctttaaaga cgcggccagc gtttttccag ctgtcaatag aagtttcgcc gactttttga 4020

tagaacatgt aaatcgatgt gtcatccgca tttttaggat ctccggctaa tgcaaagacg 4080

atgtggtagc cgtgatagtt tgcgacagtg ccgtcagcgt tttgtaatgg ccagctgtcc 4140

caaacgtcca ggccttttgc agaagagata tttttaattg tggacgaatc aaattcagaa 4200

acttgatatt tttcattttt ttgctgttca gggatttgca gcatatcatg gcgtgtaata 4260

tgggaaatgc cgtatgtttc cttatatggc ttttggttcg tttctttcgc aaacgcttga 4320

gttgcgcctc ctgccagcag tgcggtagta aaggttaata ctgttgcttg ttttgcaaac 4380

tttttgatgt tcatcgttca tgtctccttt tttatgtact gtgttagcgg tctgcttctt 4440

ccagccctcc tgtttgaaga tggcaagtta gttacgcaca ataaaaaaag acctaaaata 4500

tgtaaggggt gacgccaaag tatacacttt gccctttaca cattttaggt cttgcctgct 4560

ttatcagtaa caaacccgcg cgatttactt ttcgacctca ttctattaga ctctcgtttg 4620

gattgcaact ggtctatttt cctcttttgt ttgatagaaa atcataaaag gatttgcaga 4680

ctacgggcct aaagaactaa aaaatctatc tgtttctttt cattctctgt attttttata 4740

gtttctgttg catgggcata aagttgcctt tttaatcaca attcagaaaa tatcataata 4800

tctcatttca ctaaataata gtgaacggca ggtatatgtg atgggttaaa aaggatcacc 4860

ccagagtccc gctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc 4920

gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc 4980

agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc 5040

acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc 5100

gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatccgc gccttgagcc tggcgaacag 5160

ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc 5220

ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt 5280

agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc 5340

aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc 5400

ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 5460

cacgatagcc gcgctgcctc gtcttggagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 5520

acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg 5580

attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 5640

gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc atcctgtctc ttgatcagat 5700

cttgatcccc tgcgccatca gatccttggc ggcaagaaag ccatccagtt tactttgcag 5760

ggcttcccaa ccttaccaga gggcgcccca gctggcaatt ccg 5803

<---

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-глутаминовую кислоту и содержащий белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA. Также предложен способ получения L-глутаминовой кислоты, включающий культивирование в среде указанного микроорганизма рода Corynebacterium. Изобретение обеспечивает продуцирование L-глутаминовой кислоты с высоким выходом. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 1 ил., 5 табл., 4 пр.

1. Рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium, продуцирующий L-глутаминовую кислоту, где указанный рекомбинантный микроорганизм содержит белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA.

2. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, где указанный белок SbtA имеет происхождение из цианобактерий.

3. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, где указанный белок SbtA содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

4. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, где указанный рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

5. Рекомбинантный микроорганизм по п. 1, где дополнительно инактивирована активность белка OdhA.

6. Способ получения L-глутаминовой кислоты, включающий культивирование в среде рекомбинантного микроорганизма рода Corynebacterium, продуцирующего L-глутаминовую кислоту, где указанный рекомбинантный микроорганизм содержит белок SbtA или полинуклеотид, кодирующий указанный белок SbtA.

7. Способ по п. 6, где указанный белок SbtA имеет происхождение из цианобактерий.

8. Способ по п. 6, где указанный белок SbtA содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

9. Способ по п. 6, где указанный рекомбинантный микроорганизм рода Corynebacterium представляет собой Corynebacterium glutamicum.

10. Способ по п. 6, дополнительно включающий извлечение L-глутаминовой кислоты из указанных рекомбинантного микроорганизма или среды.

11. Способ по п. 6, где дополнительно инактивирована активность белка OdhA.