Способ количественного определения ДНК бактерии Propionibacterium acnes в крови пациента путем амплификации фрагментов ДНК Propionibacterium acnes со специфическими праймерами Российский патент 2025 года по МПК C12Q1/04 C12Q1/68 

Изобретение относится к области биохимии и медицины, в частности к способам измерения или испытания, использующим микроорганизмы; составы или индикаторную бумагу для них; способам получения подобных составов; контролю за условиями в микробиологических или ферментативных процессах.

Современная наука находит подтверждение тому, что все больше патологий ассоциировано с микроорганизмами. Пока это остается областью научного интереса, мы уже разрабатываем тест-систему, которая перенесет этот концепт в область ин-витро диагностики.

В норме у здорового человека кровь стерильна. Вместе с тем имеется несколько исключений: транзиторная бактериями довольно часто на короткое время возникает после экстракции зуба или других зубных манипуляций, а также хирургические вмешательств на слизистых оболочках, контаминированных микроорганизмами, бронхоскопии или катетеризации уретры. Этот тип транзиторной бактериемии обусловлен в основном комменсалами и всегда купируется спонтанно в результате фагоцитоза бактерий в печени или селезенке. Достаточно большое число локальных инфекций часто сопровождается транзиторной бактериемией: открытые раны, язвы, холециститы, менингиты, пневмонии, пиелонефриты. Бактериемии являются характерной чертой некоторых инфекционных заболеваний, например бруцеллез, лептоспироз, брюшной тиф.

Исследования Koren с соавторами в 2011 году, Rafferty с сотрудниками в 2011 году, а также нашими исследованиями было установлено присутствие в атеросклеротических бляшках Propionibacterium acnes. Так как атеросклеротическая бляшка находится в постоянном контакте с кровью, то часть микроорганизмов составляющих микробное сообщество атеросклеротической бляшки, смывается током крови. Нашими исследованиями было установлено присутствие бактерий Propionibacterium acnes в крови пациентов с атеросклерозом. Наш проект нацелен на установление корреляции между присутствием микроорганизмов как в крови, так и в патологически измененной стенке сосуда, атеросклеротической бляшке.

Известен набор реагентов для выявления и идентификации ДНК возбудителя сибирской язвы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени "ом-скрин-сибирская язва-рв", представляющий собой расфасованную в стрипованные микропробирки лиофильно высушенную реакционную смесь, состоящую из эквимолярной смеси дезоксинуклеозидтрифосфатов, Taq-ДНК-полимеразы, синтетической ДНК внутреннего положительного контроля, трегалозы, видоспецифических праймеров для индикации хромосомного маркера Bacillus anthracis - фрагмента гена ssp SEQ ID NO 1 (5'-agcaaacgcacaatcagaag-3'), SEQ ID NO 2 (5'-acgtctgtttcagttgcaaattctgtacc-3') и флуоресцентного зонда SEQ ID NO 3 ((R6G)-ctggtgctagcattcaaagcacaaatgct-(BH2)); праймеров для индикации участка гена сарА плазмиды рХO2 SEQ ID NO 4 (5'-tttcaccagcacccacatagtca-3'), SEQ ID NO 5 (5'-cagtaaaagaagccggatttaca-3') и флуоресцентного зонда SEQ ID NO 6 ((ROX)-tggcgaataaccatatga(C-LNA)ggattatg-(BHQ2)); праймеров для индикации участка гена lef плазмиды pXOl SEQ ID NO 7 (5'-tttcaccagcacccacatagtca-3'), SEQ ID NO 8 (5'-cagtaaaagaagccggatttaca-3') и флуоресцентного зонда SEQ ID NO 9 ((FAM)-cgggcggtcatggtgatgtaggtatg-(RTQ1)); праймеров SEQ ID NO 10 (5'-agaactcgtagcgctagctgtag-3'), SEQ ID NO 11 (5'-cgtagaactagctgtagcgct-3') и флуоресцентного зонда SEQ ID NO 12 ((Cy5)-agcggctcctacttctgcagggg-(BHQ2)) внутреннего положительного контроля, а также в отдельных микропробирках: разбавителя; положительного контрольного образца, представляющего лиофильно высушенную смесь из четырех рекомбинантных плазмид pGem-T, содержащих встроенные специфические последовательности ДНК: фрагмент гена ssp, фрагмент гена lef, кодирующего летальный фактор сибиреязвенного микроба (плазмида pXO1), фрагмент гена капсулообразования сарА (плазмида рХO2), специфический фрагмент контрольной ДНК; отрицательного контрольного образца; внутреннего положительного контроля выделения (см. патент №2542395, МПК C12Q 1/68, опубл. 20.02.2015 г.).

Недостатком данного технического решения является относительная дороговизна синтеза флюоресцентного зонда, который по сути является третьим праймером, и вследствие этого повышенная трудоемкость процедуры смешивания смеси.

Известен набор синтетических олигонуклеотидов для выявления днк возбудителя человеческого моноцитарного эрлихиоза Ehrlichia spp. методом полимеразной цепной реакции "в реальном времени", включающий в себя праймеры: 5'-GGGGAAAGA ТТТАТСGCTATTAG-3', 5'-CGGCATAGCTGGАТСAGGCT-3' и пробу: (BHQ1)-5'-CCCACTGCTGCC(FdT) CCCGTAGGAGTCTGG-3'P, где BHQ1 означает присоединенный к 5'-концевому нуклеотиду темновой гаситель флуоресценции, a FdT - флуоресцентный краситель FAM, присоединенный к нуклеотиду Т (см. патент №2415947, МПК C12Q 1/68, C07H 21/00, опубл. 10.04.2011 г.).

Недостатком данного технического решения является относительная дороговизна синтеза пробы, содержащего темновой гаситель и флюоресцентный краситель, и вследствие этого повышенная трудоемкость процедуры смешивания смеси.

Наиболее близкой к заявляемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ обнаружения нуклеиновых кислот в реальном времени методом полимеразной цепной реакции и устройство для его осуществления, включающий введение жидких проб, содержащих нуклеиновую кислоту, в реакционные зоны на верхней поверхности теплопроводящей подложки микрочипа; изолирование вводимых проб от атмосферы; взаимодействие нуклеиновой кислоты пробы с компонентами полимеразно-цепной реакции при термоциклировании проб с отводом тепла через внешнюю поверхность микрочипа; флуоресцентное определение изменения количества продуктов полимеразно-цепной реакции в процессе термоциклирования; определение количества исходной нуклеиновой кислоты в пробах по динамике роста флуоресцентного сигнала (см. патент на изобретение №2385940, МПК C12P 19/00, C12Q 1/68, опубл. 10.04.2010 г.).

Недостатком данного изобретения является необходимость специального дорогостоящего оборудования для работы с микрочипами.

Техническим результатом заявленного изобретения является создание простого в применении и эффективного способа количественного определения ДНК бактерий Propionibacterium acnes методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, которая позволит исследовать микробную обсемененность атеросклеротических бляшек не бактериологическим методом, а на основе ПЦР, с гибридизационно-флюорересценной детекцией.

Сущностью заявленного технического решения является способ количественного определения ДНК бактерии Propionibacterium acnes методом ПЦР в реальном времени, заключающийся в выделении, очищении тотальной бактериальной ДНК, выполнении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени, где в качестве матрицы для ПЦР используют тотальную бактериальную РНК, включающий праймеры:

P.acnes-Pac-guaA

F:5'-TGCTGCCATTCTTTCTCA-3'

R:5'-TACAGTTTCATCCCGATG-3'

Отрицательный контроль - P.acid - HAMP

F: 5' - TTGAGGTGTCCGATGATG-3'

R: 5' - GGAATGGGAGAAGCAGTT-3',

состав смеси ПЦР:

1. Дезоксинуклеотидтрифосфаты 2,5 мМ;

2. 10-кратный ПЦР Буфер;

3. MgCl₂, 25 мМ;

4. Taq ДНК - полимераза с ингибирующими активность фермента антителами 5 Е/мкл;

5. Вода обработанная DEPC;

6. ЕvaGreen краситель (50x раствор в воде).

В отличие от аналогичных продуктов, представленных на рынке, результаты заявленного способа не зависят от привередливости микроорганизмов. Метод может быть выполнен в течение одного рабочего дня.

Кроме того, при анализе образцов крови метод позволяет проводить раннюю диагностику атеросклероза сосудов в различных возрастных группах населения и избежать хирургического иссечения атеросклеротических бляшек.

Способ позволит контролировать эффективность терапии, позволит найти корреляцию между качественно-количественным составом микробиомы атеросклератических бляшек и результатами лабораторно-инструментальных методов диагностики атеросклеротических изменений в сосудах. Возможность адаптации метода исследования на другие системы органов человека.

Кроме того, преимуществом предлагаемого изобретения является меньшая стоимость необходимых реагентов, оборудования и трудозатрат персонала по сравнению с конкурирующими решениями.

Тем не менее нами были проведены успешные эксперименты по детекции ДНК P.acnes в сыворотках больных (см. фигура 1).

Анализ известных технических решений, проведенный по научно-технической и патентной документации, показал, что совокупность существенных признаков заявляемого изобретения не известна из уровня техники, следовательно, оно соответствует условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень».

Заявляемое изобретение поясняется графическими материалами:

Фигура 1 - График флуоресцентной детекции скорости ампилификации фрагментов ДНК Propionibacterium acnes.

Фигура 2 - Схема амплификации ДНК Propinibacterium acnes.

Фигура 3 - Сравнительные преимущества методов обнаружения нуклеиновых кислот бактерий и вирусов различной этиологии.

Позиции на фигурах обозначают:

Фигура 1: 1 - Флоуресцентный сигнал; 2 - циклы удвоения ДНК.

Фигура 2: 1 - Cutibacterium acnes, 2 - целевой фрагмент ДНК Propinibacterium acnes.

Пара специфично подобранных к ДНК Propionibacterium acnes праймеров используется для амплификации соответствующих праймерам участков ДНК Propionibacterium acnes методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). При взаимодействии с двуцепочечной ДНК специальный флюоресцентный краситель, который добавляется с реакционную смесь, при облучении лазером, который находится на борту ПЦР амплификатора, начинает испускать зеленое свечение, которое в свою очередь измеряется специальным светочувствительным детектором ПЦР амплификатора. По мере амплификации ДНК в процессе полимеразной цепной реакции количество двуцепочечных фрагментов увеличивается и вместе с этим увеличивается свечение красителя, что позволяет проводить детекцию амплификации специфичных фрагментов в режиме реального времени, а при наличии соответствующих контролей позволяет определять количество копий ДНК Propionibacterium acnes в изначальном образце.

Принцип работы основан на флуоресцентной детекции скорости ампилификации фрагментов ДНК Propionibacterium acnes при проведении ПЦР.

Далее заявителем приведен пример осуществления заявленного технического решения.

Способ осуществляется следующим образом: проводится параллельная амплифкация фрагментов из ДНК Propionibacterium acnes в исследуемом образце, в положительных контролях с известной концентрацией копий ДНК Propionibacterium acnes, а также в отрицательном контроле, содержащем ДНК бактерий другого вида. На основе анализа амплификационных кривых проводится оценка количества копий ДНК Propionibacterium acnes в исследуемом образце, а также специфичность проведенной реакции.

Заявляемое изобретение соответствует требованию промышленной применимости и может быть осуществлено с применением современных материалов и технологий.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" productionDate="2025-02-18"

originalFreeTextLanguageCode="ru">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2024112319</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2024-05-06</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>AB123</ApplicantFileReference>

<ApplicantName languageCode="ru">ГАУЗ Межрегиональный клинико

диагностический центр</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>GAUZ Mezhregionalnyi kliniko diagnosticheskii

tsentr</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Способ количественного

определения ДНК бактерий Propionibacterium acnes в крови пациента

путем амплификации фрагментов ДНК Propionibacterium acnes со

специфическими праймерами</InventionTitle>

<InventionTitle languageCode="en">Method for quantitative

determination of Propionibacterium acnes DNA in patient's blood by

amplification of Propionibacterium acnes DNA fragments with specific

primers</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Propionibacterium

acnes</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgctgccattctttctca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Propionibacterium

acnes</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tacagtttcatcccgatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Propionibacterium

acnes</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ttgaggtgtccgatgatg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Propionibacterium

acnes</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>ggaatgggagaagcagtt</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу обнаружения нуклеиновых кислот Propionibacterium acnes в образце крови. Указанный способ осуществляют методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием праймеров с последовательностями SEQ ID NO: 1-4, и он включает выделение, очищение тотальной бактериальной ДНК и выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, а в качестве матрицы для ПЦР используют тотальную бактериальную РНК. Настоящее изобретение обеспечивает эффективный способ определения ДНК бактерий Propionibacterium acnes. 3 ил.

Способ обнаружения нуклеиновых кислот Propionibacterium acnes в образце крови методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, включающий выделение, очищение тотальной бактериальной ДНК, выполнение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени, отличающийся тем, что в качестве матрицы для ПЦР используют тотальную бактериальную РНК, предусматривающий использование праймеров:

P.acnes-Pac-guaA

F: tgctgccattctttctca

R: tacagtttcatcccgatg

Отрицательный контроль - P.acid - HAMP

F: ttgaggtgtccgatgatg

R: ggaatgggagaagcagtt,

состав смеси ПЦР включает:

1. Дезоксинуклеотидтрифосфаты 2,5 мМ;

2. 10-кратный ПЦР Буфер;

3. MgCl₂, 25 мМ;

4. Taq ДНК - полимераза с ингибирующими активность фермента антителами 5 Е/мкл;

5. Вода обработанная DEPC;

6. ЕvaGreen краситель 50x раствор в воде.