Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для лечения злокачественной опухоли, содержащей в качестве активных ингредиентов слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, и противораковое средство.

Уровень техники

Интерлейкин 2 (IL-2), также называемый T-клеточным фактором роста (TCGF), представляет собой глобулярный гликопротеин, который играет центральную роль в продуцировании, выживании и гомеостазе лимфоцитов. Размер белка IL-2 составляет от 15,5 кДа до 16 кДа, и он состоит из 133 аминокислот. IL-2 опосредует различные иммунные действия путем связывания с рецептором IL-2, состоящим из трех различных субъединиц.

Кроме того, IL-2 в основном синтезируется активированными T-клетками, в частности, CD4+ хелперными T-клетками. IL-2 стимулирует пролиферацию и дифференцировку T-клеток и индуцирует продуцирование цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) и дифференцировку лимфоцитов периферической крови человека в цитотоксические клетки и лимфокин-активируемые киллеры (LAK-клетки).

Между тем, CD80, также известный как B7-1, является представителем семейства B7 мембраносвязанных белков, которые вовлечены в иммунную регуляцию путем связывания с лигандом посредством обеспечения костимулирующих ответов и коингибирующих ответов. CD80 представляет собой трансмембранный белок, экспрессируемый на поверхности T-клеток, B-клеток, дендритных клеток и моноцитов. Известно, что CD80 связывает CD28, CTLA-4 (CD152) и PD-L1 (лиганд 1 белка запрограммированной смерти). CD80, CD86, CTLA-4 и CD28 вовлечены в костимулирующую-коингибирующую систему. Например, они регулируют активность T-клеток и вовлечены в их пролиферацию, дифференцировку и выживаемость.

Кроме того, недавно привлекли внимание ингибиторы иммунных точек контроля, такие как Китруда^®. Ингибиторы иммунных точек контроля представляют собой средства против злокачественной опухоли, которые помогают атаковать злокачественные клетки посредством активации иммунной системы организма. До настоящего времени терапия злокачественной опухоли была сфокусирована на уничтожении быстроделящихся клеток, что является характеристикой злокачественных клеток, так что она имеет побочные эффекты в виде действия на быстро пролиферирующие клетки среди нормальных клеток, также как и на злокачественные клетки. Однако известно, что иммунные средства против злокачественной опухоли поражают злокачественные клетки посредством использования иммунной системы пациентов со злокачественной опухолью, так что они имеют мало типичных побочных эффектов, которые демонстрируют существующие противораковые средства. Антитела против PD-1, такие как Китруда, связываются со специфическим рецептором (PD-1) на T-клетках и блокируют путь, посредством которого злокачественные клетки ускользают от системы надзора активных T-клетках, тем самым демонстрируя противораковый эффект посредством иммунной реактивации, которая позволяет T-клетками в организме человека атаковать злокачественные клетки (KR 10-2018-0030580 A).

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Авторы настоящего изобретения провели исследования для разработки IL-2, который является безопасным и эффективным. В результате, авторы настоящего изобретения подтвердили, что новый слитый белок, который содержит белок IL-2 и белок CD80 в одной молекуле и противораковое средство, демонстрируют превосходный противораковый эффект, тем самым осуществив настоящее изобретение.

Решение проблемы

Для достижения указанной выше цели в одном аспекте настоящего изобретения предусматривается фармацевтическая композиция для лечения злокачественной опухоли, содержащая в качестве активных ингредиентов слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, и противораковое средство.

Эффекты изобретения

Слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80 может не только активировать иммунные клетки благодаря IL-2, но также может эффективно регулировать Treg-клетки благодаря CD80. Кроме того, было подтверждено, что синергический эффект появлялся при введении в комбинации со средством против злокачественной опухоли. Таким образом, фармацевтическая композиция для лечения злокачественная опухоли, содержащая в качестве активных ингредиентов слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, и противораковое средство, может быть с пользой использована для лечения онкологического заболевания.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 проиллюстрирован схематическая диаграмма варианта осуществления димерного слитого белка.

На фиг.2 проиллюстрирована схематическая диаграмма механизма действия, посредством которого димерный слитый белок действует в лимфатических узлах.

На фиг.3 проиллюстрирована схематическая диаграмма механизма действия, посредством которого димерный слитый белок действует в опухолевом микроокружении.

На фиг.4 проиллюстрировано схематическое изображение структуры слитого белка. Здесь, каждый из GI101 и mGI101 является вариантом осуществления слитого белка, и GI101C1, GI101C2 и mGI101C1 являются сравнительными примерами для сравнения с активностью слитого белка.

На фиг.5 проиллюстрированы различные варианты осуществления слитого белка. Для получения слитого белка можно комбинировать белки человека и мыши. Белок CD80 и белок IL-2 могут быть связаны через различные линкеры, отличные от Fc.

На фиг.6 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка (GI101) посредством SDS-PAGE.

На фиг.7 проиллюстрированы количества слитого белка (GI101), измеренные по поглощению.

На фиг.8 проиллюстрирован результат, полученный путем анализа полученного димерного слитого белка (GI101) посредством эксклюзионной хроматографии (SEC).

На фиг.9 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка mGI101 посредством SDS-PAGE.

На фиг.10 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка GI101C1 посредством SDS-PAGE.

На фиг.11 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка GI101C2 посредством SDS-PAGE.

На фиг.12 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка mGI101C1 посредством SDS-PAGE.

На фиг.13 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка GI102-M45 посредством SDS-PAGE.

На фиг.14 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка GI102-M61 посредством SDS-PAGE.

На фиг.15 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации полученного димерного слитого белка GI102-M72 посредством SDS-PAGE.

На фиг.16 проиллюстрирована аффинность связывания между hCTLA-4 и GI101.

На фиг.17 проиллюстрирована аффинность связывания между hPD-L1 и GI101.

На фиг.18 проиллюстрирована аффинность связывания между hPD-L1 и hPD-1.

На фиг.19 проиллюстрирована аффинность связывания между mCTLA-4 и mGI101.

На фиг.20 проиллюстрирована аффинность связывания между mPD-L1 и mGI101.

На фиг.21 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации способности к связыванию GI101 (hCD80-Fc-hIL-2v) с CTLA-4. Было идентифицировано, что GI101 (hCD80-Fc-hIL-2v) обладает высокой способностью к связыванию CTLA-4.

На фиг.22 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации аффинности связывания GI101 с IL-2Rα или IL-2Rβ.

На фиг.23 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации аффинности связывания GI101 с IL-2Rα.

На фиг.24 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации аффинности связывания GI101 с IL-2Rβ.

На фиг.25 проиллюстрирована аффинность связывания IL-2Rα с GI102-M45.

На фиг.26 проиллюстрирована аффинность связывания IL-2Rα с GI102-M61.

На фиг.27 проиллюстрирована аффинность связывания связывания IL-2Rα с GI102-M72.

На фиг.28 проиллюстрирована аффинность связывания связывания IL-2Rβ с GI102-M45.

На фиг.29 проиллюстрирована аффинность связывания связывания IL-2Rβ с GI102-M61.

На фиг.30 проиллюстрирована аффинность связывания связывания IL-2Rβ с GI102-M72.

На фиг.31 и 32 проиллюстрированы результаты, полученные путем определения количеств IFN-γ, секретируемого из клеток, когда клетки обрабатывают и инкубируют с GI101, GI101C1, GI101C2 или IL-2 в соответствующих концентрациях.

На фиг.33 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации эффектов GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 (пролейкин) на пролиферацию CD8+ T-клеток.

На фиг.34 представлено схематическая диаграмма механизма, посредством которого GI101 действует на эффекторные T-клетки.

На фиг.35 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации эффектов GI101 и GI102 на пролиферацию CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток. Здесь, на фиг.35A проиллюстрированы доли CD8+ T-клеток и CD4+ T-клеток, на фиг.35B проиллюстрирована способность CD8+ T-клеток к пролиферации, и на фиг.35C проиллюстрирована доля CD4+/FoxP3+ Treg клеток.

На фиг.36 и 37 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации эффектов GI101 и GI101w на пролиферацию CD8+ T-клеток и NK-клеток.

На фиг.38 и 39 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации эффекта GI101 на эффекторные T-клетки.

На фиг.40 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации эффектов mGI101 и mGI102-M61 на иммунные клетки мыши.

На фиг.41 и 42 проиллюстрированы результаты, полученные путем идентификации ингибиторного эффекта GI101 через активность T-клеток на злокачественные клетки, экспрессирующие PD-L1 и CTLA-4.

На фиг.43 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации ингибирующего опухоль эффекта mGI101, в зависимости от его дозы, у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26).

На фиг.44 проиллюстрированы результаты, полученные путем анализа выживаемости мышей в зависимости от введения mGI101 у мышей, которым трансплантировали происходящие из мыши клетки рака ободочной и прямой кишки (CT26).

На фиг.45 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации ингибирующего опухоль эффекта GI101 у мышей, трансплантированных клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26).

На фиг.46 проиллюстрированы результаты, полученные путем введения мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26) hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем FACS-анализа CD8+ T-клеток, IFN-γ T-клеток, CD4+ T-клеток и Treg-клеток в тканях злокачественной опухоли.

На фиг.47 графически проиллюстрированы результаты, полученные путем лечения мышей с трансплантированными происходящим из мыши клетками рака ободочной и прямой кишки (CT26) посредством hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем FACS-анализа CD8+ T-клеток, IFN-γ T-клеток, CD4+ T-клеток и Treg-клеток в злокачественных тканях.

На фиг.48 проиллюстрированы результаты, полученные путем лечения мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26) посредством hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем анализа посредством FACS макрофагов в злокачественных тканях.

На фиг.49 графически проиллюстрированы результаты, полученные путем лечения мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26) посредством hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем анализа посредством FACS макрофагов в злокачественных тканях.

На фиг.50 проиллюстрированы результаты, полученные путем лечения мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26) посредством hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем анализа посредством FACS дендритных клеток в злокачественных тканях.

На фиг.51 проиллюстрированы результаты, полученные путем лечения мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26) посредством hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем анализа посредством FACS дендритных клеток в злокачественных тканях.

На фиг.52 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации эффекта GI101 в отношении ингибирования опухоли у мышей, которым трансплантировали происходящие из мыши клетки рака легкого (LL/2).

На фиг.53 графически проиллюстрированы результаты, полученные путем введения мышам с трансплантированными происходящим из мыши клетками рака легкого (LL2) hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем FACS-анализа CD8+ T-клеток, IFN-γ T-клеток, CD4+ T-клеток и Treg-клеток в злокачественных тканях.

На фиг.54 графически проиллюстрированы результаты, полученные путем введения мышам с трансплантированными происходящими из мыши клетками рака легкого (LL2) hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем FACS-анализа макрофагов в злокачественных тканях.

На фиг.55 графически проиллюстрированы результаты, полученные путем введения мышам с трансплантированными происходящими из мыши клетками рака легкого (LL2) hIgG4, антитела против PD-1 или GI101, а затем FACS-анализа дендритных клеток в злокачественных тканях.

На фиг.56 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации эффекта mGI102-M61 в отношении ингибирования опухоли у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26).

На фиг.57 проиллюстрированы результаты, полученные путем анализа выживаемости мышей в зависимости от введения mGI102-M61 у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26).

На фиг.58 проиллюстрирован результат, полученный путем идентификации эффекта mGI101 в отношении ингибирования опухоли у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26).

На фиг.59 проиллюстрирована степень ингибирования посредством mGI101 опухоли у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши (CT26).

На фиг.60 проиллюстрирован график, демонстрирующий рост опухоли, когда комбинацию GI101 и Китруды применяли у мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231). Группы, в которых вводили каждый из GI101 и Китруды, продемонстрировали ингибирование роста опухоли по сравнению с контролем (hIgG4). Группа, в которой вводили комбинацию GI101 и Китруды, продемонстрировала ингибирование роста опухоли по сравнению с контролем. Группа, в которой вводили комбинацию GI-101 и Китруды, продемонстрировала ингибирование роста опухоли по сравнению с группой, в которой вводили каждый из GI101 и Китруды.

На фиг.61 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда комбинацию GI-101 и Китруды применяли у мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231). Группы, в которых вводили IgG4, продемонстрировали степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 2 мышей, 50% или более у 1 мыши, и 80% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили GI101, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 5 мышей, 50% или более у 5 мышей, и 80% или более у 2 мышей. Группа, в которой вводили Киитруду, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 7 мышей, 50% или более у 5 мышей, и 80% или более у 3 мышей. Группа, в которой вводили комбинацию GI101 и Китруды, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 8 мышей, 50% или более у 8 мышей, и 80% или более у 6 мышей.

На фиг.62 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных каждой группы введения, когда комбинацию GI101 и Китруды вводили мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231).

На фиг.63 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231), в которой вводили hIgG4.

На фиг.64 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231), в которой вводили GI101.

На фиг.65 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231), в которой вводили Китруду.

На фиг.66 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (MDA-MB-231), в которой вводили комбинацию GI101 и Китруды.

На фиг.67 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и антитело против PD-1 вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38).

На фиг.68 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и антитело против PD-1 вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38).

На фиг.69 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных каждой группы введения, когда mGI101 и антитело против PD-1 вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38).

На фиг.70 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38), в которой вводили hIgG4.

На фиг.71 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38), в которой вводили mGI101.

На фиг.72 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38), в которой вводили антитело против PD-1.

На фиг.73 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных группы мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38), в которой вводили комбинацию mGI101 и антитела против PD-1.

На фиг.74 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных после реинъекции происходящих из грызунов клеток рака ободочной и прямой кишки экспериментальному животному, демонстрирующему полную ремиссию, в группе мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38), в которой вводили комбинацию mGI101 и антитела против PD-1.

На фиг.75 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и антитело против PD-L1 вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.76 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и антитело против TIGIT вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.77 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и галунисертиб, ингибитор TGF-βR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.78 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и галунисертиб, ингибитор TGF-βR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.79 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101, галунисертиб, ингибитор TGF-βR, и их комбинацию вводили мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.80 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и акситиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.81 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и акситиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.82 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 и акситиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.83 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и акситиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (LL/2).

На фиг.84 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и акситиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (LL/2).

На фиг.85 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 и акситиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (LL/2).

На фиг.86 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и ленватиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.87 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и ленватиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.88 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 и ленватиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.89 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и ленватиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными происходящими из грызунов клетками рака почки (Renca).

На фиг.90 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и ленватиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными происходящими из грызунов клетками рака почки (Renca).

На фиг.91 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 и ленватиниб, ингибитор VEGFR, вводили в комбинации мышам с трансплантированными происходящими из грызунов клетками рака почки (Renca).

На фиг.92 проиллюстрирован эффект уничтожения линии злокачественных клеток, когда mGI101, цетуксимабом в качестве ингибитора EGFR, и их комбинацией обрабатывали линию клеток рака ободочной и прямой кишки (HCT116).

На фиг.93 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и олапариб, ингибитор PARP, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.94 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и олапариб, ингибитор PARP, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.95 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 и олапариб, ингибитор PARP, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.96 представлена схематическая диаграмма экспериментальной схемы введения mGI101 и гуадецитабина, ингибитора ДНК-метилтрансферазы, в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.97 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 (0,6 мг/кг) и гуадецитабин, ингибитор ДНК-метилтрансферазы, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.98 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 (0,6 мг/кг) и гуадецитабин, ингибитор ДНК-метилтрансферазы, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.99 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 (0,6 мг/кг) и гуадецитабин, ингибитор ДНК-метилтрансферазы, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.100 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 (3 мг/кг) и гуадецитабин, ингибитор ДНК-метилтрансферазы, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.101 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 (3 мг/кг) и гуадецитабин, ингибитор ДНК-метилтрансферазы, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.102 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 (3 мг/кг) и гуадецитабин, ингибитор ДНК-метилтрансферазы, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (CT26).

На фиг.103 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101, доцетаксел и антитело против PD-L1 вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.104 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101, доцетаксел и антитело против PD-L1 вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.105 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101, доцетаксел и антитело против PD-L1 вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.106 представлена схематическая диаграмма экспериментальной схемы введения mGI101 и паклитаксела в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (EMT6).

На фиг.107 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и паклитаксел вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (EMT6).

На фиг.108 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и паклитаксел вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (EMT6).

На фиг.109 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 и паклитаксел вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (EMT6).

На фиг.110 представлена экспериментальная схема для идентификации противоракового эффекта после введения mGI101, цисплатина, пеметрекседа и антитела против PD-1 в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (TC1). Кроме того, также на вышеуказанной фигуре представлена схематическая диаграмма экспериментальной схемы для идентификации эффекта поддерживающей терапии посредством mGI101.

На фиг.111 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101, цисплатин, пеметрексед и антитело против PD-1 вводили в комбинации и проводили поддерживающую терапию у мышей с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (TC1).

На фиг.112 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101, цисплатин, пеметрексед и антитело против PD-1 вводили в комбинации и проводили поддерживающую терапию у мышей с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (TC1).

На фиг.113-117 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных для каждой экспериментальной группы, когда mGI101, цисплатин, пеметрексед и антитело против PD-1 вводили в комбинации и проводили поддерживающую терапию у мышей с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (TC1).

На фиг.118 проиллюстрирована выживаемость у мышей после введения mGI101, цисплатина, пеметрекседа и антитела против PD-1 в комбинации и проведения поддерживающей терапии у мышей с трансплантированными клетками рака легкого грызунов (TC1).

На фиг.119 проиллюстрирован график роста опухоли, когда GI101 и трастузумаб вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (BT-474).

На фиг.120 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда GI101 и трастузумаб вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (BT-474).

На фиг.121 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда GI101 и трастузумаб вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы человека (BT-474).

На фиг.122 проиллюстрирован эффект уничтожения линии злокачественных клеток в зависимости от концентраций GI101, когда GI101, пертузумабом, ингибитором Her2, и их комбинацией обрабатывали клеточную линию рака ободочной и прямой кишки человека (HCT116).

На фиг.123 проиллюстрирован график роста опухоли, когда mGI101 и абемациклиб, ингибитор CDK4/6, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.124 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI101 и абемациклиб, ингибитор CDK4/6, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.125 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных, когда mGI101 и абемациклиб, ингибитор CDK4/6, вводили в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы грызунов (4T1).

На фиг.126 проиллюстрирован эффект уничтожения линии злокачественных клеток, когда GI101, рибоциклибом, ингибитором CDK4/6, и их комбинацией обрабатывали линии клеток рака молочной железы человека (MDA-MB-231).

На фиг.127 проиллюстрирована схематическая диаграмма схемы эксперимента по введению mGI101 и DMXAA, агониста STING, в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38).

На фиг.128 проиллюстрирована выживаемость мышей после введения mGI101 и DMXAA, агониста STING, в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38).

На фиг.129 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных после введения mGI101 и DMXAA, агониста STING, в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38).

На фиг.130-133 проиллюстрирована степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных для каждой экспериментальной группы после введения mGI101 и DMXAA, агониста STING, в комбинации мышам с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки грызунов (MC38).

Наилучшие способы осуществления изобретения

Комбинированная терапия слитым белком

В одном из аспектов настоящего изобретения предусматривается фармацевтическая композиция для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, содержащая в качестве активных ингредиентов димерный слитый белок, содержащий белок CD80 или его фрагмент и белок IL-2 или его вариант; и противораковое средство.

Поскольку димерный слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80 повышает иммунную активность в организме, он может использоваться в комбинации с различными способами лечения злокачественной опухоли, которые традиционно используются. В частности, общепринятый способ лечения, который может быть использован в комбинации, может быть выбран из группы, состоящей из противоракового химиотерапевтического средства для химиотерапии, таргетного противоракового средства, противоракового вируса, антительного терапевтического средства, средства клеточной терапии, ингибитора иммунной точки контроля и их комбинации.

Как используют в рамках изобретения, термин "противораковое химиотерапевтическое средство" также упоминается как антинеопластическое средство или цитотоксическое средство. Он является общим термином для лекарственных средств, которые демонстрируют противораковую активность в основном путем действия непосредственно на ДНК, блокируя процессы репликации ДНК, транскрипции и трансляции, или путем препятствования синтезу предшественников нуклеиновых кислот в метаболическом пути или путем ингибирования клеточного деления. Антинеопластическое средство демонстрирует цитотоксичность посредством действия не только на опухолевые клетки, но также и на нормальные клетки. Противораковое химиотерапевтическое средство может применяться в поддерживающей терапии. Кроме того, как используют в рамках изобретения, термин "поддерживающая терапия" относится к лечению злокачественной опухоли лекарственными средствами после первоначального противоракового лечения, и он относится к способу лечения, проводимому для предупреждения или отсрочивания рецидива злокачественной опухоли.

В частности, противораковое химиотерапевтическое средство может представлять собой любое средство, выбранное из группы, состоящей из алкилирующего средства, ингибитора микротрубочек, антиметаболита и ингибитора топоизомеразы. Алкилирующее средство может представлять собой любое средство, выбранное из группы, состоящей из мехлорэтамина, циклофосфамида, ифосфамида, мелфалана, хлорамбуцила, тиотепы, алтретамина, прокарбазина, бусульфана, стрептозоцина, кармустина, ломустина, дакарбазина, цисплатина, карбоплатина и оксалиплатина. Ингибитор микротрубочек может быть любым, выбранным из группы, состоящей из доцетаксела, велбана, онковина и навелбина. Антиметаболит может быть любым, выбранным из группы, состоящей из фторурацила, капецитабина, цитарабина, гемцитабина, флударабина, метотрексата, пеметрекседа и меркаптопурина. Ингибитор топоизомеразы может быть любым, выбранным из группы, состоящей из гикамтина, камптосар, вепесида, паклитаксела, бленоксана, адриамицина и церубидина.

Как используют в рамках изобретения, термин "таргетное противораковое средство" представляет собой терапевтическое средство, которое специфически уничтожает злокачественные клетки путем блокирования сигналов, вовлеченных в рост и развитие злокачественной опухоли, посредством нацеливания на конкретные белки или конкретные генетические изменения, которые часто присутствуют только в злокачественных клетках. Их классифицируют на моноклональные антитела, которые реагируют снаружи клетки, и низкомолекулярные вещества, которые действуют внутри клетки. Моноклональные антитела представляют собой противораковые средства, которые блокируют индуцирующие сигналы злокачественных клеток, передаваемые наружу клеток, и действуют на сигналы инициации, связанные с пролиферацией, гибелью и т.п.; и низкомолекулярные вещества действуют на комплексную передачу сигнала, происходящую внутри клеток.

В частности, белки, на которые осуществляется нацеливание, могут представлять собой EGFR, VEGFR, CD20, CD38, RNAK-L, BTK, Bcr-abl, семейство PDGFR/FGFR, MEK/RAF, HER2/Neu, убиквитин, JAK, ALK, PARP, TGFβRI, протеасому, Bcl-2, C-Met, VR1, VR2, VR3, c-kit, AXL, RET, Braf, DNMT, CDK4/6, STING и т.п.

Таргетное противораковое средство может быть любым, выбранным из группы, состоящей из цетуксимаба, трастузумаба, пертузумаба, акситиниба, ленватиниба, бевацизумаба, рамуцирумаба, афлиберцепта, ритуксимаба, обинутузумаба, даратумумаба, деносумаба, ибрутиниба, дасатиниба, нилотиниба, иматиниба, босутиниба, галунисертиба, вактосертиба, нинтеданиба, сунитиниб, сорафениба, кабозантиниба, регорафениба, маситиниба, семаксаниба, тивозаниба, вандатаниба, пазопаниба, траметиниба, дабрафениба, трастузумаба, афатиниба, лапатиниба, нератиниба, леналидомида, иксазомиба, руксолитиниба, лестауртиниба, пакритиниба, кобиметиниба, селуметиниба, траметиниба, биниметиниба, алектиниба, кризотиниба, венетоклакса, кризотиниба, кабозантиниба, бемцентиниба, гилтеритиниба, селперкатиниба, пралсетиниба, вемурафениба, олапариба, талазопариба, нирапариба, рукапариба, азацитидина, децитабина, гуадецитабина, абемациклиба, рибоциклиба, пальбоциклиба, CDN, SB11285 и DMXAA.

Как используют в рамках изобретения, термин "рецептор эпидермального фактора роста (EGFR)" представляет собой рецептор клеточной мембраны, который регулирует рост, деление, выживание и смерть клеток. При различных онкологических заболеваниях экспрессия EGFR возрастает в опухолевых тканях. Известно, что опухолевые ткани с повышенным уровнем EGFR являются инвазивными, метастазирующими и в высокой степени резистентными к противораковым средствам. Ингибитор EGFR может представлять собой вещество, которое ингибирует EGFR. В одном из вариантов осуществления оно может представлять собой цетуксимаб, трастузумаб, пертузумаб, гефитиниб, элотиниб или панитумумаб.

Как используют в рамках изобретения, термин "рецептор сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFR)" представляет собой рецептор на клеточной мембране для сосудисто-эндотелиального фактора роста, который индуцирует ангиогенез, и ингибитор VEGFR ингибирует ангиогенез, подавляя рост и метастазирование опухоли. В одном из вариантов осуществления ингибитор VEGFR может представлять собой акситиниб, ленватиниб, бевацизумаб, рамуцирумаб или афлиберцепт.

Как используют в рамках изобретения, термин "CD20 (B-лимфоцитарный антиген CD20)" представляет собой белок, экспрессируемый на поверхности B-клеток, и он используется в качестве белка-мишени для лечения B-клеточной лимфомы. Таргетный ингибитор CD20 может представлять собой ритуксимаб или обинутузумаб.

Как используют в рамках изобретения, термин "CD38 (кластер дифференцировки 38)" представляет собой белок, который регулирует клеточную пролиферацию и смерть, одновременно выступая в качестве рецептора передачи сигнала в иммунных клетках, и ингибитор, нацеленный на него, может представлять собой даратумумаб.

Как используют в рамках изобретения, термин "RNAK-L (рецепторный активатор лиганда ядерного фактора каппа-Β)" представляет собой рецептор RANK, экспрессируемый на поверхности остеокластов, и, когда он активируется связыванием с его лигандом, он действует, вызывая разрушение кости. Ингибитор RANK-L в основном применяется у пациентов со злокачественной опухолью, страдающих от метастазов в кость или остеопороза, и, в частности, он может представлять собой деносумаб.

Как используют в рамках изобретения, термин "BTK (тирозинкиназа Брутона)" представляет собой фермент, вовлеченный в пролиферацию B-клеток, и при экспрессии он может вызывать развитие гематологическое злокачественной опухоли. В одном из вариантов осуществления таргетный ингибитор BTK может представлять собой ибрутиниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "Bcr-abl" представляет собой слитый белок, который на высоком уровне экспрессируется у пациентов с хроническим миелогенным лейкозом пациенты, и известно, что он индуцирует аномальную пролиферацию клеток крови. В частности, ингибитор этого белка может представлять собой дасатиниб, нилотиниб, иматиниб или босутиниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "рецептор фактора роста опухоли β (TGFβR)" представляет собой рецептор клеточной мембраны для фактора роста опухоли, и он регулирует рост, миграцию, дифференцировку, смерть и т.п. эпителиальных клеток и кроветворных клеток. Таргетный ингибитор TGFβR включает, но не ограничивается ими, галунисертиб, вактосертиб и т.п.

Как используют в рамках изобретения, термин "PDGFR (рецептор тромбоцитарного фактора роста)" представляет собой рецептор клеточной мембраны для PDGF, который часто экспрессируется в злокачественных клетках и известен тем, что он регулирует рост, метастазирование и резистентность к лекарственным средствам путем участия в ангиогенезе. FGFR (рецептор фибробластного фактора роста) представляет собой рецептор фибробластного фактора роста (FGF), и он регулирует различные биологические процессы, включая рост, дифференцировку, миграцию клеток и т.п. Ген FGFR легко мутирует, и эти варианты часто наблюдаются при раке молочной железы, раке тела матки, раке яичника, раке шейки матки и т.п. Ингибитор, нацеленный на PDGFR или FGFR, может представлять собой нинтеданиб, сунитиниб, сорафениб, кабозантиниб, ленватиниб, регорафениб, маситиниб, самаксаниб, тивозаниб, вандатаниб, акситиниб или пазопаниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "MEK/RAF" представляет собой внутриклеточный медиатор передачи сигнала, вовлеченный в клеточную пролиферацию, регуляцию клеточного цикла, выживание клеток, ангиогенез, клеточную миграцию и т.п., и он сверхактивируется в злокачественных клетках. Ингибитор, нацеленный на MEK/RAF, может представлять собой траметиниб или дабрафениб.

Как используют в рамках изобретения, термин "HER-2/neu (рецептор 2 эпидермального фактора роста человека) регулирует клеточную пролиферацию посредством активации PI3K/AkT. Известно, что он сверхэкспрессируется при метастазирующем раке молочной железы и раке яичника, и т.п., и индуцирует резистентность к противораковым средствам. Таргетное противораковое средство, направленное на Her2/neu, может представлять собой трастузумаб, афатиниб, лапатиниб или нератиниб.

Как используют в рамках изобретения, "убиквитин" поддерживает клеточный гомеостаз путем связывания с другими белками и индукции протеолиза (система убиквитин-протеасома, UPS) протеасомой, которая представляет собой протеолитический фермент. Аномальная экспрессия или активность UPS наблюдается в различных злокачественных опухолях, и ее ингибитор демонстрирует противораковую активность. В частности, ингибитором, нацеленным на убиквитин или протеасому, может быть леналидомид или иксазомиб.

Как используют в рамках изобретения, термин "JAK (Janus-киназа)" относится к белку выше STAT, который представляет собой фактор транскрипции, который регулирует клеточную пролиферацию, выживание клеток, клеточную миграцию и иммунный ответ. Известно, что ингибитор JAK снижает клеточную пролиферацию и индуцирует клеточную смерть путем ингибирования активности STAT. Таргетный ингибитор JAK может представлять собой руксолитиниб, лестауртиниб или пакритиниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "MAP2K (киназа митоген-активируемой протеинкиназы)" представляет собой внутриклеточный медиатор передачи сигнала, вовлеченный в клеточную пролиферацию, регуляцию клеточного цикла, выживаемость клеток, ангиогенез, миграцию клеток и т.п. посредством фосфорилирования MAPK, и он сверхактивируется в злокачественных клетках. Таргетный ингибитор MAP2K может представлять собой кобиметиниб, селуметиниб, траметиниб или биниметиниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "ALK (киназа анапластической лимфомы)" представляет собой медиатор передачи сигналы, который способствует клеточной пролиферации, клеточной миграции и ангиогенезу и ингибирует клеточную смерть; и он сверхактивируется в различных злокачественных тканях. Таргетный ингибитор ALK может представлять собой алектиниб или кризотиниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "Bcl-2" представляет собой белок, который ингибирует клеточную смерть, и он сверхэкспрессируется или сверхактивируется в различных злокачественных тканях. Ингибитор, нацеленный на Bcl-2, может представлять собой венетоклакс.

Как используют в рамках изобретения, термин "C-Met" представляет собой рецептор фактора роста гепатоцитов (HGF) и активирует передачу сигнала, связанную с клеточным ростом, формированием, подвижностью, выживаемостью, ангиогенезом и т.п. Таргетное противораковое средство, направленное на C-Met, может представлять собой кризотиниб или кабозантиниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "VR (ваниллоидный рецептор)" также известен как TRPV (белок с транзиторным рецепторным потенциалом ваниллоидный), и он существует в форме VR1, VR2, VR3, VR4, VR5 и VR6. Известно, что VR регулирует пролиферацию, смерть, миграцию, инфильтрацию и ангиогенез злокачественных клеток на каждой стадии в ходе прогрессирования злокачественной опухоли.

Как используют в рамках изобретения, термин "c-kit", также известен как CD117, и он индуцирует передачу сигнала, которая активирует выживание, пролиферацию и дифференцировку клеток. C-kit является протоонкогеном, и сверхэкспрессия или мутация его гена связана с возникновением злокачественной опухоли.

Как используют в рамках изобретения, термин "AXL (рецептор тирозин-протеинкиназы UFO)" представляет собой рецептор тирозинкиназы, присутствующий на клеточной поверхности, и он опосредует передачу сигнала, вовлеченную в пролиферацию и выживание клеток. Известно, что он вовлечен в резистентность к противораковым средствам при лечении злокачественной опухоли. В одном из вариантов осуществления таргетным противораковым средством, направленным на AXL, может быть бемцентиниб или гилтеритиниб.

Как используют в рамках изобретения, термин "RET (реарранжируемый в ходе трансфекции)" относится к рецептору, который опосредует сигналы, вовлеченные в клеточную пролиферацию, клеточную смерть и выживание; и известно, что мутации в RET вовлечены в развитие злокачественной опухоли. Таргетный ингибитор RET может представлять собой селперкатиниб или пролсетиниб, но не ограничиваясь ими.

Как используют в рамках изобретения, термин "Braf" относится к медиатору передачи сигнала MAPK, вовлеченному в клеточную пролиферацию, регуляцию клеточного цикла, клеточное выживание, ангиогенез, клеточную миграцию и т.п., и в злокачественных клетках обнаруживаются его генетические мутации. Ингибитором, нацеленным на Braf, может быть вемурафениб.

Как используют в рамках изобретения, термин "PARP (поли[ADP-рибоза]полимераза)" относится к белку, который распознает поврежденную ДНК в ядре и активируется, а затем активирует связанный с репарацией ДНК белок. Таргетный ингибитор PARP подавляет пролиферацию злокачественных клеток посредством ингибирования репарации ДНК злокачественных клеток. В одном из вариантов осуществления таргетный ингибитор PARP может представлять собой олапариб, талазопариб, нирапариб или рукапариб.

Как используют в рамках изобретения, термин "ДНК-метилтрансфераза (DNMT)" представляет собой фермент, который переносит метильную группу на ДНК, и экспрессия гена ингибируется посредством указанного выше процесса. Таргетный ингибитор DMNT демонстрирует противораковую активность посредством ингибирования гиперметилирования гена-супрессора злокачественных клеток и индукции нормальной экспрессии гена-супрессора злокачественной опухоли. В одном из вариантов осуществления таргетный ингибитор DNMT может представлять собой азацитидин, децитабин или гуадецитабин.

Как используют в рамках изобретения, термин "CDK (циклин-зависимая киназа) 4/6" относится к белку, который регулирует клеточный цикл и способствует клеточному росту, и он сверхактивируется на стадии развития и прогрессирования различных злокачественных опухолей. Таргетный ингибитор CDK4/6 демонстрирует противораковую активность посредством ингибирования клеточного цикла злокачественных клеток, ингибирования клеточной пролиферации и индукции клеточной смерти. Таргетный ингибитор CDK4/6 может представлять собой абемациклиб или пальбоциклиб.

Как используют в рамках изобретения, термин "STING (стимулятор генов интерферонов)" относится к сенсору in vivo, который распознает ДНК-фрагменты, происходящие из злокачественных клеток, и активирует иммунные клетки в организме, такие как дендритные клетки, посредством стимуляции генов интерферонов. Агонист STING демонстрирует эффект усиления иммунитета и эффект ингибирования ангиогенеза злокачественной опухоли. Например, агонист STING может представлять собой CDN, SB11285, DMXAA и т.п.

Как используют в рамках изобретения, термин "противораковое вирусное терапевтическое средство" представляет собой терапевтическое средство, которое уничтожает злокачественную опухоль путем встраивания конкретного гена, нацеленного на злокачественные клетки, в вирус, который способен к пролиферации и обладает инфекционностью. Противораковое вирусное терапевтическое средство может представлять собой талимогенем или лагерпарепвек.

Как используют в рамках изобретения, термин "антительное терапевтическое средство" относится к терапевтическому средству, которое демонстрирует противораковый эффект посредством антитела, которое распознает конкретный белок на злокачественных клетках в качестве антигена. Антительное терапевтическое средство может представлять собой трастузумаб, эмтанзин, эмтанзин, ритуксимаб, ибритумомаб, тозитумомаб, брентуксимаб, офатумомаб, обинутузумаб, нецитумумаб, бевацизумаб, рамуцирумаб, ниволумаб, пембролизумаб, атезолизумаб, дурвалумаб, ипилимумаб и т.п.

Как используют в рамках изобретения, термин "иммунноклеточное терапевтическое средство" относится к терапевтическому средству, которое демонстрирует противораковый эффект посредством активации иммунного ответа в организме с использованием иммунных клеток, таких как дендритные клетки, натуральные киллеры и T-клетки. Иммунноклеточное терапевтическое средство используют после экстракции и стимуляции иммунных клеток в организме или модификации их способами генной инженерии для реинъекции в организм. репрезентативное иммунноклеточное терапевтическое средство включает T-клетки с модифицированным T-клеточным рецептором (TCR-T), модифицированные T-клетки с химерным рецептором антигена (CAR-T) и т.п. В частности, оно может представлять собой тисагенлеклейцел или аксикабтаген цилолейцел, но не ограничиваясь ими.

Как используют в рамках изобретения, термин "ингибитор иммунной точки контроля" относится к веществу, которое ингибирует активность белка иммунной точки контроля, который ингибирует дифференцировку, пролиферацию и активность иммунных клеток, и известно, что оно устраняет злокачественные клетки путем препятствования проявлению ими функции ускользания от иммунной системы. Ингибитор иммунной точки контроля может быть любым, выбранным из группы, состоящей из антитела против CTLA-4, антитела против PD-1, антитела против PD-L1, антитела против PD-L2, антитела против B7-H4, антитела против HVEM, антитела против TIM3, антитела против GAL9, антитела против LAG3, антитела против VISTA, антитела против KIR, антитела против BTLA и антитела против TIGIT. В одном из вариантов осуществления ингибитор иммунной точки контроля может представлять собой ипилимумаб, пембролизумаб, ниволумаб, цемиплимаб, атезолизумаб, авелумаб, дуралумаб и т.п., но не ограничиваясь ими.

Как используют в рамках изобретения, термин "ADC (конъюгат антитело-лекарственное средство)" относится к терапевтическому средству, которое химически связывает антитело и цитотоксическое лекарственное средство, демонстрируя высокий противораковый эффект посредством таргетной доставки. Оно может представлять собой гемтузумаб-озагомицин, брентуксимаб-ведотин, трастузумаб-эмтанзин, инотузумаб-озагомицин, эрибулин-мезилат и т.п.

Димерный слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, может использоваться в комбинации с противораковой вакциной и т.п.

Кроме того, противораковое средство может использоваться не только в комбинации с противораковым средством, описанным выше, но также в комбинации с противораковой вакциной и т.п.

Предпочтительно, противораковое средство может быть любым, выбранным из группы, состоящей из цисплатина, оксалиплатина, ALTIMA, акситиниба (VR1,2,3, PDGFR, c-kit), галунисертиба (TGFβRI), ленватиниба (VR1,2,3), рамуцирумаба (VR2), кабозатиниба (c-Met, VR2, AXL, RET), олапариба (PARP), гуадецитабина (DNMT), доцетаксела, паклитаксела, пеметрекседа, вемурафениба (Braf), абемациклиба (CDK4/6), цетуксимаба (EGFR), дурвалумаба (PD-L1), трастузумаба (Her2), DMXAA, NK-клеток, T-клеток и Китруды (PD-1).

Кроме того, противораковое средство может включать одно или несколько противораковых средств. В частности, димерный слитый белок обычно можно использовать вместе с двумя противораковыми средствами. В качестве примера, оно может представлять собой противораковое химиотерапевтическое средство и таргетное противораковое средство; противораковое химиотерапевтическое средство и противораковый вирус; таргетное противораковое средство и антительное терапевтическое средство; противораковое химиотерапевтическое средство и клеточное терапевтическое средство; и противораковое химиотерапевтическое средство и ингибитор иммунной точки контроля. Кроме того, оно может представлять собой таргетное противораковое средство и противораковый вирус; таргетное противораковое средство и антительное терапевтическое средство; таргетное противораковое средство и клеточное терапевтическое средство; таргетное противораковое средство и ингибитор иммунной точки контроля. Кроме того, оно может представлять собой противораковый вирус и антительное терапевтическое средство; противораковый вирус и клеточное терапевтическое средство; и противораковый вирус и ингибитор иммунной точки контроля. Кроме того, оно может представлять собой антительное терапевтическое средство и клеточное терапевтическое средство; и антительное терапевтическое средство и ингибитор иммунной точки контроля.

Кроме того, димерный слитый белок может использоваться с тремя противораковыми средствами. В дополнение к двумя противораковым средствам, может дополнительно быть включено и использоваться другое противораковое средство.

В одном из вариантов осуществления противораковое средство может представлять собой противораковое химиотерапевтическое средство и таргетное противораковое средство; противораковое химиотерапевтическое средство и ингибитор иммунной точки контроля; или противораковое химиотерапевтическое средство, таргетное противораковое средство и ингибитор иммунной точки контроля.

Применение димерного слитого белка в противораковой поддерживающей терапии

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается композиция для противораковой поддерживающей терапии, содержащая в качестве активного ингредиента димерный слитый белок, содержащий белок CD80 или его фрагмент и белок IL-2 или его вариант.

Как описано выше, "поддерживающая терапия" относится к лечению злокачественной опухоли после первоначального противоракового лечения. В частности, она представляет собой способ лечения, который усиливает эффект лечения злокачественной опухоли путем предупреждения или отсрочивания рецидива злокачественной опухоли.

В данном случае может быть дополнительно включено по меньшей мере одно противораковое средство для поддерживающей терапии. В данном случае противораковое средство является таким, как описано выше.

Набор, содержащий димерный слитый белок

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается набор для предупреждения или лечения злокачественной опухоли, содержащий в качестве активных ингредиентов димерный слитый белок, содержащий белок CD80 или его фрагмент, или белок IL-2 или его вариант, и противораковое средство.

В другом аспекте настоящего изобретения, предусматривается набор для противораковой поддерживающей терапии, содержащий в качестве активных ингредиентов димерный слитый белок, содержащий белок CD80 или его фрагмент и белок IL-2 или его вариант, и противораковое средство.

Слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80

Как используют в рамках изобретения, термин "IL-2" или "интерлейкин-2", если нет иных указаний, относится к любому IL-2 дикого типа, получаемому из любого источника, являющегося позвоночным, включая млекопитающих, например, приматов (таких как люди) и грызунов (таких как мыши и крысы). IL-2 может быть получен из клеток животных, и он также включает IL-2, полученный из рекомбинантных клеток, способных продуцировать IL-2. Кроме того, IL-2 может представлять собой IL-2 дикого типа или его вариант.

В настоящем описании, IL-2 или его вариант могут в совокупности обозначаться термином "белок IL-2" или "полипептид IL-2". IL-2, белок IL-2, полипептид IL-2 и вариант IL-2 специфически связывается, например, с рецептором IL-2. Это специфическое связывание может быть идентифицировано способами, известными специалистам в данной области.

Один из вариантов осуществления IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. Здесь, IL-2 также может быть в зрелой форме. В частности, зрелый IL-2 может не содержать сигнальную последовательность и может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. Здесь, IL-2 может использоваться в рамках концепции, охватывающей фрагмент IL-2 дикого типа, где IL-2 дикого типа укорочен с N-конца или C-конца.

Кроме того, фрагмент IL-2 может иметь форму, где N-конец белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36, укорочен на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательно расположенных аминокислот. Кроме того, фрагмент IL-2 может иметь форму, где C-конец белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36, укорочен на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 последовательно расположенных аминокислот.

Как используют в рамках изобретения, термин "вариант IL-2" относится к форме, где часть аминокислот в полноразмерном IL-2 или описанном выше фрагменте IL-2 заменена. Таким образом, вариант IL-2 может иметь аминокислотную последовательность, отличную от IL-2 дикого типа или его фрагмента. Однако вариант IL-2 может иметь активность, эквивалентную или сходную с IL-2 дикого типа. Здесь, "активность IL-2" может относиться, например, к специфическому связыванию с рецептором IL-2, которое можно определять способами, известными специалистам в данной области.

В частности, вариант IL-2 можно получать путем замены части аминокислот в IL-2 дикого типа. Вариант осуществления варианта IL-2, полученного путем аминокислотной замены, может быть получен путем замены по меньшей мере одной из 38-й, 42-й, 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замены по меньшей мере одной из 38-й, 42-й, 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой. Кроме того, когда IL-2 имеет форму, где часть N-конца в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 укорочена, аминокислота в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, может быть заменена другой аминокислотой. Например, когда IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, его вариант IL-2 может быть получен путем замены по меньшей мере одной из 58-й, 62-й, 65-й,81-й или 92-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35 другой аминокислотой. Эти аминокислотные остатки соответствуют 38-му, 42-му, 45-му, 61-му и 72-му аминокислотным остаткам в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, соответственно. Согласно одному из вариантов осуществления, одна, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять или десять аминокислот могут быть заменены при условии, что такой вариант IL-2 сохраняет активность IL-2. Согласно другому варианту осуществления могут быть заменены от одной до пяти аминокислот.

В одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может иметь форму, где две аминокислоты заменены. В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й и 42-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й и 45-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й и 61-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 42-й и 45-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 42-й и 61-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 42-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 45-й и 61-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 45-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Более того, вариант IL-2 может иметь форму, где три аминокислоты заменены. В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 42-й и 45-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 42-й и 61-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 42-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 45-й и 61-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 45-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 42-й, 45-й и 61-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 42-й, 45-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Кроме того, вариант IL-2 может иметь форму, где четыре аминокислоты заменены. В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 42-й, 45-й и 61-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 42-й, 45-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 38-й, 42-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замены 42-й, 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

Более того, вариант IL-2 может иметь форму, где пять аминокислот заменены. В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замены каждой из 38-й, 42-й, 45-й, 61-й и 72-й аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 другой аминокислотой.

Здесь, "другая аминокислота", внесенная путем замены, может представлять собой любую аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина, изолейцина, лейцина, лизина, метионина, фенилаланина, пролина, серина, треонина, триптофана, тирозина и валина. Однако, что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 38-я аминокислота не может быть заменена на аргинин, 42-я аминокислота не может быть заменена на фенилаланин, 45-я аминокислота не может быть заменена на тирозин, 61-я аминокислота не может быть заменена на глутаминовую кислоту и 72-я аминокислота не может быть заменена на лейцин.

Что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 38-я аминокислота, аргинин, может быть заменена аминокислотой, отличной от аргинина. Предпочтительно, что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 38-я аминокислота, аргинин, может быть заменена на аланин (R38A).

Что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 42-я аминокислота, фенилаланин, может быть заменена аминокислотой, отличной от фенилаланина. Предпочтительно, что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 42-я аминокислота, фенилаланин, может быть заменена на аланин (F42A).

Что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 45-я аминокислота, тирозин, может быть заменена на аминокислоту, отличную от тирозина. Предпочтительно, что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 45-я аминокислота, тирозин, может быть заменена на аланин (Y45A).

Что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 61-я аминокислота, глутаминовая кислота, может быть заменена на аминокислоту, отличную от глутаминовой кислоты. Предпочтительно, что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 61-я аминокислота, глутаминовая кислота, может быть заменена на аргинин (E61R).

Что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10 72-я аминокислота, лейцин, может быть заменена на аминокислоту, отличную от лейцина. Предпочтительно, что касается аминокислотной замены для варианта IL-2, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, 72-я аминокислота, лейцин, может быть заменена на глицин (L72G).

В частности, вариант IL-2 может быть получен путем по меньшей мере одной замены, выбранной из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G, в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может быть получен путем аминокислотных замен в двух, трех, четырех или пяти положениях из положений, выбранных из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может иметь форму, в которой заменены две аминокислоты. В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A и F42A. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A и Y45A. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A и E61R. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен F42A и Y45A. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен F42A и E61R. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен F42A и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен E61R и L72G.

Более того, вариант IL-2 может иметь форму, где три аминокислоты заменены. В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, F42A, и Y45A. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, F42A и E61R. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, F42A и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен Y45A, E61R и L72G.

Кроме того, вариант IL-2 может иметь форму, где четыре аминокислоты заменены. В частности, вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, F42A, Y45A и E61R. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, F42A, Y45A и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, F42A, E61R и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, Y45A, E61R и L72G. Кроме того, в одном из вариантов осуществления вариант IL-2 может быть получен путем замен F42A, Y45A, E61R и L72G.

Более того, вариант IL-2 может быть получен путем замен R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G.

Предпочтительно, вариант осуществления варианта IL-2 может содержать любую из следующих выбранных комбинаций замен (a)-(d) в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10:

(a) R38A/F42A

(b) R38A/F42A/Y45A

(c) R38A/F42A/E61R

(d) R38A/F42A/L72G.

Здесь, когда IL-2 имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. Кроме того, даже когда IL-2 представляет собой фрагмент аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, аминокислотная замена может присутствовать в положении, комплементарно соответствующем положению в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.

В частности, вариант IL-2 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6, 22, 23 или 24.

Кроме того, вариант IL-2 может характеризоваться наличием низкой токсичности in vivo. Здесь, низкая токсичность in vivo может представлять собой побочный эффект, вызванный связыванием IL-2 с альфа-цепью рецептора IL-2 (IL-2Rα). Были разработаны различные варианты IL-2 для облегчения побочного эффекта, вызванного связыванием IL-2 с IL-2Rα, и такие варианты IL-2 могут представлять собой варианты, описанные в патенте США № 5229109 и патенте Кореи № 1667096. В частности, варианты IL-2, описанные в настоящей заявке, имеют низкую способность связываться с альфа-цепью рецептора IL-2 (IL-2Rα) и, таким образом, имеют более низкую токсичность in vivo, чем IL-2 дикого типа.

Как используют в рамках изобретения, термин "CD80", также называемый "B7-1", представляет собой мембранный белок, присутствующий в дендритных клетках, активированных B-клетках и моноцитах. CD80 обеспечивает костимулирующие сигналы, необходимые для активации и выживания T-клеток. CD80 известен в качестве лиганда для двух различных белков, CD28 и CTLA-4, присутствующих на поверхности T-клеток. CD80 состоит из 288 аминокислот, и, в частности, он может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. Кроме того, как используют в рамках изобретения, термин "белок CD80" относится к полноразмерному CD80 или фрагменту CD80.

Как используют в рамках изобретения, термин "фрагмент CD80" относится к расщепленной форме CD80. Кроме того, фрагмент CD80 может представлять собой внеклеточный домен CD80. Один из вариантов осуществления фрагмента CD80 может быть получен путем удаления с N-конца аминокислот с 1-й по 34-ю, которые представляют собой сигнальную последовательность CD80. В частности, один из вариантов осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35-й по 288-ю в SEQ ID NO: 11. Кроме того, один из вариантов осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35-й по 242-ю в SEQ ID NO: 11. Кроме того, один из вариантов осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35-й по 232-ю в SEQ ID NO: 11. Кроме того, один из вариантов осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 35-й по 139-ю в SEQ ID NO: 11. Кроме того, один из вариантов осуществления фрагмента CD80 может представлять собой белок, состоящий из аминокислот с 142-й по 242-ю в SEQ ID NO: 11. В одном из вариантов осуществления фрагмент CD80 может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.

Кроме того, белок IL-2 и белок CD80 могут быть соединены друг с другом через линкер или носитель. В частности, IL-2 или его вариант и CD80 (B7-1) или его фрагмент могут быть связаны друг с другом через линкер или носитель. В настоящем описании "линкер" и "носитель" могут использоваться взаимозаменяемо.

Линкеры соединяют два белка. Один из вариантов осуществления линкера может включать 1-50 аминокислот, альбумин или его фрагмент, Fc-домен иммуноглобулина и т.п. Здесь, Fc-домен иммуноглобулина относится к белку, который содержит константную область тяжелой цепи 2 (CH2) и константную область тяжелой цепи 3 (CH3) иммуноглобулина и не содержит вариабельные области тяжелой и легкой цепей и константную область легкой цепи 1 (CH1) иммуноглобулина. Иммуноглобулин может представлять собой IgG, IgA, IgE, IgD или IgM, и предпочтительно может представлять собой IgG4. Здесь, Fc-домен иммуноглобулина G4 дикого типа может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4.

Кроме того, Fc-домен иммуноглобулина может представлять собой вариант Fc-домена, а также Fc-домен дикого типа. Кроме того, как используют в рамках изобретения, термин "вариант Fc-домена" может относиться к форме, которая отличается от Fc-домена дикого типа паттерном гликозилирования, имеет высокое гликозилирование по сравнению с Fc-доменом дикого типа или имеет низкое гликозилирование по сравнению с Fc-доменом дикого типа или дегликозилированную форму. Кроме того, он включает агликозилированный Fc-домен. Fc-домен или его вариант может быть адаптирован для наличия скорректированного количества сиаловых кислот, фукозилирований или гликозилирований, посредством условий культивирования или генетического манипулирования с хозяином.

Кроме того, гликозилирование Fc-домена иммуноглобулина может быть модифицировано общепринятыми способами, такими как химические способы, ферментативные способы и способы генной инженерии с использованием микроорганизмов. Кроме того, вариант Fc-домена может иметь смешанную форму из соответствующих Fc-областей иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgE, IgD и IgM. Кроме того, Вариант Fc-домена может иметь форму, в которой некоторые аминокислоты Fc-домена заменены другими аминокислотами. Один из вариантов осуществления варианта Fc-домена может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12.

Слитый белок может иметь структуру, в которой с использованием Fc-домена в качестве линкера (или носителя) белок CD80 и белок IL-2 или белок IL-2 и белок CD80 связаны с N-концом и C-концом линкера или носителя, соответственно. Связывание между N-концом или C-концом Fc-домена и CD-80 или IL-2 необязательно может быть осуществлено посредством линкерного пептида.

В частности, слитый белок может иметь следующую структурную формулу (I) или (II):

N'-X-[линкер (1)]_n-Fc-домен-[линкер (2)]_m-Y-C' (I)

N'-Y-[линкер (1)]_n-Fc-домен-[линкер (2)]_m-X-C' (II)

Здесь, в структурных формулах (I) и (II),

N′ представляет собой N-конец слитого белка,

C′ представляет собой C-конец слитого белка,

X представляет собой белок CD80,

Y представляет собой белок IL-2,

линкеры (1) и (2) представляют собой пептидные линкеры, и

каждый из n и m независимо равен 0 или 1.

Предпочтительно, слитый может иметь структурную формулу (I). Белок IL-2 является таким, как описано выше. Кроме того, белок CD80 является таким, как описано выше. Согласно одному из вариантов осуществления белок IL-2 может представлять собой вариант IL-2 с от одной до пяти аминокислотных замен по сравнению с IL-2 дикого типа. Белок CD80 может представлять собой фрагмент, полученный путем укорочения на вплоть до приблизительно 34 последовательно расположенных аминокислотных остатков с N-конца или C-конца CD80 дикого типа. Альтернативно белок CD может представлять собой внеклеточный иммуноглобулин-подобный домен, обладающий активностью связывания с рецепторами T-клеточной поверхности CTLA-4 и CD28.

В частности, слитый белок может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. Согласно другому варианту осуществления, слитый белок включает полипептид, обладающий идентичностью последовательности 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 9, 26, 28 или 30. Здесь, идентичность представляет собой, например, процентную гомологию, и она может быть определена посредством программного обеспечения для сравнения гомологии, такого как программное обеспечение BlastN Национального центра биотехнологической информации (NCBI).

Между белком CD80 и Fc-доменом может быть включен пептидный линкер (1). Пептидный линкер (1) может состоять из 5-80 последовательно расположенных аминокислот, 20-60 последовательно расположенных аминокислот, 25-50 последовательно расположенных аминокислот или 30-40 последовательно расположенных аминокислот. В одном из вариантов осуществления пептидный линкер (1) может состоять из 30 аминокислот. Кроме того, пептидный линкер (1) может содержать по меньшей мере один остаток цистеина. В частности, пептидный линкер (1) может содержать один, два или три остатка цистеина. Кроме того, пептидный линкер (1) может происходить из шарнирной области иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления пептидный линкер (1) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 3.

Пептидный линкер (2) может состоять из 1-50 последовательно расположенных аминокислот, 3-30 последовательно расположенных аминокислот, или 5-15 последовательно расположенных аминокислот. В одном из вариантов осуществления пептидный линкер (2) может представлять собой (G4S)_n (где n представляет собой целое число от 1 до 10). Здесь, в (G4S)_n n может составлять 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном из вариантов осуществления пептидный линкер (2) может представлять собой пептидный линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается димер, полученный путем связывания двух слитых белков, каждый из которых содержит белок IL-2 и белок CD80. Слитый белок, содержащий IL-2 или его вариант и CD80 или его фрагмент, является таким, как описано выше.

Здесь, связывание между слитыми белками, составляющими димер, может быть достигнуто посредством, но не ограничиваясь ими, дисульфидной связи, образованной остатками цистеина, присутствующими в линкере. Слитые белки, составляющие димер, могут представлять собой одинаковые или отличающиеся друг от друга слитые белки. Предпочтительно, димер может представлять собой гомодимер. Вариантом осуществления слитого белка, составляющего димер, может быть белок, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9.

Фармацевтическое применение

Фармацевтическая композиция для лечения или предупреждения злокачественной опухоли по настоящему изобретению, композиция, содержащая в качестве активного ингредиента слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, и противораковое средство, может повышать эффективность лечения и/или предупреждения злокачественной опухоли.

Слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, или димерный слитый белок, где два слитых белка являются связанными, является таким, как описано выше.

Злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака желудка, рака печени, рака легкого, рака ободочной и прямой кишки, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака шейки матки, рака щитовидной железы, рака гортани, острого миелоидного лейкоза, опухоли головного мозга, нейробластомы, ретинобластомы, рака головы и шеи, рака слюнных желез и лимфомы.

Предпочтительная доза фармацевтической композиции варьируется в зависимости от состояния и массы тела пациента, тяжести заболевания, формы лекарственного средства, пути и длительности введения, и она может быть надлежащим образом выбрана специалистами в данной области. В фармацевтической композиции для лечения или предупреждения злокачественной опухоли по настоящему изобретению активный ингредиент может содержаться в любом количестве (эффективное количество) в зависимости от применения, дозированной формы, цели смешивания и т.п. при условии, что активный ингредиент может демонстрировать противораковую активность. Его обычное эффективное количество будет определяться диапазоном от 0,001% до 20,0% по массе в расчете на общую массу композиции. Здесь, термин "эффективное количество" относится к количеству активного ингредиента, способному индуцировать противораковый эффект. Такое эффективное количество может быть экспериментально определено на основе общей информации, известной специалистам в данной области.

Как используют в рамках изобретения, термин "лечение" может использоваться для обозначения как терапевтического, так и профилактического лечения. Здесь, "профилактика" может использоваться для указания на то, что патологическое состояние или заболевание индивидуума облегчается или смягчается. В одном из вариантов осуществления термин "лечение" включает как применение, так и любую форму введения, для лечения заболевания у млекопитающего, в том числе человека. Кроме того, термин включает ингибирование или замедление заболевания или прогрессирования заболевания; и включает значения восстановления или возобновления сниженной или утраченной функции, так чтобы происходило частичное или полное облегчение заболевания; стимуляции неэффективных процессов или облегчения серьезного заболевания.

Как используют в рамках изобретения, термин "эффективность" относится к способности, которая может быть определена посредством одного или нескольких параметров, например, выживаемости или выживаемости без прогрессирования на протяжении определенного периода времени, такого как один год, пять лет или десять лет. Кроме того, параметр может включать ингибирование увеличения размера по меньшей мере одной опухоли у индивидуума.

Также на эффективность могут влиять фармакокинетические параметры, такие как биодоступность и лежащие в ее основе параметры, такие как скорость выведения. Таким образом, "улучшенная эффективность" (например, повышение эффективности) может быть следствием улучшения фармакокинетических параметров и повышения эффективности, которые могут быть измерены путем сравнения скорости выведения и роста опухоли у тестируемых животных или людей, или путем сравнения параметров, таких как выживаемость, рецидив или выживаемость без прогрессирования.

Как используют в рамках изобретения, термин "терапевтически эффективное количество" или "фармацевтически эффективное количество" относится к количеству соединения или композиции, эффективному для предупреждения или лечения рассматриваемого заболевания, которое является достаточным для лечения заболевания с приемлемым соотношением польза/риск, применимым для медицинского лечения, и не вызывает побочных эффектов. Уровень эффективного количества может быть определен в зависимости от факторов, включающих состояние здоровья пациента, тип и тяжесть заболевания, активность лекарственного средства, чувствительность пациента к лекарственному средству, способ введения, время введения, путь введения и скорость экскреции, длительность лечения, состав или одновременно применяемые лекарственные средства, и другие факторы, хорошо известные в области медицины. В одном из вариантов осуществления терапевтически эффективное количество означает количество лекарственного средства, эффективное для лечения злокачественной опухоли.

Здесь, фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой любой носитель при условии, что носитель является нетоксичным веществом, пригодным для доставки пациенту. В качестве носителя могут присутствовать дистиллированная вода, спирт, жир, воск и инертное твердое вещество. Также в фармацевтической композиции может содержаться фармацевтически приемлемый адъювант (буфер, диспергирующий агент).

В частности, путем включения фармацевтически приемлемого носителя в дополнение к активному ингредиенту, фармацевтическая композиция может быть получена в виде парентерального состава в зависимости от ее пути введения с использованием общепринятых способов, известных в данной области. Здесь, термин "фармацевтически приемлемый" означает, что носитель не обладает более высокой токсичностью, чем может выдержать индивидуум, которому проводят введение (назначение), при этом не ингибируя активность активного ингредиента.

Когда фармацевтическую композицию получают в виде парентерального состава, его можно изготавливать в виде препаратов в форме инъекций, трансдермальных пластырей, назальных средств для ингаляции или суппозиториев с подходящими носителями в соответствии со способами, известными в данной области. В случае изготовления в форме инъекций, в качестве подходящего носителя можно использовать стерильную воду, этанол, многоатомный спирт, такой как глицерин или пропиленгликоль, или их смесь; и предпочтительно можно использовать изотонический раствор, такой как раствор Рингера, фосфатно-солевой буфер (PBS), содержащий триэтаноламин или стерильную воду для инъекций, и 5% декстроза, и т.п. Состав фармацевтических композиций известен в данной области, и, в частности, может быть упомянут Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995) и т. п. Этот документ считается частью настоящего описания.

Предпочтительная доза фармацевтической композиции может находиться в диапазоне от 0,01 мкг/кг до 10 г/кг, или от 0,01 мг/кг до 1 г/кг в сутки в зависимости от состояния пациента, массы тела, пола, возраста, тяжести состояния пациента и пути введения. Дозу можно вводить один раз в сутки или можно разделять на несколько раз в сутки. Такая доза не должна считаться ограничивающей объем настоящего изобретения ни в каком из аспектов.

Индивидуумами, у которых фармацевтическую композицию можно применять (назначать), являются млекопитающие и люди, особенно предпочтительно люди. В дополнение к активному ингредиенту, фармацевтическая композиция, описанная в настоящей заявке, может дополнительно содержать любое соединение или природный экстракт, безопасность которого уже подтверждена и о котором известно, что он обладает противораковой активностью или терапевтическим эффектом в отношении инфекционного заболевания, чтобы таким образом усилить или закрепить противораковую активность.

Применение композиций, содержащий димерный слитый белок и противораковое средство

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается применение композиции для комбинированного введения, содержащей димерный слитый белок, содержащий белок CD80 или его фрагмент и белок IL-2 или его вариант, и противораковое средство для лечения онкологического заболевания.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается применение композиции для комбинированного введения, содержащей димерный слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, и противораковое средство для усиления терапевтического эффекта онкологического заболевания.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается применение димерного слитого белка, содержащего белок CD80 или его фрагмент и белок IL-2 или его вариант, для поддерживающей терапии. В данном случае может быть включено противораковое средство.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается способ лечения онкологического заболевания и/или способ повышения терапевтического эффекта, включающий стадию введения индивидууму слитого белка, содержащего белок IL-2 и белок CD80 или димерный слитый белок, в котором два слитых белка связаны друг с другом, и противораковое средство.

Индивидуумом может быть индивидуум, страдающий от злокачественной опухоли. Кроме того, индивидуумом может быть млекопитающее, предпочтительно человек. Слитый белок, содержащий белок IL-2 и белок CD80, или димерный слитый белок, в котором два слитых белка связаны друг с другом, являются такими, как описано выше.

Путь введения, доза и частота введения слитого белка или димерного слитого белка могут варьироваться в зависимости от состояния пациента и наличия или отсутствия побочных эффектов, и, таким образом, слитый белок или димерный слитый белок можно вводить индивидууму различными путями и в различных количествах. Оптимальный способ введения, доза и частота введения могут быть выбраны из соответствующего диапазона специалистами в данной области. Кроме того, слитый белок или димерный слитый белок можно вводить в комбинации с другими лекарственными средствами (например, описанное выше противораковое средство) или физиологически активными веществами, чей терапевтический эффект известен в отношении заболевания, подвергаемого лечения, или они могут быть составлены в форме комбинированных препаратов с другими лекарственными средствами.

Вследствие активности IL-2, слитый белок в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения может активировать иммунные клетки, такие как натуральные киллеры. Таким образом, слитый белок может эффективно использоваться против онкологического заболевания. В частности, было идентифицировано, что, по сравнению с диким типом, вариант IL-2 с от двух до пяти аминокислотных замен, в частности, вариант IL-2, который содержит аминокислотные замены в двух, трех, четырех или пяти положениях среди положений, выбранных из группы, состоящей из R38A, F42A, Y45A, E61R и L72G в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10, обладает низкой связывающей способностью в отношении альфа-цепи рецептора IL-2 и, таким образом, демонстрирует улучшенные характеристики в отношении фармакологических побочных эффектов общепринятого IL-2. Таким образом, такой вариант IL-2, когда он используется отдельно или в форме слитого белка, может снижать встречаемость синдрома сосудистой (или капиллярной) (VLS), что является общеизвестной проблемой для IL-2.

Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активных ингредиентов белок IL-2 или его вариант, белок CD80 или его вариант, и противораковое средство

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается композиция для лечения злокачественной опухоли, содержащая в качестве активных ингредиентов IL-2 или его вариант, белок CD80 или его вариант и противораковое средство.

В данном случае IL-2 или его вариант является таким, как описано выше. Кроме того, IL-2 или его вариант может дополнительно включать Fc-область иммуноглобулина. В данном случае IL-2 или его вариант может связываться с N-концом или C-концом Fc-области. В одном из вариантов осуществления IL-2 или его вариант может связываться с C-концом Fc-области. Кроме того, как описано выше, вариант IL-2 может представлять собой форму, в которой две аминокислоты заменены, или форму, в которой три аминокислоты заменены. В данном случае IL-2 или его вариант может быть прямо связан с Fc-областью, а может быть связан через пептидный линкер. В данном случае пептидный линкер может представлять собой любой из линкеров, описанных выше.

Кроме того, белок CD80 или его вариант являются такими, как описано выше. Кроме того, CD80 или его вариант могут дополнительно включать Fc-область иммуноглобулина. В данном случае, CD80 или его вариант может связываться с N-концом или C-концом Fc-области. В данном случае, CD80 может быть в форме фрагмента и он может представлять собой фрагмент CD80, включающий V-домен. В одном из вариантов осуществления CD80 или вариант может быть связан с N-концом Fc-области. Кроме того, вариант CD80 может представлять собой вариант в различных формах при условии, что активность сохраняется.

Кроме того, противораковое средство может представлять собой средство, выбранное из различных типов противораковых средств, описанных выше.

Способ осуществления изобретения

Далее в настоящем описании, настоящее изобретение описано более подробно с помощью следующих примеров. Однако следующие примеры приведены только для иллюстрации настоящего изобретения и объем настоящего изобретения не ограничивается ими.

I. Получение слитого белка

Пример получения 1. Получение варианта hCD80-Fc-IL-2 (2M): GI101

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент CD80 человека, Fc-домен и вариант IL-2, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 8), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6), имеющий две аминокислотные замены, в указанном порядке, с N-конца. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 9. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101".

Очистку проводили с использованием хроматографии, включающей смолу с белком A MabSelect SuRe. Слитый белок связывался с ней в условиях 25 мМ Tris, 25 мМ NaCl, pH 7,4. Затем проводили элюирование посредством 100 мМ NaCl, 100 мМ уксусной кислоты, pH 3. 20% 1 M Tris-HCl при pH 9 помещали в пробирку для сбора, а затем собирали слитый белок. Для собранного слитого белка буфер заменяли в ходе диализа на буфер PBS на 16 часов.

После этого определяли поглощение при длине волны 280 нм с течением времени посредством эксклюзионной хроматографии с использованием колонки TSKgel G3000SWXL (TOSOH Bioscience) до получения высококонцентрированного слитого белка. Здесь, выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR), и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг.6). Было идентифицировано, что слитый белок содержался в концентрации 2,78 мг/мл, когда детекцию проводили посредством NanoDrop (фиг.7). Кроме того, результаты, полученные посредством анализа с использованием эксклюзионной хроматографии, приведены на фиг.8.

Пример получения 2. Получение варианта mCD80-Fc-IL-2 (2M): mGI101

Для получения слитого белка, содержащего CD80 мыши, Fc-домен и вариант IL-2, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 14), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), mCD80 (SEQ ID NO: 13), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) с двумя аминокислотными заменами, в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 15. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "mGI101".

Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR) и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг. 9). Было обнаружено, что слитый белок содержался в концентрации 1,95 мг/мл при детекции по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Пример получения 3. Получение hCD80-Fc: GI101C1

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент CD80 человека и Fc-домен, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 16), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3) и Fc-домен (SEQ ID NO: 4). Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 17. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101C1".

Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR) и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг. 10). Было выявлено, что слитый белок содержался в концентрации 3,61 мг/мл при детекции по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Пример получения 4. Получение варианта Fc-IL-2 (2M): GI101C2

Для получения слитого белка, содержащего Fc-домен и вариант IL-2, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 18), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (2M) (R38A, F42A) (SEQ ID NO: 6) с двумя аминокислотными заменами, в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 19. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101C2".

Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR) и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг. 11). Было обнаружено, что слитый белок содержался в концентрации 4,79 мг/мл при детекции по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Пример получения 5. Получение mCD80-Fc: mGI101C1

Для получения слитого белка, содержащего CD80 мыши и Fc-домен, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 20) которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), CD80 мыши (SEQ ID NO: 13), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3) и Fc-домен (SEQ ID NO: 4), в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 21. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "mGI101C1".

Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR) и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг. 12). Было выявлено, что слитый белок содержался в концентрации 2,49 мг/мл при детекции по поглощению при 280 нм с использованием NanoDrop.

Слитые белки, полученные согласно примерам получения 1-5, обобщенно представлены в таблице 1 ниже.

[Таблица 1]

Продукт N-конец Линкер C-конец Пример получения 1 (GI101) Фрагмент hCD80 Fc-домен hIL-2m Пример получения 2 (mGI101) Фрагмент mCD80 Fc-домен hIL-2m Пример получения 3 (GI101C1) Фрагмент CD80 Fc-домен - Пример получения 4 (GI101C2) - Fc-домен IL-2m Пример получения 5 (mGI101C1) Фрагмент mCD80 Fc-домен -

Пример получения 6. Получение CD80-Fc-IL-2: GI101w

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент CD80 человека, Fc-домен и IL-2 человека, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 31), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и зрелый IL-2 человека (SEQ ID NO: 10), в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 32. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI101w". Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1.

Пример получения 7. Получение варианта hCD80-Fc-IL-2 (3M): GI102-M45

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент CD80 человека, Fc-домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A и Y45A) (GI102-M45) с тремя аминокислотными заменами, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 25), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 22), в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 26. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI102-M45". Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR) и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг. 13).

Пример получения 8. Получение варианта hCD80-Fc-IL-2 (3M): GI102-M61

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент CD80 человека, Fc-домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A и E61R) (GI102-M61) с тремя аминокислотными заменами, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 27), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 23), в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 28. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI102-M61".

Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR) и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг. 14).

Пример получения 9. Получение hCD80-Fc-IL-3M: GI102-M72

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент CD80 человека, Fc-домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A и L72G) (GI102-M72) с тремя аминокислотными заменами, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 29), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент CD80 (SEQ ID NO: 2), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 24), в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 30. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "GI102-M72".

Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1. Выделенный и очищенный слитый белок подвергали SDS-PAGE в условиях с восстановлением (R) или без восстановления (NR) и окрашивали кумасси синим для проверки его чистоты (фиг. 15).

Пример получения 10. Получение mCD80-Fc-IL-3M: mGI102-M61

Для получения слитого белка, содержащего фрагмент CD80 мыши, Fc-домен и вариант IL-2 (3M) (R38A, F42A и E61R) (GI102-M61) с тремя аминокислотными заменами, синтезировали полинуклеотид с использованием услуги Invitrogen GeneArt Gene Synthesis от ThermoFisher Scientific. В частности, полинуклеотид содержал нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 33), которая кодирует слитый белок, который содержит сигнальный пептид (SEQ ID NO: 1), фрагмент mCD80 (SEQ ID NO: 13), шарнирную область Ig (SEQ ID NO: 3), Fc-домен (SEQ ID NO: 4), линкер (SEQ ID NO: 5) и вариант IL-2 (SEQ ID NO: 23), в указанном порядке, на N-конце. Полинуклеотид встраивали в вектор pcDNA3_4. Затем вектор вводили в клетки CHO (Expi-CHO^TM) для экспрессии слитого белка SEQ ID NO: 34. После введения вектора проводили культивирование в течение 7 суток в условиях 37°C, 125 об/мин и 8% концентрации CO₂. Затем культуру собирали и из нее очищали слитый белок. Очищенный слитый белок был обозначен как "mGI102-M61".

Очистку и сбор слитого белка проводили аналогично примеру получения 1.

II. Идентификация аффинности связывания между слитым белком и его лигандом

Для идентификации аффинности связывания между слитым белком и его лигандом измеряли аффинность связывания с использованием Octet RED 384.

Экспериментальный пример 1. Идентификация аффинности связывания между hCTLA-4 и GI101

Биосенсор AR2G (Amine Reactive 2^nd gen, ForteBio, каталожный номер: 18-5092) предварительно гидратировали посредством 200 мкл дистиллированной воды 96-луночном микропланшете (GreinerBio-one, каталожный номер: 655209). Лиганд (CTLA-4, CTLA-4/CD152 человека, His-метка, Sino Biological, каталожный номер: 11159-H08H), подлежащий присоединению к биосенсору AR2G, разбавляли 10 мМ ацетатным буфером (pH 5, AR2G Reagent Kit, ForteBio, каталожный номер: 18-5095) до концентрации 5 мкг/мл. Кроме того, GI101, подлежащий связыванию с лигандом, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований AR2G (AR2G Reagent Kit, ForteBio, каталожный номер: 18-5095) до концентрации 1000 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ или 62,5 нМ. Активирующий буфер получали путем смешения 20 мМ EDC и 10 мМ s-NHS (AR2G Reagent Kit, ForteBio, каталожный номер: 18-5095) в дистиллированной воде. 80 мкл каждого реагента помещали в 384-луночный микропланшет (GreinerBio-one, каталожный номер: 781209) и запускали программу.

В результате, была измерена аффинность связывания между hCTLA-4 и GI101, как проиллюстрировано на фиг.16.

Экспериментальный пример 2. Идентификация аффинности связывания между hPD-L1/GI101 и hPD-L1/PD-1

Ni-NTA (Nickel charged Tris-NTA, Ni-NTA Biosensors, ForteBio, 18-5101) предварительно гидратировали посредством 200 мкл 1X буфера для кинетических исследований Ni-NTA (10X Kinetics buffer, ForteBio, 18-1042) в 96-луночном микроплашнете. Лиганд (белок PD-L1/B7-H1 человека, His-метка, Sino biological, каталожный номер: 10084-H08H), подлежащий связыванию с биосенсорами Ni-NTA, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований Ni-NTA до концентрации 5 мкг/мл. GI101, подлежащий присоединению к лиганду, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований Ni-NTA в концентрации 1000 нМ, 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ или 62,5 нМ. Кроме того, PD-1/PDCD1 человека (PD-1/PDCD1 человека, Fc-метка, Sino Biological, каталожный номер: 10377-H02H), подлежащий присоединению к лиганду, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований Ni-NTA до концентрации 2000 нМ, 1000 нМ, 500 нМ, 250 нМ или 125 нМ. Затем 80 мкл каждого реагента помещали в 384-луночный микропланшет и запускали программу.

В результате, была измерена аффинность связывания между hPD-L1 и GI101, как проиллюстрировано на фиг.17. Кроме того, была измерена аффинность связывания между hPD-L1 и hPD-1, как проиллюстрировано на фиг.18.

Экспериментальный пример 3. Идентификация аффинности связывания между mCTLA-4 и mGI101

Аффинность связывания между mCTLA-4 и mGI101 определяли аналогично экспериментальному примеру 1. Здесь, использованное оборудование является следующим: биосенсор: AR2G, лиганд: mCTLA-4 (рекомбинантная химера CTLA-4 Fc мыши, R&D Systems, каталожный номер: 434-CT-200), анализируемое соединение: mGI101 (500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 62,5 нМ, 31,3 нМ).

В результате была измерена аффинность связывания между mCTLA-4 и mGI101, как проиллюстрировано на фиг.19.

Экспериментальный пример 4. Идентификация аффинности связывания между mPD-L1 и mGI101

Аффинность связывания между mPD-L1 и mGI101 идентифицировали аналогично тому, как в экспериментальном примере 1. Здесь, использованное оборудование является следующим. Биосенсор: AR2G, лиганд: mPD-L1 (рекомбинантная химера B7-H1/PD-L1 Fc мыши, R&D Systems, каталожный номер: 434-CT-200), анализируемое соединение: mGI101 (500 нМ, 250 нМ, 125 нМ, 62,5 нМ, 31,3 нМ).

В результате была измерена аффинность связывания между mPD-L1 и mGI101, как проиллюстрировано на фиг.20.

Экспериментальный пример 5. Идентификация аффинности связывания GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v) с CTLA-4

Измерение кинетики связывания проводили с использованием устройства Octet RED 384 (ForteBio, Pall Life Science) при встряхивании при 30°C и 1000 об/мин. Способность к связыванию CTLA-4 измеряли с использованием биосенсорного чипа Amine Reactive 2 generation (AR2G), и способность к связыванию PD-L1 измеряли с использованием биосенсорного чипа Nickel charged Tris-NTA (Ni-NTA). Биосенсорный чип AR2G активировали посредством комбинации 400 мМ EDC и 100 мМ сульфо-NHS. Затем CTLA-4 человека-His-метку (Sino Biological, каталожный номер: 11159-H08H) разбавляли 10 мМ ацетатным буфером (pH 5) до 5 мкг/мл, и наносили на биосенсорный чип AR2G в течение 300 секунд и фиксировали.

Затем измеряли связывание CTLA-4 с GI-101 (hCD80-Fc-hIL-2v), GI-101C1 (hCD80-Fc), ипилимумабом (Bristol-Myers Squibb) и GI-101C2 (Fc-hIL-2v) в различных концентрациях в течение 300 секунд, а также измеряли их диссоциацию в течение 300 секунд. Анализ кинетики связывания проводили с использованием программного обеспечения Octet Data Analysis HT software ver. 10, предоставленного Pall Corporation. Результаты проиллюстрированы на фиг.21.

Экспериментальный пример 6. Идентификация аффинности связывания между IL-2Rα или IL-2Rβ и GI101

Способность к связыванию IL-2Rα измеряли с использованием биосенсора AR2G, и способность к связыванию IL-2Rβ измеряли с использованием биосенсоров Ni-NTA (Nickel charged Tris-NTA, Ni-NTA Biosensors, ForteBio, 18-5101).

Лиганд (IL-2Rα-His-метка, Acro, каталожный номер: ILA-H52H9), подлежащий присоединению к биосенсору AR2G, разбавляли 10 мМ ацетатным буфером (pH 5, AR2G Reagent Kit, ForteBio, каталожный номер: 18-5095) до концентрации 5 мкг/мл. Биосенсор AR2G активировали буфером, полученном путем смешения 400 мМ EDC и 100 мМ сульфо-NHS, а затем разбавленный лиганд наносили на биосенсор AR2G на 300 секунд и фиксировали.

Между тем, лиганд (IL-2Rβ-His Tag, Acro, каталожный номер: CD2-H5221), подлежащий связыванию с биосенсором Ni-NTA, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований Ni-NTA до концентрации 5 мкг/мл. Разбавленный лиганд наносили на биосенсор Ni-NTA на 600 секунд и фиксировали.

После этого наносили GI101, GI101w или Пролейкин (Novartis, hIL-2) в различных концентрациях для связывания с лигандом на 300 секунд. Затем определяли их связывание, а также определяли их диссоциацию в течение 300 секунд. Анализ кинетики связывания проводили с использованием программного обеспечения Octet Data Analysis HT software ver. 10, предоставленного Pall Corporation. Результаты проиллюстрированы на фиг.22-24.

В результате было идентифицировано, что GI101 обладает низкой способностью к связыванию с рецептором IL-2, IL-2Rα, и высокой способностью к связыванию IL-2Rβ, по сравнению с GI101w и Пролейкином.

Экспериментальный пример 7. Измерение аффинности связывания между слитым белком и лигандом

Для идентификации аффинности связывания между слитым белком и его лигандом проводили измерение аффинности связывания с использованием Octet RED 384.

Экспериментальный пример 7.1. Идентификация аффинности связывания между альфа-рецептором IL-2 и GI101-M45, GI101-M61 или GI101-M72

Биосенсор AR2G (Amine Reactive 2nd gen, ForteBio, каталожный номер: 18-5092) предварительно гидратировали посредством 200 мкл дистиллированной воды (DW) в 96-луночном микропланшете (GreinerBio-one, каталожный номер: 655209). Лиганд (белок IL-2R альфа человека, His-метка, Acro, ILA-H52H9), подлежащий связыванию с биосенсором, разбавляли 10 мМ ацетатным буфером (pH 5) (AR2G Reagent Kit, ForteBio, каталожный номер: 18-5095) до концентрации 5 мкг/мл. Анализируемое соединение (GI101-M45, GI101-M61, GI101-M72), подлежащее присоединению к лиганду, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований AR2G (AR2G Reagent Kit, ForteBio, каталожный номер: 18-5095) до 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ и 62,5 нМ, соответственно. Активирующий буфер получали путем смешения 20 мМ EDC и 10 мМ s-NHS (AR2G Reagent Kit, ForteBio, каталожный номер: 18-5095) в DW. 80 мкл каждого реагента помещали в 384-луночный микропланшет (GreinerBio-one, каталожный номер: 781209) и запускали программу.

В результате, аффинность связывания между рецептором IL-2 альфа и GI101-M45 проиллюстрирована на фиг.25. Кроме того, аффинность связывания между рецептором IL-2 альфа и GI101-M61 проиллюстрирована на фиг.26, и аффинность связывания между рецептором IL-2 альфа и GI101-M72 проиллюстрирована на фиг.27.

Экспериментальный пример 7.2. Идентификация аффинности связывания GI102-M45, GI102-M61 и GI102-M72 с IL-2Rβ

Биосенсоры Ni-NTA предварительно гидратировали посредством 200 мкл 1X буфера для кинетических исследований Ni-NTA (10X буфер для кинетических исследований, ForteBio, 18-1042) в 96-луночном микропланшете. Лиганд (белок IL-2R бета человека, His-метка, Acro, CD2-H5221), подлежащий присоединению к биосенсору, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований Ni-NTA до концентрации 2 мкг/мл. GI102-M45, GI102-M61 или GI102-M72, подлежащие присоединению к лиганду, разбавляли 1X буфером для кинетических исследований Ni-NTA до концентрации 500 нМ, 250 нМ, 125 нМ или 62,5 нМ. 80 мкл каждого реагента помещали в 384-луночный микропланшет и запускали программу.

В результате, была измерена аффинность связывания между IL-2Rβ и GI102-M45, как проиллюстрировано на фиг.28, и аффинность связывания между IL-2Rβ и GI102-M61 была измерена, как проиллюстрировано на фиг.29. Кроме того, была измерена аффинность связывания между IL-2Rβ и GI102-M72, как проиллюстрировано на фиг.30.

III. Идентификация иммунной активности слитого белка

Экспериментальный пример 8. Идентификация продукции IFN-γ, вызванной слитым белком

Экспериментальный пример 8.1. Культивирование PBMC, меченных CFSE

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от человека, метили сукцинимидильным сложным эфиром карбоксифлуоресцеина (CFSE) путем реакции с 1 мкМ красителем CellTrace CFSE при 37°C в течение 20 минут. CFSE, не связанный с клетками, удаляли путем реакции в течение 5 минут с культуральной средой, имеющей 5-кратный объем реакционного раствора для окрашивания, а затем центрифугирования при 1300 об/мин в течение 5 минут. CFSE-меченные PBMC ресуспендировали в культуральной среде (среда RPMI1640, содержавшая 10% эмбриональную телячью сыворотку (FBS), 10 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина, 1 мМ пируват натрия, 55 мкМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ неосновные аминокислоты и 2 мМ L-глутамин), а затем добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве 1×10⁵ клеток на лунку. Проводили обработку посредством 5 мкг/мл PHA (лектин из Phaseolus Vulgaris, красная фасоль, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США, каталожный номер № L1668-5MG), и GI101, GI101C1, GI101C2 или IL-2 (альдеслейкин; рекомбинантный IL-2 человека, Novartis) и проводили инкубацию в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 6 суток.

Здесь, обработку GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 проводили в концентрации 1 нМ, 10 нМ или 100 нМ. Клетки анализировали посредством FACS и определяли IFN-γ человека, присутствующий в культуральной среде, с использованием набора для ELISA (Biolegend, San Diego, CA, США, каталожный номер № 430103).

Экспериментальный пример 8.2. Анализ FACS

Клеточные осадки, полученные путем удаления супернатанта, промывали буфером FACS (3% эмбриональная телячья сыворотка, 10 мМ EDTA, 1 M HEPES, 100 единиц/мл пенициллина, стрептомицина, 1 мМ пируват натрия), а затем подвергали реакции с блокатором Fc (Biolegend, каталожный номер № 422302) при 4°C в течение 5 минут. Затем проводили обработку Ab против CD3 с APC (Biolegend, каталожный номер № 300412) и Ab против CD8a с PE (Biolegend, каталожный номер № 300908) и реакции позволяли протекать при 4°C в течение 20 минут. Затем полученный материал промывали буфером для FACS. Клеточные осадки ресуспендировали в буфере для FACS, а затем анализировали с использованием BD LSR Fortessa (BD biosciences, San Diego, CA, США) и программного обеспечения FlowJo.

Экспериментальный пример 8.3. ELISA для IFN-γ человека

Количество IFN-γ, секретируемое в супернатант каждого образца, в котором проводили культивирование клеток, определяли с использованием набора для ELISA для IFN-γ человека (Biolegend, каталожный номер № 430103). В кратком изложении, в планшет для ELISA добавляли антитела против IFN-γ человека и реакции позволяли протекать в течение ночи при 4°C, так чтобы эти антитела покрывали его. Затем проводили блокирование при комнатной температуре в течение 1 часа посредством раствора PBS, к которому был добавлен 1% BSA. Проводили промывание промывочным буфером (0,05% Tween-20 в PBS), а затем стандартный раствор и каждый образец надлежащим образом разбавляли и добавляли к нему. Затем реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 2 часов.

После завершения реакции планшет промывали и в него добавляли вторичные антитела (антитела для детекции). Реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 1 часа. Проводили промывание буфером для промывания, а затем добавляли раствор авидин-HRP. Реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 30 минут. В него добавляли раствор субстрата и индуцировали реакцию развития окраски в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут. Наконец, добавляли H₂SO₄ для остановки реакции развития окраски, и измеряли поглощение при 450 нм посредством спектрофотометра для микропланшетов Epoch (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, США) и вычисляли концентрацию.

В результате, было обнаружено, что клетки, обработанные GI101, демонстрировали заметное повышение секреции IFN-γ по сравнению с клетками, обработанными GI101C1, GI101C2 или IL-2 (фиг.31 и 32).

Экспериментальный пример 9. Идентификация эффекта GI101 на пролиферацию CD8+ T-клеток

Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), полученные от человека, метили CFSE путем реакции с 1 мкМ красителем CellTrace CFSE при 37°C в течение 20 минут. CFSE, не связанный с клетками, удаляли путем реакции в течение 5 минут с культуральной средой, имеющей 5-кратный объем реакционного раствора для окрашивания, а затем центрифугирования при 1300 об/мин в течение 5 минут. CFSE-меченные PBMC ресуспендировали в культуральной среде (среда RPMI1640, содержавшая 10% эмбриональную телячью сыворотку, 10 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина, 1 мМ пируват натрия, 55 мкМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ неосновные аминокислоты и 2 мМ L-глутамин), а затем добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве 1×10⁵ клеток на лунку.

После этого проводили обработку 1 мкг/мл антитела против CD3ε (Biolegend, каталожный номер № L1668-5MG) и GI101, GI101C1, GI101C2, или Пролейкина (Novartis), и проводили инкубацию в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 6 суток. Здесь, клетки обрабатывали GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 в концентрации 100 нМ. Инкубированные клетки исследовали в отношении их степени пролиферации путем измерения посредством FACS-анализа с использованием антител APC-TCRαβ и PE-CD8α доли CD8+ T-клеток, которые не были меченными посредством CFSE.

В результате, было обнаружено, что GI101 активировал пролиферацию CD8+ T-клеток in vitro аналогично IL-2 дикого типа Пролейкину (фиг.33 и 34).

Экспериментальный пример 10. Идентификация эффекта GI101 и GI102 на пролиферацию CD8+ T-клеток

PBMC человека приобретали от Allcells (партия № 3014928, CIF). Использовали 1 M краситель CellTrace CFSE, который подвергали реакции с PBMC человека в условиях блокирования светом при комнатной температуре в течение 20 минут. Клетки метили CFSE путем реакции с 1 мкМ красителем CellTrace CFSE при 37°C в течение 20 минут. CFSE, не связанный с клетками, удаляли путем реакции в течение 5 минут с культуральной средой, имевшей 5-кратный объем реакционного раствора для окрашивания, а затем центрифугирования при 1300 об/мин в течение 5 минут. CFSE-меченные PBMC ресуспендировали в культуральной среде (среда RPMI1640, содержавшая 10% эмбриональную телячью сыворотку, 10 мМ HEPES, 100 Е/мл пенициллина/стрептомицина, 1 мМ пируват натрия, 55 мкМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ неосновные аминокислоты и 2 мМ L-глутамин), а затем добавляли в 96-луночный микропланшет в количестве 1×10⁵ клеток на лунку.

После этого CFSE-меченные PBMC подвергали обработке посредством 1 мкг/мл антитела против CD3ε (OKT3, eBioscience, США) и GI101, GI101C1, GI101C2 или Пролейкина (Novartis), и проводили инкубацию в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 7 суток. Здесь, клетки подвергали обработке GI101, GI101C1, GI101C2 и IL-2 в концентрации 10 мкМ.

Инкубированные клетки исследовали в отношении их степени пролиферации путем измерения посредством FACS-анализа с использованием антитела против CD4 человека с PE (BioLegend, США), антитела против CD8 человека с PE/Cy7 (BioLegend, США), и антитела против FoxP3 человека с APC (BioLegend, США), доли CD8+ T-клеток, которые не были мечены посредством CFSE.

В результате, группы обработки GI101, GI102_M61, GI101C2 и Пролейкином демонстрировали значительное повышение доли CD8+ T-клеток по сравнению с контрольной группой (без стимула), группой обработки антителом против CD3 отдельно и группой обработки GI101C1. Кроме того, по сравнению с группой отрицательного контроля (без стимула) и группой обработки антителом против CD3 отдельно, группы обработки GI101, GI101C2 и Пролейкином продемонстрировали значительное повышение пролиферации CD4+/FoxP3+ Treg клеток, в то время как группы обработки GI102 и GI101C1 не продемонстрировали значительного повышения пролиферации CD4+/FoxP3+ Treg-клеток (фиг. 35).

Экспериментальный пример 11. Идентификация эффекта GI101 или GI101w на пролиферацию CD8+ T-клеток и NK-клеток

Мышей C57BL/6 в возрасте 7 недель, приобретенных в Orient Bio (Корея), распределяли на 3 группы, причем каждая из групп включала 3 мыши, и им внутрибрюшинно инъецировали PBS, GI101 или GI101w. Здесь, GI101 и GI101w соответственно получали в количестве 40,5 мкг в 200 мкл PBS, и инъецировали внутрибрюшинно. Через пять суток после инъекции у мышей из каждой группы извлекали селезенку. Из нее выделяли клетки, и определяли общее количество клеток с использованием гемоцитометра. Спленоциты исследовали в отношении соотношений CD8+ T-клеток и NK-клеток в них посредством FACS-анализа с использованием антитела против CD3ε с APC (Biolegend; 145-2C11), антитела против NK1.1 с PE (Biolegend; PK136) и антитела против CD8α с Pacific blue (BD; 53-6.7). Иными словами, вычисляли количества CD8+ T-клеток и NK-клеток, присутствующих в селезенке.

В результате, было идентифицировано, что GI101 активировал пролиферацию CD8+ T-клеток и NK-клеток in vivo по сравнению с GI101w (фиг.36 и 37).

Экспериментальный пример 12. Идентификация эффекта GI101 на функцию T-клеток

Проводили эксперимент с использованием набора для биоанализа блокады CTLA-4 (Promega, каталожный номер № JA4005). В кратком изложении, эксперимент является следующим. Эффекторные клетки с CTLA-4, поддерживаемые в жидком азоте, размораживали на водяной бане при постоянной температуре 37°C в течение 3 минут и 0,8 мл эффекторных клеток с CTLA-4 хорошо перемешивали с 3,2 мл предварительно нагретого буфера для анализа (90% RPMI+10% эмбриональная телячья сыворотка). Затем смесь добавляли в 96-луночный белый планшет для культивирования клеток (SPL, каталожный номер № 30196) в количестве 25 мкл на лунку. Затем добавляли 25 мкл GI101 в различных концентрациях. В качестве отрицательного контроля добавляли 25 мкл буфера для анализа. Затем 96-луночный белый планшет для культивирования клеток накрывали и помещали в условия комнатной температуры до получения клеток aAPC/Raji.

Клетки aAPC/Raji, поддерживаемые в жидком азоте, размораживали на водяной бане при постоянной температуре 37°C в течение 3 минут, и 0,8 мл клеток aAPC/Raji хорошо перемешивали с 3,2 мл предварительно нагретого буфера для анализа. Затем 25 мкл смеси добавляли в каждую лунку планшета и реакции позволяли протекать в инкубаторе с 5% CO₂ при 37°C в течение 16 часов. После завершения реакции полученному материалу позволяли стоять при комнатной температуре в течение 15 минут, а затем к нему добавляли реагент Bio-Glo, следя за тем, чтобы избегать пузырей. В три наружных лунки добавляли реагент Bio-Glo, и эти лунки использовали в качестве пустых образцов для внесения поправки на фоновый сигнал. Реакции позволяли протекать при комнатной температуре в течение 10 минут, а затем определяли люминесцению посредством Cytation 3 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, США). Конечный анализ данных проводили путем вычисления RLU (GI101-фоновый уровень)/RLU (без обработки-фоновый уровень).

В результате, было обнаружено, что GI101, связанный с CTLA-4, экспрессировался на эффекторных T-клетках и активировал функцию T-клеток, а не ингибировал ее (фиг.38 и 39).

Экспериментальный пример 13. Идентификация эффекта mGI101 и mGI102 на иммунные клетки

Мышей C57BL/6 в возрасте 7 недель, приобретенных в Orient Bio (Корея), распределяли на 3 группы, причем каждая из групп включала 3 мыши, и им внутривенно вводили PBS, 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг GI101, или 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг mGI102 (mGI102-M61). На 1, 3, 5, 7 и 14 сутки после инъекции у мышей каждой группы извлекали ткани селезенки. После этого для ткани селезенки вычисляли количества эффекторных CD8+ T-клеток, NK-клеток и Treg-клеток посредством FACS-анализа с использованием соответствующих антител, и вычисляли соотношения эффекторных CD8+ T-клеток и NK-клеток относительно Treg-клеток. Информация, касающаяся антител, использованных в каждом клеточном анализе, является следующей:

Эффекторные CD8+ T-клетки: антитело против CD3ε мыши с PB (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), антитело против CD8α мыши с FITC (BD, # 553031, 53-6.7), антитело против CD44 мыши с PE/Cy7 (Biolegend, # 103030; IM7), антитело против CD122 мыши с APC (Biolegend, # 123214; TM-β1).

NK-клетки: антитело против CD3ε мыши с PB (Biolegend, # 155612; KT3.1.1), антитело против NK-1.1 мыши с PE (Biolegend, # 108708; PK136).

Treg-клетки: антитело против CD3 мыши с FITC (Biolegend, # 100204; 17A2), антитело против CD4 мыши с PB (Biolegend, # 100531; RM4-5), антитело против CD25 мыши с PE (Biolegend, # 102008; PC61), антитело против Foxp3 мыши с APC (Invitrogen, # FJK-16s, 17-5773-82).

В результате, группа, в которой вводили mGI101 или mGI102 (mGI102-M61), продемонстрировала значительное увеличение количеств CD8+ T-клеток и NK-клеток в моменты времени от 3 суток до 14 суток после введения по сравнению с группой введения PBS. Кроме того, было обнаружено, что группа, в которой вводили mGI102, продемонстрировала значительное увеличение долей активированных CD8+ T-клеток/Treg-клеток и NK-клеток/Treg-клеток в моменты времени от 3 суток до 14 суток после введения по сравнению с группой введения PBS (фиг. 40).

IV. Идентификация противоракового эффекта слитого белка

Экспериментальный пример 14. Идентификация эффекта GI101 на ингибирование активности T-клеток злокачественными клетками, экспрессирующими PD-L1 и CTLA-4

Линию злокачественных клеток NCl-H292, экспрессирующих PD-L1 и CTLA-4, культивировали в течение 3 часов в культуральной среде, содержавшей 10 мкг/мл митомицина C (Sigma), а затем митомицин C удаляли путем промывания культуральной средой. После этого, 5×10⁴ клеток обработанной митомицином C линии злокачественных клеток NCl-H292 инкубировали с 1×10⁵ PBMC человека в 96-луночном микропланшете. Здесь, проводили обработку 5 мкг/мл PHA (Sigma) для активации T-клеток. Кроме того, GI101C1 и GI101 в концентрации 50 нМ подвергали реакции с IgG1-Fc (Biolegend) или абатацептом (= Оренсия; Bristol-Myers Squibb) в концентрации 50 нМ в течение 30 минут при 4°C, а затем полученный материал использовали для обработки злокачественных клеток NCl-H292. Через 3 суток супернатант клеточной культуры собирали и количество IFN-γ определяли с использованием набора для ELISA (Biolegend).

В качестве положительного контроля использовали PBMC человека, стимулированные PHA в отсутствии обработанной митомицином C линии злокачественных клеток NCl-H292; и в качестве отрицательного контроля использовали PBMC человека, стимулированные PHA в присутствии обработанной митомицином C линии злокачественных клеток NCl-H292. Экспериментальный способ с использованием набора для ELISA для IFN-γ проводили аналогично экспериментальному примеру 9.3.

В результате, GI101 эффективно активировал иммунный ответ, который ингибировался линией злокачественных клеток, сверхэкспрессирующих PD-L1. Кроме того, было обнаружено, что GI101 ингибировал передачу сигнала CTLA-4, экспрессированного на эффекторных T-клетках (фиг.41 и 42).

Экспериментальный пример 15. Идентификация противоракового эффекта mGI101 у мышей, которым были трансплантированы происходящие из мыши клетки рака ободочной и прямой кишки

Мышей BALB/c (самки, возраст 7 недель), приобретенных в Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение периода 7 суток. Затем, 5×10⁶ клеток линии злокачественных клеток CT-26 (ATCC, США) смешивали с 0,05 мл матрикса MATRIGEL, свободного от фенолового красного (BD), и проводили аллотрансплантацию смеси посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл в правую область спины мышей. Через определенный период времени после трансплантации злокачественных клеток определяли объем опухоли и отбирали особей, которые достигали приблизительно 28 мм³, а затем отобранных мышей равномерно распределяли на группы, исходя из размера опухоли и массы тела, причем каждая группа содержала 10 мышей. После этого с использованием одноразового шприца (31G, 1 мл), hIgG4 вводили в дозе 6 мг/кг в группе отрицательного контроля. Для экспериментальных групп проводили внутривенное введение mGI101 в дозе 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг. После первого введения проводили всего три введения один раз каждые трое суток. Размер опухоли измеряли каждые сутки.

В результате, было обнаружено, что экспериментальная группа, в которой вводили mGI101 в дозе 6 мг/кг и 12 мг/кг, продемонстрировала значительное ингибирование роста опухоли в некоторые моменты времени измерения и в конце теста по сравнению с отрицательным контролем (фиг.43). Кроме того, в результате измерения выживаемости было обнаружено, что экспериментальная группа, в которой вводили mGI101 в дозе 6 мг/кг, продемонстрировала значительное улучшение в некоторые моменты времени измерения и в конце теста по сравнению с отрицательным контролем (фиг.44).

Экспериментальный пример 16. Идентификация противоракового эффекта GI101 у мышей, которым трансплантировали происходящие из мыши клетки рака ободочной и прямой кишки

Экспериментальный пример 16.1. Идентификация эффекта ингибирования опухоли

Мышей BALB/c (самки, возраст 7 недель), приобретенных в Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение периода 7 суток. Затем 5×10⁶ клеток линии злокачественных клеток CT-26 (ATCC, США) суспендировали в 0,1 мл PBS, и проводили аллотрансплантацию суспензию посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл в правую область спины мышей. Через определенный период времени после трансплантации злокачественных клеток определяли объем опухоли и отбирали особей, которые достигали от 50 мм³ до 200 мм³, а затем отобранных мышей равномерно распределяли на группы, исходя из размера опухоли и массы тела, причем каждая группа содержала 10 мышей. После этого в группе отрицательного контроля лекарственное средство не вводили, и в группах положительного контроля с использованием одноразового шприца (31G, 1 мл), внутривенно вводили антитело против PD-1 в дозе 5 мг/кг или антитело против PD-1 в дозе 5 мг/кг и антитело против CTLA-4 в дозе 5 мг/кг. Для экспериментальных групп внутривенно вводили GI101 в дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг. После первого введения проводили всего три введения один раз каждые трое суток. Размер опухоли измеряли каждые сутки.

В результате, у мышей с трансплантированной клеточной линией злокачественной опухоли CT-26 все группы, которым вводили антитело против PD-1, антитело против PD-1 и антитело против CTLA-4 или GI101 в дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг, демонстрировали значительное ингибирование роста опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля. В частности, экспериментальная группа, в которой вводили GI101 в дозе 0,1 мг/кг, продемонстрировала значительный эффект ингибирования опухоли по сравнению с группой введения антитела против PD-1 (*p < 0,05) (фиг. 45).

Экспериментальный пример 16.2. Анализ иммунных клеток в ткани злокачественной опухоли

Мышей в каждой группе экспериментального примера 16.1 умерщвляли, когда объем опухоли достигал в среднем 200 мм³, и собирали ткани злокачественной опухоли. После этого ткани злокачественной опухоли разделяли до уровня единичных клеток для анализа иммунных клеток в них, а затем проводили FACS-анализ иммунных клеток в тканях злокачественной опухоли с использованием приведенных ниже антител: антитело против CD3 мыши (Biolegend, каталожный номер № 100320), антитело против CD4 мыши (Biolegend, каталожный номер № 100526), антитело против CD8 мыши (Biolegend, каталожный номер № 100750), антитело против FoxP3 мыши (eBioscience, каталожный номер 12-5773-82), антитело против CD25 мыши (Biolegend, каталожный номер № 102049), антитело против CD44 мыши (eBioscience, каталожный номер № 61-0441-82), антитело против PD-1 мыши (Biolegend, каталожный номер № 135218), антитело против IFN мыши (Biolegend, каталожный номер № 505832), антитело против CD49b мыши (Biolegend, каталожный номер № 108906), антитело против H2 мыши (Invitrogen, каталожный номер № A15443), антитело против CD11c мыши (Biolegend, каталожный номер № 117343), антитело против CD80 мыши (eBioscience, каталожный номер № 47-4801-82), антитело против CD86 мыши (Biolegend, каталожный номер № 104729), антитело против F4/80 мыши (eBioscience, каталожный номер № 47-4801-82) и антитело против CD206 мыши (eBioscience, каталожный номер № 17-2061-80).

В результате, экспериментальная группа, в которой вводили GI101 в дозе 0,1 мг/кг, продемонстрировала значимое повышение уровня CD8+ T-клеток по сравнению с группой положительного контроля, в которой вводили только антитело против PD-1 в дозе 5 мг/кг (*p<0,05, фиг.46 и 47). Более того, все экспериментальные группы, в которых вводили GI101, продемонстрировали значимо повышенный уровень экспрессии IFN-γ в T-клетках по сравнению с группой отрицательного контроля (*p< 0,05, фиг.46 и 47). Кроме того, экспериментальная группа, в которой вводили GI101 в дозе 0,1 мг/кг, продемонстрировала повышение уровня макрофагов M1 по сравнению с группой отрицательного контроля и группой положительного контроля, в которой вводили только антитело против PD-1 (фиг.48 и 49). Кроме того, все экспериментальные группы, в которых вводили GI101, продемонстрировали повышенный уровень экспрессии CD86 в макрофагах и дендритных клетках (* p < 0,05, фиг.48-51).

Экспериментальный пример 17. Идентификация противоракового эффекта GI101 у мышей, которым трансплантировали происходящие из мыши клетки рака легкого

Экспериментальный пример 17.1. Идентификация эффекта ингибирования опухоли

Мышей BALB/c (самки, возраст 7 недель), приобретенных в Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение периода 7 суток. Затем 5×10⁶ клеток линии злокачественных клеток LL/2 (ATCC, США) суспендировали в 0,1 мл PBS, и проводили аллотрансплантацию суспензии посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл в правую область спины мышей. Через определенный период времени после трансплантации злокачественных клеток определяли объем опухоли и отбирали особей, которые достигали от 50 мм³ до 200 мм³, а затем отобранных мышей равномерно распределяли на группы, исходя из размера опухоли и массы тела, причем каждая группа содержала 10 мышей. После этого в группе отрицательного контроля лекарственное средство не вводили, и в группах положительного контроля с использованием одноразового шприца (31G, 1 мл) внутривенно вводили антитело против PD-1 в дозе 5 мг/кг или антитело против PD-1 в дозе 5 мг/кг и антитело против CTLA-4 в дозе 5 мг/кг. Для экспериментальных групп внутривенно вводили GI101 в дозе 0,1 мг/кг или 1 мг/кг. После первого введения проводили всего три введения один раз каждые трое суток. Размер опухоли измеряли каждые сутки.

В результате, все экспериментальные группы продемонстрировали значимый эффект ингибирования опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля (* p<0,05) (фиг. 52).

Экспериментальный пример 17.2. Анализ иммунных клеток в ткани злокачественной опухоли

Мышей в каждой группе экспериментального примера 17.1 умерщвляли, когда объем опухоли достигал в среднем 200 мм³, и ткани злокачественной опухоли собирали. После этого проводили FACS-анализ аналогично экспериментальному примеру 16.2 для анализа иммунных клеток в тканях злокачественной опухоли.

В результате, экспериментальная группа, в которой вводили GI101 в дозе 0,1 мг/кг, продемонстрировала значимое повышение уровня CD8+ T-клеток по сравнению с группой положительного контроля, в которой вводили только антитело против PD-1 (* p<0,05, фиг.59). Более того, все экспериментальные группы, в которых вводили GI101, продемонстрировали значимо повышенный уровень экспрессии IFN-γ по сравнению с группой отрицательного контроля (*p<0,05, фиг. 59). Кроме того, все экспериментальные группы, в которых вводили GI101, продемонстрировали повышенный уровень экспрессии CD86 в макрофагах и дендритных клетках (* p<0,05, фиг.53-55).

Экспериментальный пример 18. Идентификация противоракового эффекта mGI102-M61 у мышей, которым трансплантировали происходящие из мыши клетки рака ободочной и прямой кишки

Мышей BALB/c (самки, возраст 7 недель), приобретенных в Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение периода 7 суток. Затем 5×10⁶ клеток линии злокачественных клеток CT26 (ATCC, США) смешивали с 0,05 мл матрикса MATRIGEL, свободного от фенолового красного, (BD), и проводили аллотрансплантацию смеси посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл в правую область спины мышей. Через определенный период времени после трансплантации злокачественных клеток определяли объем опухоли и отбирали особей, которые достигали примерно 28 мм³, а затем отобранных мышей равномерно распределяли на группы, исходя из размера опухоли и массы тела, причем каждая группа содержала 10 мышей. После этого с использованием одноразового шприца (31G, 1 мл), hIgG4 вводили в дозе 6 мг/кг в группе отрицательного контроля. Для экспериментальных групп внутривенно вводили mGI102-M61 в дозе 3 мг/кг, 6 мг/кг или 12 мг/кг. После первого введения проводили всего три введения один раз каждые трое суток. Размер опухоли измеряли каждые сутки.

В результате, было идентифицировано, что экспериментальная группа, в которой вводили mGI102-M61 в дозе 12 мг/кг, продемонстрировала значительное ингибирование роста опухоли в те же самые моменты времени измерения и в конце теста, по сравнению с группой отрицательного контроля (фиг. 56). Кроме того, в результате определения выживаемости было идентифицировано, что экспериментальная группа, в которой вводили mGI102-M61 в дозе 12 мг/кг, продемонстрировала значимое улучшение в те же самые моменты времени измерения и в конце теста, по сравнению с группой отрицательного контроля (фиг. 57).

Экспериментальный пример 19. Идентификация противоракового эффекта mGI101 у мышей, которым трансплантировали происходящие из мыши клетки рака ободочной и прямой кишки

Мышей BALB/c (самки, возраст 7 недель), приобретенных от Orient Bio, подвергали акклиматизации в течение периода 7 суток. Затем, 5×10⁶ клеток линии злокачественных клеток CT-26 (ATCC, USA) смешивали с 0,05 мл матрикса MATRIGEL, свободного от фенолового красного, (BD), и проводили аллотрансплантацию смеси посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл в правую область спины мышей. Через определенный период времени после трансплантации злокачественных клеток определяли объем опухоли и отбирали особей, которые достигали приблизительно от 200 мм³ до 250 мм³, а затем отобранных мышей равномерно распределяли на группы, исходя из размера опухоли и массы тела, причем каждая группа содержала 10 мышей.

После этого с использованием одноразового шприца (31G, 1 мл) в группе отрицательного контроля вводили hIgG4 в дозе 4 мг/кг. Для экспериментальных групп mGI101 вводили внутривенно в дозе 1 мг/кг, 4 мг/кг или 6 мг/кг. Кроме того, в качестве контрольных групп были выбраны группы, в которых вводили mCD80 в дозе 4,9 мг/кг или Fc-IL-2v (GI101C2) в дозе 2,8 мг/кг. Кроме того, в качестве контрольной группы была выбрана группа, в которой одновременно вводили mCD80 в дозе 4,9 мг/кг и Fc-IL-2v (GI101C2) в дозе 2,8 мг/кг.

При измерении объема опухоли было идентифицировано, что группа, в которой вводили mGI101 в дозе 6 мг/кг, продемонстрировала значительное ингибирование в те же самые моменты времени измерения и в конце теста по сравнению с отрицательным контролем. Наблюдали превосходное ингибирование роста опухоли по сравнению с группой, в которой вводили комбинацию mCD80 и Fc-IL-2v (GI101C2) (фиг.58 и 59).

В заключение, в тесте ингибирования роста опухоли на мышах BALB/c, которым проводили аллотрансплантацию CT-26, происходящей из мышей BALB/c клеточной линии рака ободочной и прямой кишки, было продемонстрировано, что тестируемое вещество mGI101 имело эффект ингибирования опухоли в этих условиях тестирования по сравнению с соответствующими составами mCD80 и IL-2v отдельно; и было идентифицировано, что mGI101 продемонстрировал превосходную противораковую эффективность по сравнению с группой, в которой вводили комбинацию mCD80 и IL-2v (фиг.58 и 59). В частности, группа, в которой вводили mGI101 в дозе 6 мг/кг, продемонстрировала значительное ингибирование увеличения размера опухоли по сравнению с группой отрицательного контроля и группой, в которой вводили комбинацию mCD80 и Fc-IL2v (GI101C2).

V. Идентификация противоракового эффекта в зависимости от введения комбинации димерного слитого белка и ингибитора иммунной точки контроля

Экспериментальный пример 20. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации GI101 и антитела против PD-1 у мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека

Этот тест был предназначен для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после внутрибрюшинного введения GI101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с Китрудой (пембролизумаб, MSD), которая представляет собой антитело против PD-1, в качестве положительного контрольного вещества в модели опухоли с ксенотрансплантированными клетками MDA-MB-231, которые представляют собой клетки рака молочной железы человека, с использованием модели с гуманизированной мышью, подготовленной путем ксенотрансплантации PBMC человека мышам NSGb2m.

Исходный раствор тестируемого вещества, отрицательного контрольного вещества и положительного контрольного вещества, описанных в таблице 2, разбавляли путем добавления эксципиентов в зависимости от каждой дозы.

[Таблица 2]

- Тестируемое вещество Положительное контрольное вещество Отрицательное контрольное вещество Эксципиент Наименование вещества GI101 Китруда hIgG4 PBS Внешний вид Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Компонент Слитый белок Fc Антитело против PD-1 - - pH 7,5 - - - Условия хранения Хранение в условиях охлаждения (4°C) Хранение в условиях охлаждения (4°C) Хранение в условиях охлаждения (4°C) Хранение в условиях охлаждения (4°C) Предостережения в отношении обращения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения -

Клетки рака молочной железы человека MDA-MB-231 (Homo sapiens, молочной железы/груди человека; происходящие из метастаза: плевральный выпот), приобретали в банке клеточных линий Кореи (Корея) и использовали для тестирования. Среда для культивирования клеток имела состав, как показано в таблице ниже. Эмбриональную телячью сыворотку (FBS, 16000-044, Thermofisher scientific, США), пенициллин-стрептомицин; 10000 единиц/мл пенициллина и 10000 мкг/мл стрептомицина (15140122, Thermofisher scientific, США); и RPMI1640 (A1049101, Thermofisher scientific, США) на 100 мл смешивали и использовали.

[Таблица 3]

Наименование Композиция (мл) FBS 10 Пенициллин-Стрептомицин 1 RPMI1640 89 Общий объем 100

Клетки, подлежащие применению для тестирования, размораживали, помещали во флакон для культивирования клеток и культивировали в инкубаторе при 37°C, с 5% CO₂ (MCO-170M, Panasonic, Япония). Клетки суспендировали с использованием трипсин-EDTA (каталожный номер 25200-072, Thermofisher scientific, США). Суспендированные клетки собирали посредством центрифугирования (125×g, 5 минут) с использованием центрифуги, переносили в новую среду и новую колбу, и пассаж культивировали. Культивированные клетки помещали в пробирку для центрифугирования в день трансплантации клеточной линии, а затем собирали. После этого проводили центрифугирование (125×g, 5 минут) для удаления супернатанта и суспензию клеток (5×10⁶ клеток/0,05 мл) приготавливали с PBS (каталожный номер LB 001-04, Welgene, Корея) и хранили на льду до инокуляции. Самок мышей NSGb2m в возрасте 8 недель (NOD.Cg-B2m^tm1UncPrkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ) приобретали от Joongang Bio (Корея) и использовали для тестирования. Массу тела определяли на следующие сутки после окончания карантина и периода акклиматизации, а затем суспензией клеток PBMC человека (5×10⁶ клеток/0,2 мл), приготовленной для здоровых животных, заполняли одноразовый шприц и вводили ее в хвостовую вену животных. Основные симптомы наблюдали один раз в сутки после трансплантации клеток.

К полученной суспензии клеток MDA-MB-231 добавляли матрикс MATRIGEL, свободный от фенолового красного (0,05 мл, 356237, BD, США) (5×10⁶ клеток/0,05 мл), и раствором заполняли одноразовый шприц, и проводили трансплантацию посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл/животное в правую область спины животных с трансплантированными PBMC человека. Основные симптомы наблюдали один раз в сутки в ходе приживления трансплантата и периода роста после трансплантации клеточной линии.

Через определенный период времени после трансплантации клеток определяли объем опухоли животных для животных без нарушений состояния здоровья, и 32 животных отбирали так, чтобы среднее значение в каждой группе достигало 40-80 мм³. Отобранных животных распределяли всего на 4 группы настолько равномерно, насколько возможно, исходя из объема опухоли и массы тела, причем каждая группа включала 8 животных.

Как показано в таблице 4, были сформированы тестируемые группы. Тестируемое вещество вводили животным с использованием одноразового шприца (31G, 1 мл), и частота введения составляла 2 раза/неделя, проводили всего 4 введения.

[Таблица 4]

Группа Дозировка (мг/кг) Дозируемый объем (мл/кг) Количество животных G1 hIgG4 6 10 8 G2 GI101 6 10 8 G3 Китруда 5 10 8 G7 GI101+Китруда 6+5 10 8

Основные симптомы, такие как внешний вид, поведение и экскременты, наблюдали один раз в сутки в ходе периода наблюдения, и идентифицировали умерших животных. Определение массы тела проводили в день трансплантации клеточной линии, два раза в неделю и в день умерщвления животного. Измерение по большей оси (максимальная длина, L) и меньшей оси (перепендикулярная ширина, W) опухоли проводили с использованием толщиномера (Digital caliper, mitutoyo, Япония) три раза в неделю в ходе периода наблюдения, и объем опухоли (TV) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент времени распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения.

В результате введения лекарственных средств, представленных в таблице 4, на 21, 25, 28 и 31 сутки после трансплантации опухоли, соответственно, группа, в которой вводили каждый из GI101 и Китруды, продемонстрировала ингибирование роста опухоли по сравнению с контролем (hIgG4). Группа, в которой вводили комбинацию GI101 и Китруды, продемонстрировала ингибирование роста опухоли по сравнению с контролем. Группа, в которой вводили комбинацию GI101 и Китруды, продемонстрировала ингибирование роста опухоли по сравнению с группами, в которой вводили каждый из GI101 и Китруды (фиг.60).

В результате вычисления степени ингибирования роста опухоли в конце эксперимента (после трансплантации опухоли, сутки 42) по сравнению с 1 сутками введения лекарственного средства (после трансплантации опухоли, сутки 21), группа, в которой вводили hIgG4, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 2 мышей, 50% или более у 1 мыши, и 80% или более у 1 мыши. Кроме того, группа, в которой вводили GI101, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 5 мышей, 50% или более у 5 мышей, и 80% или более у 2 мышей, и группа, в которой вводили Китруду, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 7 мышей, 50% или более у 5 мышей, и 80% или более у 3 мышей. Кроме того, группа, в которой вводили комбинацию GI101 и Китруды, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 8 мышей, 50% или более у 8 мышей, и 80% или более у 6 мышей (фиг.61).

Кроме того, степень роста опухоли у индивидуальных экспериментальных животных каждой группы введения, когда комбинацию GI101 и Китруды использовали у мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы человека, представлена на фиг.62-66.

Экспериментальный пример 21. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI101 и антитела против PD-1 у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши

Этот тест был предназначен для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после внутрибрюшинного введения mGI101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с антителом против PD-1 в качестве положительного контрольного вещества в модели опухоли с аллотрансплантированными MC38 у мышей C57BL/6.

Клетки рака ободочной и прямой кишки грызунов MC38 приобретали от Kerafast (США) и использовали для тестирования. Клетки MC38 культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина, а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 1×10⁶ клеток MC38 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей C57BL/6 (в возрасте 7 недель).

Мышей случайным образом распределяли на основе объема опухоли (30 мм³), причем каждая группа включала 5 мышей. Трансплантаты опухоли идентифицировали приблизительно через 2 суток после инокуляции клеток. Как показано в таблице 5, были сформированы тестируемые группы и было проведено введение тестируемых веществ.

[Таблица 5]

Экспериментальная группа Путь введения, курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (hIgG4) в/б BIW×16 суток 10 мг/кг 5 G2 mGI101 в/б сутки 1, 5, 9 6 мг/кг 6 G3 Антитело против PD-1
(клон RMP1-14, InVivoMab) в/б BIW×16 суток 5 мг/кг 5 G4 mGI101+антитело против PD-1 в/б сутки 1, 5, 9 (mGI101) 0,6 мг/кг 5 в/б BIW×16 суток (антитело против PD-1) 5 мг/кг

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных. В конце периода тестирования животных умерщвляли. Размер солидной опухоли MC38 определяли с использованием 3D-сканнера опухоли (TM900, Peria, Бельгия). Для каждой экспериментальной группы вычисляли среднее снижение массы тела и процентное изменение массы тела, и среднее ингибирование роста опухоли. Противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя. Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством одностороннего дисперсионного анализа (в конце этого теста), а затем критерия множественных сравнений Бонферрони. Значимым считали значение p менее 0,05.

У всех тестируемых животных сохранялось здоровое состояние без признаков патологических аномалий после введения mGI101 отдельно и комбинации с антителом против PD-1. Результаты комбинированной терапии с использованием mGI101 и/или антитела против PD-1, направленной против опухоли MC38, представлены на фиг.67. Противораковый эффект наблюдали в группе, в которой вводили лекарственное средство, по сравнению с контролем, и отличие размера опухоли было заметным в ходе периода тестирования 16 суток. Опухоль MC38 известна из литературы в качестве модели, отвечающей на антитело против PD-1, и противораковый эффект также наблюдался в этом тесте в группе, в которой вводили антитело против PD-1 (p> 0,01). Противораковый эффект также был показан в группе, в которой вводили mGI101 (6 мг/кг) отдельно, а также в группе, в которой вводили антитело против PD-1 (p>0,01). Группа, в которой вводили комбинацию mGI101 (0,6 мг/кг) + антитело против PD-1 (5 мг/кг), продемонстрировала очевидный превосходный противораковый эффект (p> 0,0001).

Размеры индивидуальных опухолей для каждой тестируемой группы представлены на фиг.69-73. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей, небольшую регрессию опухоли наблюдали у некоторых животных группы, в которой вводили антитело против PD-1. Группа, в которой вводили mGI101 (6 мг/кг) отдельно, продемонстрировала более превосходный эффект ингибирования роста опухоли, чем группа, в которой вводили антитело против PD-1. Размер опухоли оставался одинаковым с 5 суток по 7 сутки, однако опухоль вновь начинала расти после 7 суток. Группа, в которой вводили комбинацию (GI101 (0,6 мг/кг) + антитело против PD-1 (5 мг/кг)), продемонстрировала очевидное превосходное ингибирование роста опухоли. В частности, две мыши группы, в которой вводили комбинацию, продемонстрировали полную ремиссию (отсутствие опухоли).

Клетки MC38 реинъецировали в левый бок двух мышей, которые продемонстрировали полную ремиссию, из группы, в которой вводили комбинацию (область, противоположная области первой инъекции злокачественных клеток). Этим мышам продолжали вводить антитело против PD-1 (5 мг/пк, BIW) до 32 суток (фиг.74). Опухоль небольшого размера (> 30 мм³) была обнаружена у одной из двух мышей, однако размер опухоли не увеличивался далее до 35 суток (фиг.69). У другой мыши не наблюдали опухоли после реинъекции опухоли (фиг.69 и 74).

В заключение, в результате тестирования противоопухолевой эффективности mGI101 отдельно и в комбинации с антителом против PD-1 в модели с аллотрансплантированной опухолью MC38, наилучшая противоопухолевая эффективность была показана в группе, в которой вводили комбинацию (GI101 (0,6 мг/кг) + антитело против PD-1 (5 мг/кг)). Двое из экспериментальных животных в группе, в которой вводили комбинацию, продемонстрировали полную ремиссию и мыши с полной ремиссией, которым реинъецировали MC38, продемонстрировали эффект резистентности к злокачественной опухоли (таблица 6).

[Таблица 6]

Сутки после введения Мышь с CR № 1
Объем опухоли (мм³) № 2
Объем опухоли (мм³) D1 78,2 23,6 D2 84,5 13,5 D3 36,3 0 D4 0 0 D5 0 0 D6 0 0 D7 0 0 D8 0 0 D9 0 0 D10 0 0 D11 0 0 D12 0 0 D13 0 0 D14 0 0 D15 0 0 D16 0 0 D17 0 0 D18 0 0 D19 0 0 D20 0 0 D21 0 0 D22 0 0 D23 0 0 D24 0 0 *D25 0 0 D26 0 0 D27 0 0 D28 0 0 D29 0 0 D30 0 0 D31 0 0 D32 12,8 0

Экспериментальный пример 22. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI101 и антитела против PD-L1 у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши

Этот тест проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с антителом против PD-L1 (BioXcell, каталожный номер № BE0101) в качестве положительного контрольного вещества в модели опухоли с аллотрансплантированными клетками CT26 (клетки карциномы толстого кишечника мыши) у мышей BALB/c.

Клетки CT26 культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина, а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 5×10⁵ клеток CT26 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей BALB/c (в возрасте 7 недель).

Мышей случайным образом распределяли на группы, исходя из объема опухоли (50-120 мм³), причем каждая группа включала 4 мыши. Трансплантаты опухоли идентифицировали приблизительно через 2 суток после инокуляции клеток. Как показано в таблице 7, были сформированы тестируемые группы и проводили введение тестируемых веществ.

[Таблица 7]

Экспериментальная группа Путь введения, курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/б BIW×9 суток - 4 G2 mGI101 в/в QW×9 суток 3 мг/кг 4 G3 Антитело против PD-L1
(BioXcell, каталожный номер № BE0101) в/б BIW×9 суток 10 мг/кг 4 G4 mGI101+антитело против PD-L1 в/в QW×9 суток (mGI101) 3 мг/кг 4 в/б BIW×9 суток (антитело против PD-L1) 10 мг/кг

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных. В конце периода тестирования животных умерщвляли. Размер солидной опухоли CT26 определяли с использованием 3D-сканнера опухоли (TM900, Peria, Бельгия). Для каждой экспериментальной группы вычисляли среднее снижение массы тела и процентное изменение массы тела, и среднее ингибирование роста опухоли. Противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя. Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством одностороннего дисперсионного анализа (в конце этого теста), а затем критерия множественных сравнений Бонферрони. Значимым считали значение p менее 0,05.

В результате тестирования противоопухолевой эффективности mGI101 отдельно и в комбинации с антителом против PD-L1 в модели с аллотрансплантированной опухолью CT26, наилучшая противоопухолевая эффективность была такой, как показано в группе, в которой вводили комбинацию (mGI101 (3 мг/кг) + антитело против PD-L1 (10 мг/кг)) (фиг.75).

Экспериментальный пример 23. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI101 и антитела против TIGIT у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши

Этот тест проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с антителом против TIGIT, специфически связывающимся с внеклеточным доменом (ECD) TIGIT, в качестве положительного контрольного вещества в модели опухоли с аллотрансплантированными клетками CT26 (клетки карциномы толстого кишечника мыши) у мышей BALB/c.

Клетки CT26 культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% эмбриональную телячью сыворотку (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина, а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 5×10⁵ клеток CT26 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей BALB/c (в возрасте 7 недель).

Мышей случайным образом распределяли на группы, исходя из объема опухоли (50-120 мм³), причем каждая группа включала 5 мышей. Трансплантаты опухоли идентифицировали приблизительно через 2 суток после инокуляции клеток. Как показано в таблице 8, были сформированы тестируемые группы и проводили введение тестируемых веществ.

[Таблица 8]

Экспериментальная группа Путь введения, курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/б BIW×9 суток - 5 G2 mGI101 в/в QW×9 суток 3 мг/кг 5 G3 Антитело против TIGIT в/б BIW×9 суток 20 мг/кг 5 G4 mGI101+антитело против TIGIT в/в QW×9 суток (mGI101) 3 мг/кг 5 в/б BIW×9 суток (антитело против TIGIT) 20 мг/кг

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных. В конце периода тестирования животных умерщвляли. Размер солидной опухоли CT26 определяли с использованием 3D-сканнера опухоли (TM900, Peria, Бельгия). Для каждой экспериментальной группы вычисляли среднее снижение массы тела и процентное изменение массы тела, и среднее ингибирование роста опухоли. Противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя. Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством одностороннего дисперсионного анализа (в конце этого теста), а затем критерия множественных сравнения Бонферрони. Значимым считали значение p менее 0,05.

В результате тестирования противоопухолевой эффективности mGI101 отдельно и в комбинации с антителом против TIGIT в модели с аллотрансплантированной опухолью CT26, наилучшая проитивоопухолевая эффективность была показана в группе, в которой вводили комбинацию (mGI101 (3 мг/кг) + антитело против TIGIT (20 мг/кг)) (фиг.76). На наблюдали противоопухолевого эффекта в группе, в которой вводили антитело против TIGIT отдельно по сравнению с контролем, однако группа, в которой вводили комбинацию с mGI101, продемонстрировала очевидный противоопухолевый противоопухолевый эффект по сравнению с группой, в которой вводили mGI101 отдельно.

VI. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и ингибитора TGF-βR

Экспериментальный пример 24. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и ингибитора TGF-βR (галунисертиб) у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши

Этот тест был предназначен для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с галунисертибом в качестве положительного контрольного вещества в модели опухоли с аллотрансплантированными клетками CT26 (карцинома толстого кишечника мыши) у мышей.

Исходный раствор тестируемого вещества, отрицательного контрольного вещества и положительного контрольного вещества, описанных в таблице 9, разбавляли путем добавления эксципиентов в зависимости от каждой дозы.

[Таблица 9]

- Тестируемое вещество Положительное контрольное вещество Отрицательное контрольное вещество Наименование вещества mGI-101 Галунисертиб hIgG4 Внешний вид Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Компонент Слитый белок Fc Ингибитор TGF-β - Эксципиент Гистидиновый буфер (20 мМ), pH 7,0, полоксамер 188 0,07 масс./масс.%, аргинин-HCl, 15 мг/мл, сахароза, 150 мг/мл 1% CMC (карбоксиметил-целлюлоза)-Na PBS pH 7,5 - - Условия хранения Хранение в условиях охлаждения (4°C) Хранение в условиях охлаждения (4°C) Хранение в условиях охлаждения (4°C) Предостережения в отношении обращения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения

Клетки рака ободочной и прямой кишки мыши CT26 (Mus musculus, аденокарцинома толстого кишечника) приобретали от ATCC (США) и использовали для тестирования. Клетки для применения в тестировании размораживали, смешивали со средой RPMI1640 (A1049101, Thermofisher scientific), содержавшей 10% FBS (эмбриональная телячья сыворотка, Gibco, 10082-147), а затем помещали во флакон для культивирования клеток и культивировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂. Клетки промывали PBS, а затем клетки выделяли с использованием трипсин-EDTA (15090, Gibco), и проводили центрифугирование (125×g, 5 минут) для удаления супернатанта, а затем клетки суспендировали в новой среде с получением клеточной суспензии. Жизнеспособность клеток идентифицировали, а затем получали клеточную линию путем разбавления в среде до концентрации 5,0×10⁶ клеток/мл.

Самцов мышей BALB/cAnHsd в возрасте 6 недель приобретали и использовали для тестирования. После окончания периода акклиматизации, составлявшего 7 суток, клетки трансплантировали здоровым животным. Клеточную суспензию (5×10⁶ клеток/мл) отмеряли, и ей заполняли одноразовый шприц, и проводили трансплантацию суспензии посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл/животное в правую область спины животных. Основные симптомы наблюдали один раз в сутки в ходе приживления и периода роста после трансплантации клеточной линии.

После проведения инокуляции клеточной линии, когда размер опухоли в области, в которую была трансплантирована клеточная линия, достигал приблизительно 50 мм³, проводили распределение в группы по размеру опухоли настолько равномерно, насколько это возможно.

Как показано в таблице 10, проводили формирование тестируемых групп. Тестируемое вещество вводили перорально или внутрибрюшинно, и вводили в течение 3 недель в зависимости от состава тестируемой группы. В случае перорального введения животных фиксировали способом фиксации кожи шейного отдела позвоночника, и проводили введение непосредственно в желудок с использованием зонда для перорального введения. В случае внутрибрюшинного введения животных фиксировали способом фиксации кожи шейного отдела позвоночника и проводили внутрибрюшинное введение с использованием шприца, оборудованного иглой калибра 26. Скорость введения не превышала 200 мкл/мин.

[Таблица 10]

Группа Пол Вводимое вещество Частота введения Путь введения Дозировка (мг/кг/
сутки) Объем дозирования
(мл/кг/
сутки) G1 M Носитель 2 раза/
неделя в/б - 5 G2 M mGI-101 2 раза/
неделя в/б 3 5 G3 M Галунисертиб 3 раза/
неделя п/о 75 10 G4 M mGI-101 2 раза/
неделя в/б 3 5 Галунисертиб 3 раза/
неделя п/о 75 10

Тип основных симптомов, включая смерть, дату возникновения и тяжесть симптомов, наблюдали один раз в сутки в ходе периода введения и наблюдения, и регистрировали для каждого индивидуума. Массу тела определяли в день распределения на группы или в день начала введения тестируемого вещества, и после этого один раз в неделю.

Размер опухоли измеряли три раза в неделю в течение 3 недель от дня начала введения тестируемого вещества. Большую ось и меньшую ось опухоли измеряли с использованием толщиномера, и размер опухоли (объем опухоли, TV) вычисляли с использованием следующих уравнений.

TV (мм³)=(W² × L)/2

Степень ингибирования роста опухоли вычисляли с использованием результатов измерения размера опухоли. Степень ингибирования роста опухоли вычисляли следующим образом.

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В результате измерения размера опухоли уровни размера опухолей G2 и G4 на 4 сутки после начала введения тестируемого вещества были на статистически значимом уровне более низкими, чем в G1 (p<0,01, p<0,001), и уровни размера опухоли в G2 и G4 на 7 сутки после начала введения тестируемого вещества были на статистически значимом уровне более низкими, чем в G1 (p<0,05 или p<0,01).

С 2 суток по 7 сутки после начала введения тестируемого вещества уровни размера опухоли в G2 и G4 имели тенденцию к тому, чтобы быть более низкими, чем в G1. Кроме того, до 7 суток после начала введения тестируемого вещества уровни размера опухоли в G4 были более низкими, чем в G2 или G3 (фиг.77 и 79).

[Таблица 11]

Размер опухоли Единица: мм³ Сутки Экспериментальная группа G1 G2 G3 G4 0 61,97 ± 12,41 61,96 ± 11,81 61,98 ± 12,23 61,98 ± 12,16 2 210,34 ± 32,30 177,83 ± 78,22 187,20 ± 55,14 149,16 ± 43,02 4 363,47 ± 36,18 224,56 ± 105,31^** 260,69 ± 78,70 187,35 ± 60,13^*** 7 488,92 ± 81,97 291,81 ± 155,23 (9)^* 398,78 ± 146,30 232,95 ± 99,73^** N 10 10 10 10

Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартное отклонение. N: количество животных, G1: контроль в виде носителя в/б, G2: mGI-101 3 мг/кг в/б, G3: галунисертиб 75 мг/кг п/о, G4: mGI-101 3 мг/кг в/б+галунисертиб 75 мг/кг п/о

^***/**/*Значимое отличие на уровне p<0,001/p<0,01/p<0,05 по сравнению с G1

В результате вычисления степени ингибирования роста опухоли, с 4 суток по 7 сутки после начала введения тестируемого вещества уровень ингибирования роста опухоли в G2 был на статистически значимом уровне более высоким, чем в G1. С 2 суток по 7 сутки после начала введения тестируемого вещества уровень ингибирования роста опухоли в G4 был на статистически значимом уровне более высоким, чем в G1. Кроме того, на 7 сутки уровень ингибирования роста опухоли в G4 был на статистически значимом уровне более высоким, чем в G3.

В конце эксперимента мыши со степенью ингибирования роста опухоли 30%, 50% или 80% или более являлись такими, как показано на фиг.78.

[Таблица 12]

Ингибирование роста опухоли Единицы: % Сутки Экспериментальная группа G1 G2 G3 G4 2 0,00 ± 20,74 21,91 ± 53,41 15,60 ± 38,26 41,24 ± 25,98^* 4 0,00 ± 10,50 46,07 ± 35,1^** 34,09 ± 27,14 58,42 ± 17,88^*** 7 0,00 ± 19,21 46,48 ± 36,39 (9)^** 21,12 ± 34,98 59,96 ± 21,45^***,$ N 10 10 10 10

Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартное отклонение. N: количество животных, G1: контроль в виде носителя в/б, G2: mGI-101 3 мг/кг в/б, G3: галунисертиб 75 мг/кг п/о, G4: mGI-101 3 мг/кг в/б+галунисертиб 75 мг/кг п/о

^***/**/*Значимое отличие на уровне p<0,001/p<0,01/p<0,05 по сравнению с G1

^$Значимое отличие на уровне p<0,05 по сравнению с G3

Экспериментальный пример 25. Идентификация противоракового эффекта посредством комбинирования mGI-101 и ингибитора TGF-βR (вактосертиб) в клеточной линии рака молочной железы

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством обработки клеток MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы человека) тестируемым веществом GI-101 отдельно или в комбинации с ингибитором передачи сигнала TGF-бета вактосертибом в условиях in vitro.

Клетки MDA-MB-231 приобретали в банке клеточных линий Кореи и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Для применения в тесте уничтожения злокачественных клеток клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в среде RPMI1640, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences). Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой преобразовывали в суспензию 2×10⁵клеток/мл с использованием свободной от FBS среды RPMI1640. Суспензию злокачественных клеток окрашивали при 37°C в течение 1 часа с использованием CELLTRACKER^TM Deep Red Dye (Thermo) для отслеживания пролиферации или ингибирования пролиферации злокачественных клеток. После окрашивания их центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут, а затем их промывали свободной от FBS средой RPMI1640, а затем суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 2×10⁵клеток/мл. Суспензию злокачественных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning) по 50 мкл (1×10⁴ клеток), а затем стабилизировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 1 часа.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) использовали для идентификации эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством GI-101. PBMC человека приобретали от Zen-Bio, и PBMC, хранившиеся замороженными, помещали на водяную баню при 37°C и размораживали настолько быстро, насколько это было возможно, а затем переносили в среду RPMI1640 (Gibco), содержавшую 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco), и центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences) аналогично тому, как и для линии злокачественных клеток. Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 5×10⁵клеток/мл. Суспензию PBMC распределяли по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning), в который была распределена линия злокачественных клеток, в зависимости от условий.

Для идентификации эффекта уничтожения клеток, реагент CytoTox Green (INCUCYTE^TM CytoTox Green, Satorius), который связывается с ДНК клеток, подлежащих уничтожению, приготавливали в 1 мкл на 1 мл среды RPMI1640, содержавшей 5% сыворотки AB человека (Sigma). Полученную среду использовали для разбавления тестируемого вещества, и эффект уничтожения клеток можно было количественно идентифицировать путем окрашивания клеток, подлежащих уничтожению, при сокультивировании тестируемого вещества с линиями злокачественных клеток и PBMC.

Порошок вактосертиба растворяли в DMSO (Sigma) до концентрации 48,4 мМ, и разбавляли с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечной концентрации 12,1 нМ (50 мкл) на лунку 96-луночного микропланшета.

GI-101 разбавляли 1/3 с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечных концентрациях 0,4 нМ, 1,2 нМ, 3,7 нМ, 11,1 нМ, 33,3 нМ и 100 нМ по 50 мкл на лунку 96-луночного микропланшета.

Полученное тестируемое вещество помещали в каждую лунку 96-луночного микропланшета, в которой линии злокачественных клеток и PBMC были распределены в зависимости от условий, и культивировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 24 часов, и пролиферацию или гибель злокачественных клеток наблюдали посредством оборудования для анализа визуализации клеток в реальном времени IncuCyte S3 (Satorious). Гибель злокачественных клеток количественно определяли по интегрированной интенсивности клеток, окрашенных в зеленый цвет с использованием реагента CytoTox Green.

В результате, было идентифицировано, что группа, в которой вводили комбинацию GI-101 и вактосертиба, продемонстрировала превосходный эффект уничтожения злокачественных клеток по сравнению с группой, в которой вводили каждое лекарственное средство отдельно.

VII. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и ингибитора VEGFR

Экспериментальный пример 26. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и ингибитора VEGFR (акситиниб)

Этот тест был предназначен для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с акситинибом в качестве положительного контрольного вещества в модели опухоли с аллотрансплантированными клетками CT26 (карцинома толстого кишечника мыши) или клетками LL2 (карцинома легкого мыши) у мышей.

Исходный раствор тестируемого вещества, отрицательного контрольного вещества и положительного контрольного вещества, описанных в таблице 13, разбавляли путем добавления эксципиентов в зависимости от каждой дозы.

[Таблица 13]

- Тестируемое вещество Положительное контрольное вещество Отрицательное контрольное вещество Наименование вещества mGI-101 Акситиниб hIgG4 Внешний вид Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Компонент слитый белок Fc ингибитор VEGFR - Эксципиент Гистидиновый буфер (20 мМ), pH 7,0, полоксамер 188 0,07 масс./масс.%, аргинин-HCl 15 мг/мл, сахароза 150 мг/мл 0,5% CMC (карбоксиметил-целлюлоза) PBS pH 7,5 - - Условия хранения Хранение в условиях охлаждения (4°C) Хранение в условиях охлаждения (4°C) Хранение в условиях охлаждения (4°C) Предостережения в отношении обращения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения Хранить охлажденным до введения и приготовить и использовать в день введения

Клетки рака ободочной и прямой кишки мыши CT26 (Mus musculus, аденокарцинома толстого кишечника) и клетки рака легкого мыши LL/2 (Mus musculus, аденокарцинома легкого) приобретали от ATCC (США) и использовали для тестирования. Клетки для применения в тестировании размораживали, смешивали со средой RPMI1640 (A1049101, Thermofisher scientific), содержавшей 10% FBS (эмбриональная телячья сыворотка, Gibco, 10082-147), а затем помещали во флакон для культивирования клеток и культивировали в инкубаторе при 37°C с 5% CO₂. Клетки промывали PBS, а затем клетки выделяли с использованием трипсин-EDTA (15090, Gibco), и проводили центрифугирование (125×g, 5 минут) для удаления супернатанта, а затем клетки суспендировали в новой среде с получением клеточной суспензии. Жизнеспособность клеток идентифицировали, а затем получали клеточную линию путем разбавления в среде до концентрации 5,0×10⁶ клеток/мл.

Самцов мышей BALB/cAnHsd или C57BL/6NHsd в возрасте 6 недель приобретали и использовали для тестирования. После окончания периода акклиматизации, составляющего 7 суток, клетки трансплантировали здоровым животным. Клеточную суспензию (5×10⁶ клеток/мл) отмеряли, и ей заполняли одноразовый шприц, и проводили трансплантацию суспензии посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл/животное в правую область спины животных. Основные симптомы наблюдали один раз в сутки в ходе приживления и периода роста после трансплантации клеточной линии.

После проведения инокуляции клеточной линии, когда размер опухоли в области, в которую была трансплантирована клеточная линия, достигал приблизительно 50 мм³, проводили распределение на группы по размеру опухоли настолько равномерно, насколько это возможно.

Как показано в таблице 14, были сформированы тестируемые группы. Тестируемое вещество вводили перорально или внутрибрюшинно, и вводили в течение 3 недель в зависимости от состава тестируемой группы. В случае перорального введения, животных фиксировали способом фиксации кожи шейного отдела позвоночника, и проводили введение непосредственно в желудок с использованием зонда для перорального введения. В случае внутрибрюшинного введения животных фиксировали способом фиксации кожи шейного отдела позвоночника и проводили внутрибрюшинное введение с использованием шприца, оборудованного иглой калибра 26. Скорость введения не превышала 200 мкл/мин.

[Таблица 14]

Группа Пол Вводимое вещество Частота введения Путь введения Дозировка (мг/кг/
сутки) Объем дозирования
(мл/кг/
сутки) G1 M Носитель 2 раза/
неделя в/б 3 5 G2 M mGI-101 2 раза/
неделя в/б 3 5 G3 M Акситиниб 3 раза/
неделя п/о 30 10 G4 M mGI-101 2 раза/
неделя в/б 3 5 Акситиниб 3 раза/
неделя п/о 30 10

Размер опухоли определяли аналогично тому, как описано в экспериментальном примере 24.

Экспериментальный пример 26.1. Модель на мышах с аллотрансплантированным раком ободочной и прямой кишки (CT26)

Синергическую модель подготавливали путем подкожной трансплантации линии клеток CT26 мышам Balb/c, а затем вводили тестируемое вещество для оценки противоракового эффекта.

В результате измерения размера опухоли уровень размера опухоли в G4 на 18 сутки и 21 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более низким, чем в G1 и G2 (p<0,0001, p<0,01 или p<0,05). Уровень размера опухоли в G4 на 21 после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более низким, чем в G3 (p<0,01). Кроме того, уровень размера опухоли в G3 на 21 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более низким, чем в G1 и G2 (p<0,001, p<0,01) (фиг.80 и 82).

[Таблица 15]

Размер опухоли Единицы: мм³ Сутки Экспериментальная группа G1 G2 G3 G4 0 59,15 ± 11,65 63,53 ± 11,56 61,67 ± 12,58 59,58 ± 11,14 2 205,25 ± 31,92 148,98 ± 55,26 169,28 ± 32,19 127,90 ± 24,99 5 354,24 ± 32,53 186,53 ± 76,61 261,76 ± 61,86 178,53 ± 84,43 7 468,75 ± 75,04 249,93 ± 149,08 354,05 ± 104,90 224,92 ± 158,21 9 573,13 ± 101,41 290,71 ± 165,17 442,98 ± 148,70 235,75 ± 158,35 12 789,72 ± 88,58 352,46 ± 195,64 529,85 ± 206,76 254,91 ± 176,31^* 14 1206,38 ± 229,96 520,04 ± 307,47^** 671,72 ± 303,14^* 254,76 ± 159,31^**** 16 1693,18 ± 210,83 962,28 ± 634,90^** 970,72 ± 475,99^** 381,38 ± 235,37^****,#,$ 19 2037,27 ± 341,20 1395,48 ± 982,61^** 1129,12 ± 639,16^**** 465,02 ± 285,88^****,####,$$ 21 3082,01 ± 462,37 1987,45 ± 1320,62^**** 1710,57 ± 1133,79^**** 880,10 ± 632,96^****,####,$$ N 8 8 8 8

Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартное отклонение. N: количество животных, G1: контроль в виде носителя в/б, G2: mGI-101 3 мг/кг в/б, G3: акситиниб 30 мг/кг п/о, G4: mGI-101 3 мг/кг в/б+акситиниб 30 мг/кг п/о

^****/**/* Значимое отличие при уровне p<0,0001/p<0,01/p<0,05 по сравнению с носителем

^####/# Значимое отличие при уровни p<0,0001/p<0,05 по сравнению с mGI-101

^$$$/$$/$ Значимое отличие при уровне p<0,001/p<0,01/p<0,05 по сравнению с акситинибом

В результате вычисления степени ингибирования роста опухоли, с 2 суток по 21 сутки после начала введения тестируемого вещества уровни ингибирования роста опухоли в G2 и G4 были на статистически значимом уровне более высокими, чем в G1 (p<0,0001, p<0,001, p<0,01 или p<0,05), и с 9 суток по 14 сутки после начала введения тестируемого вещества уровень ингибирования роста опухоли в G4 был на статистически значимом уровне более высоким, чем в G3 (p<0,05). Кроме того, на 19 сутки после начала введения тестируемого вещества уровень ингибирования роста опухоли в G4 был на статистически значимом уровне более высоким, чем в G2 (p<0,05).

В конце эксперимента мыши со степенью ингибирования роста опухоли 30%, 50% или 80% или более являются такими, как показано на фиг.81.

[Таблица 16]

ингибирование роста опухоли Единицы: % Сутки Экспериментальная группа G1 G2 G3 G4 2 0,00 ± 22,76 41,51 ± 36,11^* 26,34 ± 20,47 53,24 ± 19,71^*** 5 0,00 ± 10,69 58,32 ± 24,95^*** 32,19 ± 18,64 59,69 ± 29,99^*** 7 0,00 ± 19,60 62,12 ± 38,89^**** 28,62 ± 24,35 59,63 ± 39,68^*** 9 0,00 ± 20,29 62,87 ± 34,95^**** 25,81 ± 27,77 65,72 ± 31,54^****,#,$ 12 0,00 ± 11,98 66,48 ± 29,50^**** 35,92 ± 27,44 73,26 ± 24,71^****,$ 14 0,00 ± 20,33 65,87 ± 29,12^**** 46,82 ± 25,79^** 82,99 ± 14,19^****,$ 16 0,00 ± 13,20 52,36 ± 41,33^** 44,37 ± 28,66^** 80,31 ± 14,77^**** 19 0,00 ± 17,31 41,48 ± 52,17^* 46,04 ± 31,96^** 79,50 ± 14,72^****,# 21 0,00 ± 15,45 44,57 ± 46,55^** 45,45 ± 37,30^** 72,86 ± 21,07^**** N 8 8 8 8

Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартное отклонение. N: количество животных, G1: контроль в виде носителя в/б, G2: mGI-101 3 мг/кг в/б, G3: акситиниб 30 мг/кг п/о, G4: mGI-101 3 мг/кг в/б+акситиниб 30 мг/кг п/о

^{****/***/**/*}Значимое отличие при уровне p<0,0001/p<0,001/p<0,01/p<0,05 по сравнению с носителем

^# Значимое отличие при уровне p<0,05 по сравнению с mGI-101 3 мг/кг

^$ Значимое отличие при уровне p<0,05 по сравнению с mGI-101 3 мг/кг+акситиниб 30 мг/кг

Экспериментальный пример 26.2. Модель на мышах с аллотрансплантированным раком легкого (LL/2)

Синергическую модель подготавливали путем подкожной трансплантации линии клеток LL/2 мышам C57BL/6, а затем вводили тестируемое вещество для оценки противоракового эффекта.

В результате измерения размера опухоли в G3 и G4 сохранялся более низкий уровень размера опухоли, чем в G1, до конца теста. Кроме того, уровень размера опухоли в G4 в ходе всего периода тестирования был наиболее низким уровнем среди всех тестируемых групп, и уровень размера опухоли в G4 на 19 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более низким, чем в G1 (p<0,05) и G2 (p<0,01).

Уровень размера опухоли в G4 на 21 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более низким, чем во всех из групп G1 (p<0,0001), G2 (p<0,0001) и G3 (p<0,01). Кроме того, уровень размера опухоли в G3 на 21 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более низким, чем в G1 (p<0,01) и G2 (p<0,001) (фиг.83 и 85).

[Таблица 17]

Размер опухоли Единицы: мм³ Сутки Экспериментальная группа G1 G2 G3 G4 0 55,75 ± 12,29 55,70 ± 11,48 55,77 ± 11,25 55,73 ± 9,99 2 96,34 ± 25,87 99,18 ± 19,96 88,73 ± 21,26 98,80 ± 24,93 5 181,94 ± 40,25 179,58 ± 39,71 179,31 ± 52,62 179,21 ± 58,26 7 460,71 ± 126,65 409,37 ± 72,98 362,30 ± 97,92 341,77 ± 91,55 9 791,60 ± 247,83 749,00 ± 174,47 584,17 ± 172,94 544,37 ± 155,89 12 1141,58 ± 236,27 1066,72 ± 307,18 892,90 ± 256,88 841,86 ± 267,92 14 1637,35 ± 402,07 1608,00 ± 572,50 1292,27 ± 385,43 1242,66 ± 424,70 16 2219,74 ± 442,05 2200,03 ± 850,12 1775,26 ± 462,50 (9) 1693,31 ± 579,80 19 3044,87 ± 518,05 3223,87 ± 1191,11 2551,08 ± 695,31 (9) 2215,02 ± 667,76^*,## 21 5285,56 ± 1120,41 5431,08 ± 1673,60 4236,33 ± 1060,18 (9) ^**,## 3255,38 ± 819,52^****,####,$$ N 10 10 10 10

Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартное отклонение. N: количество животных, G1: контроль в виде носителя в/б, G2: mGI-101 3 мг/кг в/б, G3: акситиниб 30 мг/кг п/о, G4: mGI-101 3 мг/кг в/ю+акситиниб 30 мг/кг п/о

^****/*Значимое отличие при уровне p<0,0001/p<0,05 по сравнению с носителем

^####/## Значимое отличие при уровне p<0,0001/p<0,01 по сравнению с mGI-101 3 мг/кг

^$$Значимое отличие при уровне p<0,01 по сравнению с mGI-101 3 мг/кг+акситиниб 30 мг/кг

В результате вычисления степени ингибирования роста опухоли уровень ингибирования роста опухоли в G4 на 19 сутки и 21 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более высоким, чем в G2 (p<0,01, p<0,05), и уровень ингибирования роста опухоли в G4 на 21 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более высоким, чем в G1 (p<0,05). Наиболее низкий уровень размера опухоли наблюдался в G4, и степень ингибирования роста опухоли также имела тенденцию к тому, чтобы быть наивысшей.

В конце эксперимента мыши со степенью ингибирования роста опухоли 30%, 50% или 80% или более являются такими, как показано на фиг.84.

[Таблица 18]

Ингибирование роста опухоли Единицы: % Сутки Экспериментальная группа G1 G2 G3 G4 2 0,00 ± 46,91 -7,12 ± 34,31 18,79 ± 28,38 -6,12 ± 53,19 5 0,00 ± 26,04 1,83 ± 27,19 2,10 ± 36,27 2,15 ± 43,77 7 0,00 ± 29,89 12,67 ± 19,15 24,30 ± 23,63 29,36 ± 21,69^* 9 0,00 ± 33,79 5,78 ± 24,08 28,19 ± 23,46 33,59 ± 20,83 12 0,00 ± 21,78 6,89 ± 28,47 22,90 ± 23,42 27,60 ± 24,47 14 0,00 ± 25,38 1,85 ± 36,39 21,82 ± 24,12 24,95 ± 26,67 16 0,00 ± 20,30 0,91 ± 39,37 20,58 ± 21,15 (9) 24,33 ± 26,59 19 0,00 ± 17,10 -5,99 ± 39,91 16,55 ± 23,06 (9) 27,76 ± 22,20^# 21 0,00 ± 21,32 -2,78 ± 32,04 20,08 ± 20,18 (9) 38,82 ± 15,63^*,## N 10 10 10 10

Результаты выражали в качестве среднего значения ± стандартное отклонение. N: количество животных, G1: контроль в виде носителя в/б, G2: mGI-101 3 мг/кг в/б, G3: акситиниб 30 мг/кг п/о, G4: mGI-101 3 мг/кг в/ю+акситиниб 30 мг/кг п/о

^* Значимое отличие при уровне p<0,05 по сравнению с носителем

^##/#Значимое отличие при уровне p<0,01/p<0,05 по сравнению с mGI-101 3 мг/кг

Экспериментальный пример 27. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и ингибитора VEGFR (ленватиниб)

Экспериментальный пример 27.1. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и ленватиниба у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с ленватинибом в модели опухоли с аллотрансплантацией клеток CT26 (клетки карциномы толстого кишечника мыши) у мышей BALB/c.

Клетки CT26 приобретали в ATCC (США) и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью, 1×10⁶ клеток CT26 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей BALB/c (в возрасте 7 недель). Основные симптомы наблюдали один раз в сутки в ходе приживления и периода роста после трансплантации клеточной линии.

Через определенный период времени после трансплантации клеток объем опухоли определяли для животных без нарушений состояния здоровья животных, и мышей распределяли таким образом, чтобы средний объем опухоли в каждой группе составлял менее 70-100 мм³, причем каждая группа включала 10 мышей. Как показано в таблице 19, были сформированы тестируемые группы и проводилось введение тестируемых веществ.

В случае порошка ленватиниба дозу вычисляли и взвешивали, и его приготавливали в концентрации, соответствующей дозе, с использованием эксципиента 0,5% метилцеллюлозы. Для минимизации потери тестируемого вещества дозы для 3 или 4 суток взвешивали и приготавливали с использованием эксципиента в день введения, и инъецировали.

[Таблица 19]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/в QW (один раз/неделя) - мг/кг 10 G2 mGI-101 в/в QW (один раз/неделя) 3 мг/кг 10 G3 Ленватиниб п/о Каждый день 3 мг/кг 10 G4 mGI-101+Ленватиниб в/в+п/о mGI-101: QW (один раз/неделя), Ленватиниб: каждые сутки 3 мг/кг+3 мг/кг 10

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных, и мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал 4000 мм³. Размер солидной злокачественной опухоли CT26 определяли два раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием толщиномера (Digital caliper, Mitutoyo, Япония), и объем опухоли (TV) и степень ингибирования роста опухоли (TGI) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения.

Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты размера опухоли после введения mGI-101 отдельно или в комбинации с ленватинибом в отношении опухоли CT26, представлены на фиг.86. В результате измерения размера опухоли, по сравнению с контролем статистически значимый противораковый эффект наблюдался в группе, в которой вводили ленватиниб отдельно, и в группе, в которой вводили комбинацию mGI-101+ленватиниб. Уровень размера опухоли в группе, в которой вводили ленватиниб отдельно, на 18 сутки и 21 сутки после начала введения тестируемого вещества был на статистически значимом уровне более низким, чем в контрольной группе (p<0,5, p<0,1). Уровень размера опухоли в группе, в которой вводили комбинацию mGI-101+ленватиниб на 16 сутки, 18 сутки и 21 сутки после начала введения тестируемого вещества, был на статистически значимом уровне более низким, чем в контрольной группе (p<0,5, p<0,001, p<0,0001), и на статистически значимом уровне более низким, чем в группе, в которой вводили mGI-101 отдельно на 18 сутки и 21 сутки (p<0,01, p<0,0001).

Индивидуальные размеры опухолей для каждой тестируемой группы представлены на фиг.88. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей, группа, в которой вводили комбинацию mGI-101+ленватиниб, продемонстрировала превосходный эффект ингибирования роста опухоли по сравнению с группой, в которой вводили mGI-101 отдельно.

В конце эксперимента мыши со степенью ингибирования роста опухоли 30%, 50% или 80% или более были такими, как показано на фин.87. Контроль в виде носителя продемонстрировал степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 4 мышей, 50% или более у 3 мышей, и 80% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили mGI-101 отдельно, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 6 мышей, 50% или более у 2 мышей, и 80% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили ленватиниб отдельно, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 6 мышей, 50% или более у 4 мышей, и 80% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили комбинацию mGI-101+ленватиниб, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 10 мышей, 50% или более у 6 мышей и 80% или более ни у одной из мышей.

Экспериментальный пример 27.2. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и ленватиниба у мышей с трансплантированной линией клеток рака почка мыши

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с ленватинибом в модели опухоли с аллотрансплантацией клеток Renca (клетки рака почки мыши) мышам BALB/c.

Клетки Renca приобретали от ATCC (США) и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 5×10⁶ клеток Renca подкожно инъецировали в бок самок мышей BALB/c (в возрасте 8 недель). Основные симптомы наблюдали один раз в сутки в ходе приживления и периода роста после трансплантации клеточной линии.

Через определенный период времени после инокуляции клеток трансплантатов опухоли мышей измеряли объем опухоли для животных без нарушений состояния здоровья, и мышей случайным образом отбирали и распределяли, причем каждая группа включала 10 мышей. Как показано в Таблица 20, были сформированы тестируемые группы и было проведено введение тестируемых веществ.

[Таблица 20]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/б QW (один раз/неделя) - мг/кг 10 G2 mGI-101 в/б BIW (2 раза/неделя) 3 мг/кг 10 G3 Ленватиниб п/о Каждые сутки 3 мг/кг 10 G4 mGI-101+ленватиниб в/б+п/о mGI-101: BIW (2 раза/неделя), ленватиниб: каждые сутки 3 мг/кг+3 мг/кг 10

Смерть мышей, тип основных симптомов, дата появления и тяжесть симптомов наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования и регистрировали для каждой особи. Размер солидной злокачественной опухоли Renca определяли два раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием штангенциркуля, и объем опухоли (TV) и степень ингибирования роста опухоли (TGI) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения, и противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя.

Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты размера опухоли при введении mGI-101 отдельно или в комбинации с ленватинибом против опухоли Renca представлены на фиг.89. В результате измерения размера опухоли, размер опухоли в группе, в которой вводили комбинацию mGI-101 (BIW) + ленватиниб, на 15 сутки после начала введения тестируемого вещества, был на статистически значимом уровне более низким, чем в группе контроля в виде носителя и в группе, в которой вводили mGI-101 (BIW) отдельно (p<0,05).

Индивидуальные размеры опухоли для каждой тестируемой группы представлены на фиг.91. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей, группа, в которой вводили комбинацию mGI-101 (BIW) + ленватиниб, продемонстрировала превосходный эффект ингибирования роста опухоли.

На фиг.90 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI-101 и ленватиниб вводили в комбинации мышам с трансплантированными Renca. Контроль в виде носителя продемонстрировал степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 4 мышей, 50% или более у 3 мышей и 80% или более у 2 мышей. Группа, в которой вводили mGI-101 отдельно один раз в неделю продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 5 мышей, 50% или более у 2 мышей и 80% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили mGI-101 отдельно два раза в неделю, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 3 мышей, 50% или более у 1 мыши и 80% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили ленватиниб отдельно, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 4 мышей, 50% или более у 2 мышей и 80% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили комбинацию mGI-101 (BIW) + ленватиниб, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 8 мышей, 50% или более у 6 мышей и 80% или более у 1 мыши.

VIII. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и ингибитора EGFR

Экспериментальный пример 28. Идентификация противоракового эффекта комбинации mGI-101 и ингибитора EGFR (цетуксимаб)

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством обработки клеток HCT116 (клетки рака толстого кишечника человека) тестируемым веществом GI-101 отдельно или в комбинации с цетуксимабом в условиях in vitro.

Клетки HCT116 приобретали в банке клеточных линий Кореи и культивировали в среде МакКоя 5A (ATCC), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Для применения в тесте уничтожения злокачественных клеток клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в среде МакКоя 5A, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences). Клетки, суспендированные в среде МакКоя 5A, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой преобразовывали в суспензию 2×10⁵клеток/мл с использованием свободной от FBS среды RPMI1640. Суспензию злокачественных клеток окрашивали при 37°C в течение 1 часа с использованием CELLTRACKER^TM Deep Red Dye (Thermo) для отслеживания пролиферации или ингибирования пролиферации злокачественных клеток. После окрашивания их центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут, а затем их промывали свободной от FBS средой RPMI1640, а затем суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 2×10⁵клеток/мл. Суспензию злокачественных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning) по 50 мкл (1×10⁴ клеток), а затем стабилизировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 1 часа.

Для идентификации эффекта тестируемого вещества в отношении уничтожения злокачественных клеток через антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), натуральные киллеры (NK-клетки) выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека с использованием набора для выделения CD56+CD16+ NK-клеток (Miltenyi Biotec) и использовали. В выделенных NK-клетках погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences) аналогично тому, как и для линии злокачественных клеток. Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образованный посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 2×10⁵клеток/мл. Суспензию PBMC распределяли по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning), в который была распределена линия злокачественных клеток, в зависимости от условий.

Для идентификации эффекта уничтожения клеток реагент CytoTox Green (INCUCYTE^TM CytoTox Green, Satorius), который связывается с ДНК клеток, подлежащих уничтожению, приготавливали в 1 мкл на 1 мл среды RPMI1640, содержавшей 5% сыворотки AB человека (Sigma). Полученную среду использовали для разбавления тестируемого вещества, и эффект уничтожения клеток можно было количественно идентифицировать путем окрашивания клеток, подлежащих уничтожению, при сокультивировании тестируемого вещества с линиями злокачественных клеток и PBMC.

Цетуксимаб разбавляли с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечной концентрации 68,6 нМ (50 мкл) на лунку 96-луночного микропланшета. GI-101 разбавляли 1/3 с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечной концентрации 100 нМ по 50 мкл на лунку 96-луночного микропланшета.

Полученное тестируемое вещество помещали в каждую лунку 96-луночного микропланшета, в которой линии злокачественных клеток и PBMC были распределены в зависимости от условий, и культивировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 24 часов, и пролиферацию или гибель злокачественных клеток наблюдали посредством оборудования для анализа визуализации клеток в реальном времени IncuCyte S3 (Satorious). Гибель злокачественных клеток количественно определяли по интегрированной интенсивности клеток, окрашенных в зеленый цвет с использованием реагента CytoTox Green.

На фиг.92 проиллюстрирована степень уничтожения злокачественных клеток, измеренная, когда злокачественные клетки обрабатывали GI-101 в концентрации 100 нМ. Все группы, в которых вводили GI-101 отдельно, цетуксимаб отдельно и комбинацию GI-101+цетуксимаб, продемонстрировали высокий уровень уничтожения злокачественных клеток, и группа в которой вводили комбинацию GI-101+цетуксимаб, продемонстрировала наиболее превосходный эффект уничтожения злокачественных клеток.

IX. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и ингибитора PARP

Экспериментальный пример 29. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и ингибитора PARP (олапариб)

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с олапарибом, ингибитором PARP, в модели опухоли с аллотрансплантацией клеток 4T1 (клетки рака молочной железы мыши) у мышей BALB/c.

Клетки 4T1 приобретали в ATCC (США) и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 1×10⁵ клеток 4T1 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей BALB/c (в возрасте 8 недель). Основные симптомы наблюдали один раз в сутки в ходе приживления и периода роста после трансплантации клеточной линии.

Через определенный период времени после инокуляции трансплантатов опухоли мышам объем опухоли определяли для животных без нарушений состояния здоровья, и мышей случайным образом выбирали и распределяли, причем каждая группа включала 11 мышей. Как показано в таблице 21, были сформированы тестируемые группы и проводилось введение тестируемых веществ.

[Таблица 21]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/в QW (один раз/неделя) - мг/кг 11 G2 mGI-101 в/б BIW (2 раза/неделя) 3 мг/кг 11 G3 Олапариб п/о 5 раз/неделя 30 мг/кг 11 G4 mGI-101+олапариб в/б+п/о mGI-101: BIW (2 раза/неделя),
олапариб: 5 раз/неделя 3 мг/кг+30 мг/кг 11

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных, и мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал 4000 мм³. Размер солидной злокачественной опухоли 4T1 определяли два раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием толщиномера (Digital caliper, Mitutoyo, Япония), и объем опухоли (TV) и степень ингибирования роста опухоли (TGI) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения, и противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя.

Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты для размера опухоли при введении mGI-101 отдельно или в комбинации с олапарибом против опухоли 4T1 представлены на фиг.94. В результате измерения размера опухоли в группе, в которой вводили лекарственное средство, наблюдали противоопухолевый по сравнению с контролем, и в соответствии с результатами уровней размера опухоли группа, в которой вводили mGI-101 отдельно и в комбинации с олапарибом, продемонстрировала превосходный эффект ингибирования роста опухоли по сравнению с группой, в которой вводили mGI-101 отдельно.

Экспериментальный пример 30. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и ингибитора PARP (талазопариб)

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством обработки клеток MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы человека) тестируемым веществом GI-101 отдельно или в комбинации с ингибитором PARP талазопарибом в условиях in vitro.

Клетки MDA-MB-231 приобретали в банке клеточных линий Кореи и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Для применения в тесте уничтожения злокачественных клеток клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в среде RPMI1640, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences). Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой преобразовывали в суспензию 2×10⁵клеток/мл с использованием свободной от FBS среды RPMI1640. Суспензию злокачественных клеток окрашивали при 37°C в течение 1 часа с использованием CELLTRACKER^TM Deep Red Dye (Thermo) для отслеживания пролиферации или ингибирования пролиферации злокачественных клеток. После окрашивания их центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут, а затем их промывали свободной от FBS средой RPMI1640, а затем суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 2×10⁵клеток/мл. Суспензию злокачественных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning) по 50 мкл (1×10⁴ клеток), а затем стабилизировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 1 часа.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) использовали для идентификации эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством GI-101. PBMC человека приобретали от Zen-Bio, и PBMC, хранившиеся замороженными, помещали на водяную баню при 37°C и размораживали настолько быстро, насколько это было возможно, а затем переносили в среду RPMI1640 (Gibco), содержавшую 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco), и центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences) аналогично тому, как и для линии злокачественных клеток. Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 5×10⁵клеток/мл. Суспензию PBMC распределяли по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning), в который была распределена линия злокачественных клеток, в зависимости от условий.

Для идентификации эффекта уничтожения клеток, реагент CytoTox Green (INCUCYTE^TM CytoTox Green, Satorius), который связывается с ДНК клеток, подлежащих уничтожению, приготавливали в 1 мкл на 1 мл среды RPMI1640, содержавшей 5% сыворотки AB человека (Sigma). Полученную среду использовали для разбавления тестируемого вещества, и эффект уничтожения клеток можно было количественно идентифицировать путем окрашивания клеток, подлежащих уничтожению, при сокультивировании тестируемого вещества с линиями злокачественных клеток и PBMC.

Тестируемое вещество талазопариб разбавляли с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечной концентрации 0,57 нМ (50 мкл) на лунку 96-луночного микропланшета. GI-101 разбавляли 1/3 с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечных концентрациях 0,4 нМ, 1,2 нМ, 3,7 нМ, 11,1 нМ, 33,3 нМ и 100 нМ по 50 мкл на лунку 96-луночного микропланшета.

Полученное тестируемое вещество помещали в каждую лунку 96-луночного микропланшета, в которой линии злокачественных клеток и PBMC были распределены в зависимости от условий, и культивировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 24 часов, и пролиферацию или гибель злокачественных клеток наблюдали посредством оборудования для анализа визуализации клеток в реальном времени IncuCyte S3 (Satorious). Гибель злокачественных клеток количественно определяли по интегрированной интенсивности клеток, окрашенных в зеленый цвет с использованием реагента CytoTox Green.

В результате, было идентифицировано, что группа, в которой вводили комбинацию GI-101 и талазопариба, продемонстрировала превосходный эффект уничтожения злокачественных клеток по сравнению с группой, в которой вводили каждое лекарственное средство отдельно.

X. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и ингибитора ДНК-метилтрансферазы

Экспериментальный пример 31. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и гуадецитабина у мышей с трансплантированными клетками рака ободочной и прямой кишки мыши

Этот тест был предназначен для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с гуадецитабином, который ингибирует метилирование ДНК, в модели опухоли с аллотрансплантированными клетками CT26 (клетки карциномы толстой кишки мыши) мышам BALB/c.

Клетки CT26 приобретали от ATCC (США) и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 5×10⁵ клеток CT26 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей BALB/c (в возрасте 8 недель) (фиг.97).

Трансплантаты опухолей мышей идентифицировали приблизительно через 7 суток после инокуляции клеток и мышей случайным образом распределяли на группы, исходя из объема опухоли (50-120 мм³), причем каждая группа включала 13 мышей. Как показано в таблице 22, были сформированы тестируемые группы и проводили введение тестируемых веществ.

[Таблица 22]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/в QW (один раз/неделя) - мг/кг 13 G2 mGI-101 в/в QW (один раз/неделя) 0,6 мг/кг 13 G3 mGI-101 в/в QW (один раз/неделя) 3 мг/кг 13 G4 Гуадецитабин в/б Всего 4 раза, 4 дня подряд 50 мкг 13 G5 mGI-101+гуадецитабин в/в+в/б mGI-101: QW (один раз/неделя),
гуадецитабин: всего 4 раза, 4 дня подряд 0,6 мг/кг+50 мкг 13 G6 mGI-101+гуадецитабин в/в+в/б 3 мг/кг+50 мкг 13

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных, и мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал 4000 мм³. Размер солидной злокачественной опухоли CT26 определяли с использованием 3D-сканнера опухоли (TM900, Peria, Бельгия). Для каждой экспериментальной группы вычисляли среднее снижение массы тела и процентное изменение массы тела, и среднее ингибирование роста опухоли. Противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя. Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа, а затем критерия множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты размера опухоли при введении mGI-101 отдельно или в комбинации с гуадецитабином против опухоли CT26 представлены на фиг. 97 и 100. В результате измерения размера опухоли в группе, в которой вводили лекарственное средство наблюдали противораковый эффект по сравнению с контролем, и группа, в которой вводили комбинацию mGI-101 и гуадецитабина, продемонстрировала более превосходный эффект ингибирования роста опухоли по сравнению с группой, в которой вводили mGI-101 отдельно. Размер опухоли в группе, в которой вводили комбинацию mGI-101 (3 мг/кг) + гуадецитабин на 7 сутки после начала введения тестируемого вещества, был на статистически значимом уровне более низким, чем в контрольной группе (p<0,05). На 10 сутки после начала тестируемого вещества уровень размера опухоли в группе, в которой вводили mGI-101 (0,6 мг/кг) отдельно, имел тенденцию к тому, чтобы быть более низким, чем в контрольной группе, и уровень размера опухоли в группе, в которой вводили mGI-101 (3 мг/кг) отдельно, был на статистически значимом уровне более низким, чем в контрольной группе (p<0,05). Уровни размера опухоли в группе, в которой вводили комбинацию mGI-101 (0,6 мг/кг) + гуадецитабин, и в группе, в которой вводили комбинацию mGI-101 (3 мг/кг) + гуадецитабин, были на статистически значимом уровне более низкими, чем в контрольной группе (p<0,01, p<0,001).

Индивидуальные размеры опухолей для каждой тестируемой группы представлены на фиг.99 и 102. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей, группа, в которой вводили mGI-101 отдельно, также продемонстрировала эффект ингибирования роста опухоли, и группа, в которой вводили комбинацию mGI-101 и гуадецитабина, продемонстрировала наиболее превосходный эффект ингибирования роста опухоли.

В конце эксперимента результаты для мышей со степенью ингибирования роста опухоли 30%, 50% или 80% или более являются такими, как на фиг.99 и 101. Было идентифицировано, что наибольшее количество особей со степенью ингибирования роста опухоли 30%, 50%, 80% или более было в группе, в которой вводили комбинацию mGI-101 (3 мг/кг) + гуадецитабин.

XI. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и противоракового химиотерапевтического средства (антинеопластическое и цитотоксическое средство)

Экспериментальный пример 32. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101, антитела против PD-L1 и доцетаксела мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы мыши

Этот эксперимент проводили для оценки противораковой эффективности при введении тестируемого вещества mGI-101 отдельно или в комбинации с доцетакселом (Selleck Chemicals, каталожный номер № S1148) и антителом против PD-L1 (BioXcell, каталожный номер № BE0101) в модели опухоли с аллотрансплантацией клеток 4T1 (клетки рака молочной железы мыши) у мышей BALB/c.

Клетки 4T1 приобретали в ATCC (США) и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем получали клеточную суспензию в PBS и ее хранили на льду до инъекции мышам. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью после идентификации положения второй жировой подушки молочной железы верхней правой части области живота самок мышей BALB/c (в возрасте 8 недель), подготовленную линию клеток 4T1 инъецировали в жировую подушку в количестве 4×10⁴ клеток/40 мкл/животное.

Через определенный период времени после инокуляции трансплантатов опухоли мышам объем опухоли определяли для животных без нарушений состояния здоровья, и животных случайным образом отбирали так, чтобы средний размер опухоли в каждой группе достигал менее 70-100 мм³, и отобранных животных распределяли на группы настолько равномерно, насколько это было возможно, исходя из объема опухоли и массы тела, причем каждая группа включала 10 животных. Как показано в таблице 23, были сформированы тестируемые группы и проводилось введение тестируемых веществ.

Доцетаксел растворяли в 100% DMSO, а затем объем доводили посредством 5% DMSO, 30% ПЭГ300, 5% Tween 80 и 60% дистиллированной воды для инъекций (DMSO:PEG300:Tween 80:дистиллированная вода для инъекций=5%:30%:5%:60% (об.:об.:об.:об.)) и подготавливали.

Антитело против PD-L1 подготавливали и вводили с использованием 1X PBS с учетом дозировки и объема.

[Таблица 23]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/б QW (один раз/неделя) - мг/кг 10 G2 mGI-101+aPD-L1 в/б+в/б mGI-101: QW (один раз/неделя),
aPD-L1: QW (один раз/неделя),
Доцетаксел: QW (один раз/неделя) 3 мг/кг+10 мг/кг 10 G3 Доцетаксел в/б 15 мг/кг 10 G4 Доцетаксел+mGI-101+aPD-L1 в/б+в/б+в/б 15 мг/кг+3 мг/кг+10 мг/кг 10

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных, и мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал 4000 мм³. Размер солидной злокачественной опухоли 4T1 определяли два раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием толщиномера (Digital caliper, Mitutoyo, Япония), и объем опухоли (TV) и степень ингибирования роста опухоли (TGI) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения, и противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя.

Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

После введения mGI-101 отдельно или в комбинации с доцетакселом и антителом против PD-L1 мышам с трансплантированными клетками рака молочной железы мыши, результаты определения размера опухоли представлены на фиг.103. В результате измерения размера опухоли на 14 сутки после введения тестируемого вещества по сравнению с контролем наблюдали статистически значимый противораковый эффект в группе, в которой вводили доцетаксел, и в группе, в которой вводили комбинацию доцетаксел+mGI-101+aPD-L1 (p<0,05, p<0,01).

Индивидуальные размеры опухолей для каждой тестируемой группы представлены на фиг.105.

На фиг.104 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI-101 вводили отдельно или в комбинации с доцетакселом и анителом против PD-L1 у мышей с трансплантированными 4T1, в конце теста. Контроль в виде носителя продемонстрировал степень ингибирования роста опухоли 30% или более, 50% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили комбинацию mGI-101+aPD-L1, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 1 мыши, и 50% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили доцетаксел, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более 5 мышей, и 50% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили комбинацию доцетаксела+mGI-101+aPD-L1, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 6 мышей, и 50% или более у 2 мышей.

Экспериментальный пример 33. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и паклитаксела у мышей с трансплантированными клетками рака молочной железы

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с паклитакселом в модели опухоли с аллотрансплантацией клеток EMT6 (клетки рака молочной железы мыши) у мышей BALB/c.

Клетки EMT6 приобретали от ATCC (США) и культивировали в среде Waymouth MB 751/1 (WELGENE), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем получали суспензию клеток в высокой концентрации (2×10⁶ клеток/0,4 мл) для 10 мышей в PBS и хранили на льду до инъекции мышам. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью кожу надрезали в области 4-го соска в верхней правой части области живота самок мышей BALB/c (в возрасте 7 недель), и положение жировой подушки молочной железы в области надреза идентифицировали, а затем подготовленную клеточную линию EMT6 инъецировали в жировую подушку молочной железы в количестве 2×10⁵ клеток/40 мкл/животное.

Через определенный период времени после инокуляции трансплантатов опухоли мышам объем опухоли определяли для животных без нарушений состояния здоровья, и животных случайным образом отбирали так, чтобы средний размер опухоли в каждой группе достигал менее 70-100 мм³, и отобранных животных распределяли на группы настолько равномерно, насколько это было возможно, исходя из объема опухоли и массы тела, причем каждая группа включала 10 животных. Как показано в таблице 24 и на фиг.106, были сформированы тестируемые группы и проводилось введение тестируемых веществ.

[Таблица 24]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/в QW (один раз/неделя) - мг/кг 10 G2 mGI-101 в/в QW (один раз/неделя) 3 мг/кг 10 G3 Паклитаксел (PTX) в/б Всего 7 раз, 7 дней подряд 10 мг/кг 10 G4 mGI-101+паклитаксел в/в+в/б QW (один раз/неделя) + всего 7 раз, 7 дней подряд 3 мг/кг+10 мг/кг 10

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных, и мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал 4000 мм³. Размер солидной злокачественной опухоли EMT6 определяли два раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием толщиномера (Digital caliper, Mitutoyo, Япония), и объем опухоли (TV) и степень ингибирования роста опухоли (TGI) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения, и противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя.

Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты размера опухоли после введения mGI-101 отдельно или в комбинации с паклитакселом против опухоли EMT6 представлены на фиг.107. В результате измерения размера опухоли в группе, в которой вводили лекарственное средство, наблюдали противораковый эффект по сравнению с контролем, и уровень размера опухоли в группе, в которой вводили mGI-101 отдельно и в комбинации с паклитакселом на 11 сутки после начала введения вещества, был на статистически значимом уровне более низким, чем в контрольной группе (p<0,01, p<0,001). Размер опухоли во всех из группы, в которой вводили паклитаксел, группы, в которой вводили mGI-101 отдельно, и групп, в которой вводили комбинацию mGI-101 и паклитаксел на 13 сутки после начала введения вещества, был на статистически значимом уровне более низким, чем в контрольной группе (p<0,05, p<0,01, p<0,0001).

Индивидуальные размеры опухолей для каждой тестируемой группы представлены на фиг.109. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей, на 13 сутки после начала введения тестируемого вещества группа, в которой вводили mGI-101 отдельно, продемонстрировала полную ремиссию у 2 мышей, и группа, в которой вводили комбинацию mGI-101 и паклитаксела, продемонстрировала полную ремиссию у 1 мыши.

На фиг.108 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI-101 и паклитаксел вводили в комбинации мышам с трансплантированными EMT6. Контроль в виде носителя продемонстрировал степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 2 мышей, 50% или более у 1 мыши, и 80% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили mGI-101, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 6 мышей, 50% или более у 5 мышей и 80% или более у 5 мышей. Группа, в которой вводили паклитаксел, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 7 мышей, 50% или более у 4 мышей, и 80% или более у 2 мышей. Группа, в которой вводили комбинацию mGI-101+паклитаксел, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 7 мышей, 50% или более у 5 мышей, и 80% или более у 4 мышей.

XII. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации: mGI-101+антитело против PD-1+пеметрексед+цисплатин (химиотерапия, поддерживающая терапия)

Экспериментальный пример 34. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и противоракового химиотерапевтического средства и антитела против PD-1 у мышей с трансплантированными клетками рака легкого мыши

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после внутрибрюшинного введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с противораковым химиотерапевтическим средством цислпатином (Selleck Chemicals, каталожный номер № S1166), пеметрекседом (Selleck Chemicals, каталожный номер № S1135) и антителом против PD-1 (BioXcell, каталожный номер № BE0146) в качестве стандартного химиотерапевтического средства в модели опухоли с аллотрансплантированными клетками TC1, клеточной линией рака легкого, мышам C57BL/6. Клеточную линию рака легкого мышей TC1 приобретали от ATCC (США) и использовали для тестирования.

Клетки TC1 культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем 1×10⁶ клеток TC1 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей C57BL/6 (в возрасте 7 недель) для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью.

Мышей случайным образом распределяли на группы, исходя из объема опухоли (~100 мм³), причем каждая группа включала от 13 до 19 мышей. Трансплантаты опухоли идентифицировали приблизительно через 2 суток после инокуляции клеток. Были сформированы тестируемые группы, как показано в таблице 25, и тестируемые вещества вводили по схеме, представленной на фиг.110.

Тест был разделен на лечение 1-й линии и противораковую поддерживающую терапию. Для лечения 1-й линии цисплатин (CDDP) в дозе 5 мг/кг, пеметрексед в дозе 100 мг/кг и антитело против PD-1 в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно вводили два раза в неделю, соответственно, и в случае группы, в которой вводили комбинацию с mGI-101, ее внутрибрюшинно вводили один раз в неделю, т.е. всего 3 раза, в дозе 3 мг/кг.

При противораковой поддерживающей терапии mGI-101 вводили отдельно или mGI-101 вводили в комбинации с противораковым химиотерапевтическим средством и антителом против PD-1.

[Таблица 25]

Экспериментальная группа Путь введения, курс дозирования Дозировка Количество животных G1 IgG4 мыши в/б BIW 3 мг/кг 13 G2 1) 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
2) поддерживающая терапия: пеметрексед+антитело против PD-1 mGI-101: в/б QW
цисплатин: в/б BIW
пеметрексед: в/б BIW
антитело против PD-1: в/б BI mGI-101: 3 мг/кг
цисплатин: 5 мг/кг
пеметрексед: 100 мг/кг
антитело против PD-1: 10 мг/k 19 G3 1) 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
2) поддерживающая терапия: пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101 13 G4 1) 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
2) поддерживающая терапия: mGI-101 13 G5 1) 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101
2) поддерживающая терапия: пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101 15

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных, и мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал 4000 мм³. Размер солидной злокачественной опухоли TC1 определяли с использованием 3D-сканнера опухоли (TM900, Peria, Бельгия). Для каждой экспериментальной группы вычисляли среднее снижение массы тела и процентное изменение массы тела, и среднее ингибирование роста опухоли. Противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде IgG4 мыши. Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа, а затем критерия множественных сравнений Бонферрони. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты введения mGI-101 отдельно или в комбинации с противораковым химиотерапевтическим средством и антителом против PD-1 против опухоли TC1 представлены на фиг.111. Противораковый эффект наблюдали в группе, в которой вводили лекарственное средство, по сравнению с контролем, и отличие размера опухоли было заметным в ходе периода тестирования 24 суток. В случае лечения 1-й линии, группа, в которой вводили mGI-101 в комбинации с противораковым химиотерапевтическим средством и антителом против PD-1, продемонстрировала лучший эффект ингибирования роста опухоли, чем группа, в которой вводили только противораковое химиотерапевтическое средство и антитело против PD-1. В случае противораковой поддерживающей терапии группа, в которой вводили mGI-101 отдельно, продемонстрировала такой же противораковый эффект, как и группа, в которой вводили противораковое химиотерапевтическое средство и антитело против PD-1, и группа, в которой вводили mGI-101 в комбинации с противораковым химиотерапевтическим средством и антителом против PD-1, продемонстрировала лучший эффект ингибирования роста опухоли.

Индивидуальные размеры опухоли для каждой тестируемой группы представлены на фиг.112-117. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей при лечении 1-й линии и противораковой поддерживающей терапии, группа, в которой вводили комбинацию с mGI-101, продемонстрировала наилучший эффект ингибирования роста опухоли.

На фиг.118 проиллюстрирован результат, полученный путем анализа выживаемости мышей при введении комбинации mGI-101 в ходе лечения 1-й линии и противораковой поддерживающей терапии у мышей с трансплантированными клетками TC1. В ходе лечения 1-й линии и противораковой поддерживающей терапии была идентифицирована выживаемость 100% в группе, в которой вводили комбинацию с mGI-101. Средняя масса тела для каждой тестируемой группы представлена в таблице 26.

[Таблица 26]

Лечение Масса тела (г) по суткам Лечение -2 1 3 5 7 10 12 13 15 20 23 26 1 IgG4 мыши Среднее значение 17,58 17,74 18,24 17,58 17,80 18,23 18,02 18,94 19,62 20,30 21,26 20,48 1 IgG4 мыши SEM 1,00 1,07 0,95 1,14 1,08 1,09 1,01 1,08 1,32 1,35 1,61 1,71 2 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
Поддерживающая: пеметрексед+антитело против PD-1 Среднее значение 17,58 17,81 18,13 17,24 17,41 18,10 17,77 18,57 19,29 20,42 20,69 20,61 2 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
Поддерживающая: пеметрексед+антитело против PD-1 SEM 0,82 0,77 0,98 0,94 1,15 1,56 1,47 1,56 1,71 1,91 2,01 1,61 3 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
поддерживающая: пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101 Среднее значение 17,42 17,73 18,06 17,42 17,78 18,54 18,11 19,01 19,23 19,72 20,28 20,18 3 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
Поддерживающая: пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101 SEM 1,25 1,08 1,39 1,66 1,70 1,57 1,42 1,70 1,44 1,88 1,88 1,90 4 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
поддерживающая: mGI-101 Среднее значение 17,10 17,70 17,58 16,58 16,83 17,41 17,49 18,06 18,67 19,29 19,18 19,15 4 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
поддерживающая: mGI-101 SEM 1,05 1,04 1,04 1,18 1,19 1,02 1,02 1,22 1,39 1,23 1,63 1,59 5 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101
поддерживающая: пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101 Среднее значение 17,53 18,64 18,92 18,72 18,71 19,82 19,67 20,59 20,76 21,56 21,85 20,50 5 1-я линия: цисплатин+пеметрексед+антитело против PD-1
поддерживающая: пеметрексед+антитело против PD-1+mGI-101 SEM 0,99 0,85 1,01 0,96 0,89 1,18 1,15 0,94 1,34 1,67 1,69 0,71

XIII. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и антитела против HER

Экспериментальный пример 35. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации GI-101 и трастузумаба

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с герцептином (трастузумаб) в модели опухоли с ксенотрансплантированными клетками BT-474 (клетки рака молочной железы мыши) у мышей BALB/c nu/nu.

Клетки BT-474 приобретали от ATCC (США) и культивировали в среде RPMI1640 (Welgene), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем клеточную линию подготавливали путем разведения в среде до концентрации 5,0×10⁶ клеток/0,05 мл.

Для подготовки модели с ксенотрансплантированной опухолью из клеток BT-474, их подкожно инъецировали в левый бок самок мышей BALB/c nu/nu (в возрасте 7 недель) путем оттягивания кожи мышей для обеспечения пространства с использованием троакара для трансплантации шариков (MP-182, Innovative Research of America, США), так чтобы он находился под кожей левого бока. Через 7 суток после инъекции эстрогеновых шариков подготовленную суспензию клеток BT-474 (5×10⁶ клеток/0,05 мл) распределяли и добавляли 0,05 мл свободного от фенолового красного матрикса MATRIGEL (356237, BD), и полученным раствором заполняли одноразовый шприц и проводили трансплантацию раствора посредством подкожного введения в количестве 0,1 мл/животное в правой области спины животных.

Через определенный период времени после инокуляции трансплантатов опухоли мышам объем опухоли определяли для животных без нарушений состояния здоровья, и животных случайным образом отбирали так, чтобы средний размер опухоли в каждой группе достигал менее 60-120 мм³, и отобранных животных распределяли на группы настолько равномерно, насколько это было возможно, исходя из объема опухоли и массы тела, причем каждая группа включала 10 животных. Как показано в таблице 27, были сформированы тестируемые группы и проводилось введение тестируемых веществ.

[Таблица 27]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/в QW (один раз/неделя) - мг/кг 10 G2 mGI-101 в/в QW (один раз/неделя) 3 мг/кг 10 G3 Герцептин в/б QW (один раз/неделя) 1 мг/кг 10 G4 mGI-101+герцептин в/в+в/б mGI-101: QW (один раз/неделя), Герцептин: QW (один раз/неделя) 3 мг/кг+1 мг/кг 10

Клинические симптомы, такие как заболевание и изменение поведения, наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и идентифицировали умерших животных, и мышей умерщвляли, когда размер опухоли достигал 4000 мм³. Размер солидной злокачественной опухоли определяли два раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием толщиномера (Digital caliper, Mitutoyo, Япония), и объем опухоли (TV) и степень ингибирования роста опухоли (TGI) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения.

Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты измерения размера опухоли после введения mGI-101 отдельно или в комбинации с герцептином мышам, которым были трансплантированы клетки рака молочной железы, представлены на фиг.119. В случае группы, в которой вводили mGI-101 отдельно, было показано статистически значимое уменьшение размера опухоли на 28 сутки после начала введения тестируемого вещества по сравнению с контролем в виде носителя (p<0,05). В случае группы, в которой вводили герцептин отдельно, статистически значимое снижение размера опухоли было показано на 14 сутки, 18 сутки и 21 сутки после начала введения тестируемого вещества по сравнению с контролем в виде носителя (в случае 14 суток и 18 суток, p<0,05; в случае 21 суток, p<0,01), однако размер опухоли имел тенденцию к быстрому увеличению на 25 сутки и 28 сутки. В случае введения в группе комбинации mGI-101+герцептин, статистически значимое уменьшение размера опухоли было показано с 14 суток по 28 сутки после начала введения тестируемого вещества по сравнению с контролем в виде носителя, и статистически значимое уменьшение размера опухоли было показано на 28 сутки после начала введения тестируемого вещества по сравнению в группой, в которой вводили герцептин отдельно (p<0,01).

Индивидуальные размеры опухолей для каждой тестируемой группы представлены на фиг.121. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей, группа, в которой вводили тестируемое вещество, продемонстрировала эффект ингибирования роста опухоли по сравнению с контролем в виде носителя и, в частности, группа, в которой вводили комбинацию mGI-101+герцептин, продемонстрировала эффект ингибирования роста опухоли по сравнению с группой, в которой вводили mGI-101 отдельно.

На фиг.120 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI-101 вводили отдельно или в комбинации с герцептином у мышей с опухолью, которым были трансплантированы BT-474, в конце теста. Контроль в виде носителя продемонстрировал степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 3 мышей, 50% или более у 3 мышей, и 80% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили mGI-101 отдельно, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 5 мышей, 50% или более у 1 мыши, и 80% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили герцептин отдельно, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 3 мышей, 50% или более у 2 мышей и 80% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили комбинацию mGI-101+герцептин, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 5 мышей, 50% или более у 4 мышей и 80% или более ни у одной из мышей.

Экспериментальный пример 36. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации GI-101 и пертузумаба

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством обработки клеток HCT116 (клетки рака толстого кишечника человека) тестируемым веществом GI-101 отдельно или в комбинации с пертузумабом в условиях in vitro.

Клетки HCT116 приобретали в банке клеточных линий Кореи и культивировали в среде МакКоя 5A (ATCC), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Для применения в тесте уничтожения злокачественных клеток клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в среде МакКоя 5A, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences). Клетки, суспендированные в среде МакКоя 5A, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой преобразовывали в суспензию 2×10⁵клеток/мл с использованием свободной от FBS среды RPMI1640. Суспензию злокачественных клеток окрашивали при 37°C в течение 1 часа с использованием CELLTRACKER^TM Deep Red Dye (Thermo) для отслеживания пролиферации или ингибирования пролиферации злокачественных клеток. После окрашивания их центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут, а затем их промывали свободной от FBS средой RPMI1640, а затем суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 2×10⁵клеток/мл. Суспензию злокачественных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning) по 50 мкл (1×10⁴ клеток), а затем стабилизировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 1 часа.

Для идентификации эффекта тестируемого вещества в отношении уничтожения злокачественных клеток через антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), натуральные киллеры (NK-клетки) выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека с использованием набора для выделения CD56+CD16+ NK-клеток (Miltenyi Biotec) и использовали. В выделенных NK-клетках погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences) аналогично тому, как и для линии злокачественных клеток. Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образованный посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 2×10⁵клеток/мл. Суспензию PBMC распределяли по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning), в который была распределена линия злокачественных клеток, в зависимости от условий.

Для идентификации эффекта уничтожения клеток, реагент CytoTox Green (INCUCYTE^TM CytoTox Green, Satorius), который связывается с ДНК клеток, подлежащих уничтожению, приготавливали в 1 мкл на 1 мл среды RPMI1640, содержавшей 5% сыворотки AB человека (Sigma). Полученную среду использовали для разбавления тестируемого вещества, и эффект уничтожения клеток можно было количественно идентифицировать путем окрашивания клеток, подлежащих уничтожению, при сокультивировании тестируемого вещества с линиями злокачественных клеток и PBMC.

Пертузумаб разбавляли с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечной концентрации 16,9 нМ (50 мкл) на лунку 96-луночного микропланшета.

GI-101 разбавляли 1/3 с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечных концентрациях 0,4 нМ, 1,2 нМ, 3,7 нМ, 11,1 нМ, 33,3 нМ и 100 нМ по 50 мкл на лунку 96-луночного микропланшета.

Полученное тестируемое вещество помещали в каждую лунку 96-луночного микропланшета, в которой линии злокачественных клеток и PBMC были распределены в зависимости от условий, и культивировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 24 часов, и пролиферацию или гибель злокачественных клеток наблюдали посредством оборудования для анализа визуализации клеток в реальном времени IncuCyte S3 (Satorious). Гибель злокачественных клеток количественно определяли по интегрированной интенсивности клеток, окрашенных в зеленый цвет с использованием реагента CytoTox Green.

На фиг.122 проиллюстрированы результаты, полученные путем измерения степени уничтожения злокачественных клеток после обработки клеток HCT116 посредством GI-101 в концентрации 0,4 нМ, 1,2 нМ, 3,7 нМ, 11,1 нМ, 33,3 нМ и 100 нМ, соответственно. В случае сокультивирования только злокачественных клеток и NK-клеток и в случае обработки только пертузумабом, эффект уничтожения злокачественных клеток не был показан, как и в случае культивирования только злокачественных клеток. В случае обработки GI-101 отдельно и комбинацией GI-101+пертузумаб был показан превосходный эффект уничтожения злокачественных клеток, и в случае комбинации GI-101+пертузумаб был показан наилучший эффект уничтожения злокачественных клеток.

XIV. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и ингибитора CDK4/6

Экспериментальный пример 37. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и абемациклиба

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта ингибирования роста опухоли после введения mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с абемациклибом в модели опухоли с аллотрансплантацией клеток 4T1 (клетки рака молочной железы мыши) у мышей BALB/c.

Клетки 4T1 приобретали в ATCC (США) и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Культивируемые клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в PBS. Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 1×10⁵ клеток 4T1 подкожно инъецировали в правый бок самок мышей BALB/c (в возрасте 8 недель). Основные симптомы наблюдали один раз в сутки в ходе приживления и периода роста после трансплантации клеточной линии.

Через определенный период времени после инокуляции трансплантатов опухоли мышам объем опухоли определяли для животных без нарушений состояния здоровья, и мышей случайным образом выбирали и распределяли, причем каждая группа включала 11 мышей. Как показано в таблице 28, были сформированы тестируемые группы и проводилось введение тестируемых веществ.

[Таблица 28]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) в/б QW (один раз/неделя) - мг/кг 11 G2 mGI-101 в/б BIW (2 раза/неделя) 3 мг/кг 11 G3 Абемациклиб p.o. 6 раз/неделя 50 мг/кг 11 G4 mGI-101+абемациклиб в/б+p.o. mGI-101: BIW (2 раза/неделя), абемациклиб: 6 раз/неделя 3 мг/кг+50 мг/кг 11

Смерть мышей, тип основных симптомов, дата их появления и тяжесть симптомов наблюдали один раз в сутки в ходе периода тестирования, и регистрировали для каждой особи. Размер солидной злокачественной опухоли Renca определяли два раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием толщиномера (Digital caliper, Mitutoyo, Япония), и объем опухоли (TV) и степень ингибирования роста опухоли (TGI) вычисляли путем подстановки их в следующие уравнения.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

[Уравнение 2]

%TGI (Ингибирование роста опухоли)=(1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)) × 100

В качестве величины, измеряемой в момент распределения на группы, был выбран объем опухоли каждой особи до введения, и противоопухолевую эффективность оценивали по сравнению с контролем в виде носителя.

Все статистические вычисления проводили с использованием Prism 8.0 (Graph Pad Software Inc, США). Сравнение показателей объема опухоли проводили посредством двухстороннего дисперсионного анализа с последующим критерием множественных сравнений Тьюки. Значимым считали значение p менее 0,05.

Результаты определения размера опухоли после введения mGI-101 отдельно или в комбинации с абемациклибом мышам с клетками рака молочной железы представлены на фиг.123. В случае группы, в которой вводили комбинацию mGI-101 (BIW) + абемациклиб, тенденция ингибирования роста опухоли была наивысшей.

Индивидуальные размеры опухоли для каждой тестируемой группы представлены на фиг.125. Согласно результатам размеров индивидуальных опухолей, группа, в которой вводили комбинацию mGI-101 (BIW) + абемациклиб, продемонстрировала наибольший эффект ингибирования роста опухоли.

На фиг.124 проиллюстрирована степень ингибирования роста опухоли, когда mGI-101 и абемациклиб вводили в комбинации мышам, которым были трансплантированы 4T1. Контроль в виде носителя продемонстрировал степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 3 мышей, и 50% или более и 80% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили mGI-101 (BIW), продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 3 мышей, 50% или более у 1 мыши, и 80% или более ни у одной из мышей. Группа, в которой вводили абемациклиб, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 4 мышей, 50% или более у 1 мыши, и 80% или более у 1 мыши. Группа, в которой вводили комбинацию mGI-101 (BIW) + абемациклиб, продемонстрировала степень ингибирования роста опухоли 30% или более у 7 мышей, 50% или более у 5 мышей, и 80% или более у 1 мыши.

Экспериментальный пример 38. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и рибоциклиба

Этот эксперимент проводили для оценки эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством обработки клеток MDA-MB-231 (клетки рака молочной железы человека) тестируемым веществом GI-101 отдельно или в комбинации с ингибитором рибоциклибом в условиях in vitro.

Клетки MDA-MB-231 приобретали в банке клеточных линий Кореи и культивировали в среде RPMI1640 (Gibco), содержавшей 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco). Для применения в тесте уничтожения злокачественных клеток клетки собирали с использованием трипсина (Gibco), а затем суспендировали в среде RPMI1640, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences). Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой преобразовывали в суспензию 2×10⁵клеток/мл с использованием свободной от FBS среды RPMI1640. Суспензию злокачественных клеток окрашивали при 37°C в течение 1 часа с использованием CELLTRACKER^TM Deep Red Dye (Thermo) для отслеживания пролиферации или ингибирования пролиферации злокачественных клеток. После окрашивания их центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут, а затем их промывали свободной от FBS средой RPMI1640, а затем суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 2×10⁵клеток/мл. Суспензию злокачественных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning) по 50 мкл (1×10⁴ клеток), а затем стабилизировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 1 часа.

Мононуклеарные клетки периферической крови человека (PBMC) использовали для идентификации эффекта уничтожения злокачественных клеток посредством GI-101. PBMC человека приобретали от Zen-Bio, и PBMC, хранившиеся замороженными, помещали на водяную баню при 37°C и размораживали настолько быстро, насколько это было возможно, а затем переносили в среду RPMI1640 (Gibco), содержавшую 10% FBS (Gibco) и 1% антибиотик/противогрибковое средство (Gibco), и центрифугировали при 1300 об/мин в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, а затем погибшие клетки и дебрис удаляли с использованием раствора Ficoll (GE Healthcare Life Sciences) аналогично тому, как и для линии злокачественных клеток. Клетки, суспендированные в среде RPMI1640, осторожно наслаивали на раствор ficoll. Клеточный слой с низкой удельной плотностью, образовавшийся посредством центрифугирования при комнатной температуре при 350×g в течение 20 минут, собирали пипеткой, промывали PBS (Gibco), а затем центрифугировали при комнатной температуре при 350×g в течение 5 минут. Отделенный клеточный слой суспендировали в среде RPMI1640, содержавшей 5% сыворотку AB человека (Sigma), до концентрации 5×10⁵клеток/мл. Суспензию PBMC распределяли по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного микропланшета (Corning), в который была распределена линия злокачественных клеток, в зависимости от условий.

Для идентификации эффекта уничтожения клеток реагент CytoTox Green (INCUCYTE^TM CytoTox Green, Satorius), который связывается с ДНК клеток, подлежащих уничтожению, приготавливали в 1 мкл на 1 мл среды RPMI1640, содержавшей 5% сыворотки AB человека (Sigma). Полученную среду использовали для разбавления тестируемого вещества, и эффект уничтожения клеток можно было количественно идентифицировать путем окрашивания клеток, подлежащих уничтожению, при сокультивировании тестируемого вещества с линиями злокачественных клеток и PBMC.

Тестируемое вещество рибоциклиб разбавляли с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечной концентрации 913 нМ (50 мкл) на лунку 96-луночного микропланшета. GI-101 разбавляли 1/3 с использованием среды RPMI1640, содержавшей реагент CytoTox Green, а затем использовали в эксперименте в конечной концентрации 100 нМ по 50 мкл на лунку 96-луночного микропланшета.

Полученное тестируемое вещество помещали в каждую лунку 96-луночного микропланшета, в которой линии злокачественных клеток и PBMC были распределены в зависимости от условий, и культивировали в инкубаторе (37°C, 5% CO₂) в течение 24 часов, и пролиферацию или гибель злокачественных клеток наблюдали посредством оборудования для анализа визуализации клеток в реальном времени IncuCyte S3 (Satorious). Гибель злокачественных клеток количественно определяли по интегрированной интенсивности клеток, окрашенных в зеленый цвет с использованием реагента CytoTox Green.

На фиг.126 проиллюстрирован эффект уничтожения злокачественных клеток в условиях GI-101 при 100 нМ. В случае сокультивирования только злокачественных клеток и PBMC, был идентифицирован эффект уничтожения злокачественных клеток, и он имел более высокую тенденцию, чем при обработке GI-101 отдельно. В случае обработки рибоциклибом отдельно или обработки комбинацией GI-101+рибоциклиб, был показан превосходный эффект уничтожения злокачественных клеток по сравнению со случаем сокультивирования только злокачественных клеток и PBMC, и в случае обработки комбинацией GI-101+рибоциклиб был показан наилучший эффект уничтожения злокачественных клеток.

XV. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации димерного слитого белка и агониста STING

Экспериментальный пример 39. Идентификация противоракового эффекта при введении комбинации mGI-101 и DMXAA

Этот эксперимент проводили для оценки противораковой эффективности при введении mGI-101 в качестве тестируемого вещества отдельно или в комбинации с веществом DMXAA, агонистом STING, в модели опухоли с аллотрансплантацией клеток MC38 (клетки рака толстого кишечника мыши) мышам C57BL/6.

Для подготовки модели с аллотрансплантированной опухолью 5×10⁵ клеток MC38 подкожно инъецировали мышам C57BL/6. У мышей идентифицировали размер трансплантатов опухолей 100-200 мм³ приблизительно через 10 суток после инокуляции клеток, и мышей распределяли на группы, причем каждая группа включала 5 мышей. Были сформированы тестируемые группы, как показано в таблице 29, и тестируемые веществ вводили по схеме, представленной на фиг.127.

[Таблица 29]

Экспериментальная группа Путь введения Курс дозирования Дозировка Количество животных G1 Контроль в виде носителя (PBS) mGI-101: BIW (2 раза/неделя),
DMXAA: сутки 10 и 13 - мг/кг 5 G2 mGI-101 в/б 6 мг/кг 5 G3 DMXAA и/т 450 мкг 5 G4 mGI-101+DMXAA в/б+и/т 6 мг/кг+450 мкг 5

Размер солидной злокачественной опухоли MC38 определяли три раза в неделю в ходе периода наблюдения, и большую ось (максимальная длина, L) и меньшую ось (перпендикулярная ширина, W) опухоли измеряли с использованием толщиномера, и объем опухоли (TV) вычисляли путем подстановки их в следующее уравнение, и, когда размер опухоли достигал не менее 2 см, мышей умерщвляли.

[Уравнение 1]

TV (мм³)=(W² × L)/2

Выживаемость при введении mGI-101 отдельно или в комбинации с веществом DMXAA против опухоли MC38 представлена на фиг.128. В случае контроля в виде носителя все мыши погибли до момента 40 суток после инъекции опухоли. В случае группы, в которой вводили только mGI-101 выживаемость на 60 сутки после инъекции опухоли составила 20%; и в случае группы, в которой вводили DMXAA, агонист STING, отдельно, выживаемость на 60 сутки после инъекции опухоли составила 60%; и в случае группы, в которой вводили комбинацию mGI-101+DMXAA, выживаемость на 60 сутки после инъекции опухоли составила 80%, что указывает на то, что выживаемость была более высокой, чем в других группах.

Индивидуальные размеры опухолей для каждой тестируемой группы представлены на фиг.129-133. Группа, в которой вводили комбинацию mGI-101+DMXAA, продемонстрировала наибольший эффект ингибирования роста опухоли.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GI Innovation, Inc.

<120> ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ,

СОДЕРЖАЩАЯ СЛИТЫЙ БЕЛОК, СОДЕРЖАЩИЙ БЕЛОК IL-2 И БЕЛОК CD80, И

ПРОТИВОРАКОВОЕ СРЕДСТВО

<130> POPB214532PCT

<150> KR 10-2020-0033233

<151> 2020-03-18

<150> KR 10-2021-0020708

<151> 2021-02-16

<160> 39

<170> KopatentIn 3.0

<210> 1

<211> 25

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> сигнальный пептид (TPA)

<400> 1

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala

20 25

<210> 2

<211> 208

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hB7-1:35-242

<400> 2

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

<210> 3

<211> 30

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> шарнирная область

<400> 3

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

20 25 30

<210> 4

<211> 216

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> fc иммуноглобулина

<400> 4

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

210 215

<210> 5

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> линкер

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 6

<211> 133

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2M

<400> 6

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 7

<211> 617

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок, содержащий варианты IL-2 и фрагменты CD80

<400> 7

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Ile His Val Thr Lys Glu

20 25 30

Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu

35 40 45

Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val

50 55 60

Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn

65 70 75 80

Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala

85 90 95

Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr

100 105 110

Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser

115 120 125

Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro

130 135 140

Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser

180 185 190

Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr

210 215 220

Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly

245 250 255

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

260 265 270

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg

275 280 285

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

290 295 300

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

305 310 315 320

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

325 330 335

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

340 345 350

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

355 360 365

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

370 375 380

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

385 390 395 400

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

405 410 415

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

420 425 430

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

435 440 445

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala

450 455 460

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

485 490 495

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

500 505 510

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe

515 520 525

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

530 535 540

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

545 550 555 560

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

565 570 575

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

580 585 590

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

595 600 605

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 8

<211> 1857

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101)

<400> 8

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgat ccacgtgacc aaagaagtga aagaggtcgc cacactgtcc 120

tgcggccaca acgtttcagt ggaagaactg gcccagacca ggatctactg gcagaaagaa 180

aagaaaatgg tgctgaccat gatgtccggc gacatgaaca tctggcctga gtacaagaac 240

cggaccatct tcgacatcac caacaacctg tccatcgtga ttctggccct gaggccttct 300

gatgagggca cctatgagtg cgtggtgctg aagtacgaga aggacgcctt caagcgcgag 360

cacctggctg aagtgacact gtccgtgaag gccgactttc ccacaccttc catctccgac 420

ttcgagatcc ctacctccaa catccggcgg atcatctgtt ctacctctgg cggctttcct 480

gagcctcacc tgtcttggct ggaaaacggc gaggaactga acgccatcaa caccaccgtg 540

tctcaggacc ccgaaaccga gctgtacgct gtgtcctcca agctggactt caacatgacc 600

accaaccaca gcttcatgtg cctgattaag tacggccacc tgagagtgaa ccagaccttc 660

aactggaaca ccaccaagca agagcacttc cctgacaatg gatctggcgg cggaggttct 720

ggcggaggtg gaagcggagg cggaggatct gctgagtcta agtatggccc tccttgtcct 780

ccatgtcctg ctccagaagc tgctggcgga ccctctgtgt tcctgtttcc tccaaagcct 840

aaggaccagc tcatgatctc tcggacaccc gaagtgacct gcgtggtggt ggatgtgtct 900

caagaggacc ctgaggtgca gttcaattgg tacgtggacg gcgtggaagt gcacaacgcc 960

aagaccaagc ctagagagga acagttcaac tccacctaca gagtggtgtc cgtgctgacc 1020

gtgctgcacc aggattggct gaacggcaaa gagtacaagt gcaaggtgtc caacaagggc 1080

ctgccttcca gcatcgaaaa gaccatctcc aaggctaagg gccagcctag ggaaccccag 1140

gtttacaccc tgcctccaag ccaagaggaa atgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc 1200

ctggtcaagg gcttctaccc ttccgacatt gccgtggaat gggagtccaa tggccagcct 1260

gagaacaact acaagaccac acctcctgtg ctggactccg acggctcctt ctttctgtac 1320

tctcgcctga ccgtggacaa gtctagatgg caagagggca acgtgttctc ctgctctgtg 1380

ctgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc cagaagtccc tgtctctgtc tcttggaggt 1440

ggtggcggtt ctgcccctac cagctcctct accaagaaaa cccagctcca gttggagcat 1500

ctgctgctgg acctccagat gattctgaac gggatcaaca actataagaa ccccaagctg 1560

accgccatgc tgaccgctaa gttctacatg cccaagaagg ccaccgagct gaagcacctc 1620

cagtgcctgg aagaagaact gaagcccctg gaagaggtgc tgaatctggc ccagtccaag 1680

aacttccacc tgaggccacg ggacctgatc agcaacatca acgtgatcgt gctggaactg 1740

aagggctccg agacaacctt tatgtgcgag tacgccgacg agacagccac catcgtggaa 1800

tttctgaacc ggtggatcac cttctgccag agcatcatct ccacactgac ctgatga 1857

<210> 9

<211> 592

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (GI101)

<400> 9

Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu Ser Cys

1 5 10 15

Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile Tyr Trp

20 25 30

Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp Met Asn

35 40 45

Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr Asn Asn

50 55 60

Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly Thr Tyr

65 70 75 80

Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg Glu His

85 90 95

Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr Pro Ser

100 105 110

Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile Ile Cys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu Glu Asn

130 135 140

Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp Pro Glu

145 150 155 160

Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met Thr Thr

165 170 175

Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg Val Asn

180 185 190

Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro Asp Asn

195 200 205

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

225 230 235 240

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

245 250 255

Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

260 265 270

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

275 280 285

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

305 310 315 320

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

325 330 335

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

340 345 350

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

355 360 365

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

370 375 380

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

385 390 395 400

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

405 410 415

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

420 425 430

Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser

450 455 460

Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu

465 470 475 480

Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr

485 490 495

Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu

500 505 510

Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val

515 520 525

Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu

530 535 540

Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr

545 550 555 560

Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe

565 570 575

Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

580 585 590

<210> 10

<211> 133

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> hIL-2

<400> 10

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 11

<211> 288

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CD80

<400> 11

Met Gly His Thr Arg Arg Gln Gly Thr Ser Pro Ser Lys Cys Pro Tyr

1 5 10 15

Leu Asn Phe Phe Gln Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Ser His Phe Cys

20 25 30

Ser Gly Val Ile His Val Thr Lys Glu Val Lys Glu Val Ala Thr Leu

35 40 45

Ser Cys Gly His Asn Val Ser Val Glu Glu Leu Ala Gln Thr Arg Ile

50 55 60

Tyr Trp Gln Lys Glu Lys Lys Met Val Leu Thr Met Met Ser Gly Asp

65 70 75 80

Met Asn Ile Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Ile Phe Asp Ile Thr

85 90 95

Asn Asn Leu Ser Ile Val Ile Leu Ala Leu Arg Pro Ser Asp Glu Gly

100 105 110

Thr Tyr Glu Cys Val Val Leu Lys Tyr Glu Lys Asp Ala Phe Lys Arg

115 120 125

Glu His Leu Ala Glu Val Thr Leu Ser Val Lys Ala Asp Phe Pro Thr

130 135 140

Pro Ser Ile Ser Asp Phe Glu Ile Pro Thr Ser Asn Ile Arg Arg Ile

145 150 155 160

Ile Cys Ser Thr Ser Gly Gly Phe Pro Glu Pro His Leu Ser Trp Leu

165 170 175

Glu Asn Gly Glu Glu Leu Asn Ala Ile Asn Thr Thr Val Ser Gln Asp

180 185 190

Pro Glu Thr Glu Leu Tyr Ala Val Ser Ser Lys Leu Asp Phe Asn Met

195 200 205

Thr Thr Asn His Ser Phe Met Cys Leu Ile Lys Tyr Gly His Leu Arg

210 215 220

Val Asn Gln Thr Phe Asn Trp Asn Thr Thr Lys Gln Glu His Phe Pro

225 230 235 240

Asp Asn Leu Leu Pro Ser Trp Ala Ile Thr Leu Ile Ser Val Asn Gly

245 250 255

Ile Phe Val Ile Cys Cys Leu Thr Tyr Cys Phe Ala Pro Arg Cys Arg

260 265 270

Glu Arg Arg Arg Asn Glu Arg Leu Arg Arg Glu Ser Val Arg Pro Val

275 280 285

<210> 12

<211> 215

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> модифицированная Fc

<400> 12

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

1 5 10 15

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

20 25 30

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

35 40 45

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

50 55 60

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

65 70 75 80

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

85 90 95

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

100 105 110

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

115 120 125

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

130 135 140

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

145 150 155 160

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

165 170 175

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

180 185 190

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

195 200 205

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 13

<211> 306

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> mCD80

<400> 13

Met Ala Cys Asn Cys Gln Leu Met Gln Asp Thr Pro Leu Leu Lys Phe

1 5 10 15

Pro Cys Pro Arg Leu Ile Leu Leu Phe Val Leu Leu Ile Arg Leu Ser

20 25 30

Gln Val Ser Ser Asp Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys Ser Val Lys Asp

35 40 45

Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His Glu Asp Glu Ser

50 55 60

Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val Val Leu Ser Val

65 70 75 80

Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys Asn Arg Thr Leu

85 90 95

Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly Leu Val Leu Ser

100 105 110

Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys Glu Arg Gly Thr

115 120 125

Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser Ile Lys Ala Asp

130 135 140

Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro Ser Ala Asp Thr

145 150 155 160

Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro Lys Pro Arg Phe

165 170 175

Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile Asn Thr Thr Ile

180 185 190

Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser Ser Gln Leu Asp

195 200 205

Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu Ile Lys Tyr Gly

210 215 220

Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys Pro Pro Glu Asp

225 230 235 240

Pro Pro Asp Ser Lys Asn Thr Leu Val Leu Phe Gly Ala Gly Phe Gly

245 250 255

Ala Val Ile Thr Val Val Val Ile Val Val Ile Ile Lys Cys Phe Cys

260 265 270

Lys His Arg Ser Cys Phe Arg Arg Asn Glu Ala Ser Arg Glu Thr Asn

275 280 285

Asn Ser Leu Thr Phe Gly Pro Glu Glu Ala Leu Ala Glu Gln Thr Val

290 295 300

Phe Leu

305

<210> 14

<211> 1848

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (mGI101)

<400> 14

atggatgcta tgctgagagg cctgtgttgc gtgctgctgc tgtgtggcgc tgtgttcgtg 60

tctccttctc acgctgtgga cgagcagctc tccaagtccg tgaaggataa ggtcctgctg 120

ccttgccggt acaactctcc tcacgaggac gagtctgagg accggatcta ctggcagaaa 180

cacgacaagg tggtgctgtc cgtgatcgcc ggaaagctga aagtgtggcc tgagtacaag 240

aacaggaccc tgtacgacaa caccacctac agcctgatca tcctgggcct cgtgctgagc 300

gatagaggca cctattcttg cgtggtgcag aagaaagagc ggggcaccta cgaagtgaag 360

cacctggctc tggtcaagct gtccatcaag gccgacttca gcacccctaa catcaccgag 420

tctggcaacc cttccgccga caccaagaga atcacctgtt tcgcctctgg cggcttccct 480

aagcctcggt tctcttggct ggaaaacggc agagagctgc ccggcatcaa taccaccatt 540

tctcaggacc cagagtccga gctgtacacc atctccagcc agctcgactt taacaccacc 600

agaaaccaca ccatcaagtg cctgattaag tacggcgacg cccacgtgtc cgaggacttt 660

acttgggaga aacctcctga ggaccctcct gactctggat ctggcggcgg aggttctggc 720

ggaggtggaa gcggaggcgg aggatctgct gagtctaagt atggccctcc ttgtcctcca 780

tgtcctgctc cagaagctgc tggcggaccc tctgtgttcc tgtttcctcc aaagcctaag 840

gaccagctca tgatctctcg gacccctgaa gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtctcaa 900

gaggaccctg aggtgcagtt caattggtac gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag 960

accaagccta gagaggaaca gttcaactcc acctatagag tggtgtccgt gctgaccgtg 1020

ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag tacaagtgca aggtgtccaa caagggcctg 1080

ccttccagca tcgaaaagac catcagcaag gctaagggcc agcctaggga accccaggtt 1140

tacaccctgc ctccaagcca agaggaaatg accaagaacc aggtgtccct gacctgcctg 1200

gtcaagggct tctacccttc cgacattgcc gtggaatggg agtccaatgg ccagcctgag 1260

aacaactaca agaccacacc tcctgtgctg gactccgacg gctccttctt tctgtactct 1320

cgcctgaccg tggacaagtc taggtggcaa gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgctg 1380

cacgaggctc tgcacaacca ctacacccag aagtccctgt ctctgtctct tggaggtggt 1440

ggcggttctg cccctacctc cagctctacc aagaaaaccc agctccagtt ggagcatctg 1500

ctgctggacc tccagatgat cctgaatggc atcaacaatt acaagaaccc caagctgacc 1560

gccatgctga ccgctaagtt ctacatgccc aagaaggcca ccgagctgaa gcacttgcag 1620

tgcctggaag aggaactgaa gcccctggaa gaagtgctga atctggccca gtccaagaac 1680

ttccacctga ggcctaggga cctgatctcc aacatcaacg tgatcgtgct ggaactgaaa 1740

ggctccgaga caaccttcat gtgcgagtac gccgacgaga cagccaccat cgtggaattt 1800

ctgaaccggt ggatcacctt ctgccagagc atcatctcca cactgacc 1848

<210> 15

<211> 616

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> слитый белок (mGI101)

<400> 15

Met Asp Ala Met Leu Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly

1 5 10 15

Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Val Asp Glu Gln Leu Ser Lys

20 25 30

Ser Val Lys Asp Lys Val Leu Leu Pro Cys Arg Tyr Asn Ser Pro His

35 40 45

Glu Asp Glu Ser Glu Asp Arg Ile Tyr Trp Gln Lys His Asp Lys Val

50 55 60

Val Leu Ser Val Ile Ala Gly Lys Leu Lys Val Trp Pro Glu Tyr Lys

65 70 75 80

Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Asn Thr Thr Tyr Ser Leu Ile Ile Leu Gly

85 90 95

Leu Val Leu Ser Asp Arg Gly Thr Tyr Ser Cys Val Val Gln Lys Lys

100 105 110

Glu Arg Gly Thr Tyr Glu Val Lys His Leu Ala Leu Val Lys Leu Ser

115 120 125

Ile Lys Ala Asp Phe Ser Thr Pro Asn Ile Thr Glu Ser Gly Asn Pro

130 135 140

Ser Ala Asp Thr Lys Arg Ile Thr Cys Phe Ala Ser Gly Gly Phe Pro

145 150 155 160

Lys Pro Arg Phe Ser Trp Leu Glu Asn Gly Arg Glu Leu Pro Gly Ile

165 170 175

Asn Thr Thr Ile Ser Gln Asp Pro Glu Ser Glu Leu Tyr Thr Ile Ser

180 185 190

Ser Gln Leu Asp Phe Asn Thr Thr Arg Asn His Thr Ile Lys Cys Leu

195 200 205

Ile Lys Tyr Gly Asp Ala His Val Ser Glu Asp Phe Thr Trp Glu Lys

210 215 220

Pro Pro Glu Asp Pro Pro Asp Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

225 230 235 240

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

245 250 255

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Gln Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Gly Gly

465 470 475 480

Gly Gly Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln

485 490 495

Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn

500 505 510

Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Ala Met Leu Thr Ala Lys Phe Tyr

515 520 525

Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu

530 535 540

Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn

545 550 555 560

Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val

565 570 575

Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp

580 585 590

Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys

595 600 605

Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

610 615

<210> 16

<211> 1437

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> нуклеотиды, кодирующие слитый белок (GI101C1)

<400> 16