DLL3-НАЦЕЛИВАЮЩИЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 C12N15/13 C12N15/63 C12N1/15 C12N1/19 C12N1/21 C12N5/10 G01N33/574 A61P35/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество и приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/872915, поданной 11 июля 2019 г., содержание которой полностью включено в настоящую заявку посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Настоящая технология в целом относится к получению композиций на основе иммуноглобулинов (например, антител или их антигенсвязывающих фрагментов), которые специфично связывают дельта-подобный белок 3 (DLL3), и к применениям указанных композиций. В частности, настоящая технология относится к получению DLL3-связывающих антител и их применению для обнаружения и лечения ассоциированных с DLL3 видов рака, включая мелкоклеточную карциному легкого (SCLC), внелегочные нейроэндокринные виды рака и крупноклеточную нейроэндокринную карциному (LCNEC).

ЗАЯВЛЕНИЕ О ГОСУДАРСТВЕННОЙ ПОДДЕРЖКЕ

[0003] Данное изобретение было создано при поддержке правительства в соответствии с СА 213448, присужденным Национальными институтами здравоохранения. Правительство обладает определенными правами на это изобретение.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Следующее далее описание общей информации, относящейся к настоящей технологии, приведено исключительно для облечения понимания настоящей технологии и не описывает, равно как и не составляет предшествующий уровень техники для настоящей технологии.

[0005] Нейроэндокринные опухоли легкого (Lu-NET) охватывают гетерогенное семейство новообразований, классифицируемых на четыре гистологических варианта, а именно: типичный карциноид (ТС), атипичный карциноид (АС), крупноклеточная нейроэндокринная карцинома (LCNEC) и мелкоклеточная карцинома легкого (SCLC). Как SCLC, так и легочная LCNEC являются высокодифференцированными опухолями с неблагоприятным прогнозом, более распространенными у курильщиков. Легочная LCNEC демонстрирует биологически агрессивное поведение, схожее с SCLC. Стадия за стадией кривые выживаемости для легочной LCNEC и SCLC соответствуют друг-другу, и, кроме того, они характеризуются более низкой выживаемостью по сравнению с другими NSCLC (видами немелкоклеточного рака легкого). Прогноз неблагоприятен даже у пациентов с потенциально резектабельным раком легкого I стадии, с 5-летней выживаемостью в диапазоне от 27% до 67%. См. Iyoda A. et al.,J Thorac Cardiovasc Surg. 138:446-453 (2009).

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕЙ ТЕХНОЛОГИИ

[0006] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L), где

(a) V_H содержит последовательность V_H-CDR1, последовательность V_H-CDR2 и последовательность V_H-CDR3, выбранные из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, соответственно; (ii) SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; (iii) SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, соответственно; и (iv) SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, соответственно; и/или (b) V_L содержит последовательность V_L-CDR1, последовательность V_L-CDR2 и последовательность V_L-CDR3, выбранные из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно; (ii) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно; (iii) SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, соответственно; и (iv) SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40, соответственно. В отдельных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент обладает одной или более из следующих характеристик: (а) последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, присутствующей в любой из SEQ ID NO: 7, 17, 27 или 37; и/или

(b) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, присутствующей в любой из SEQ ID NO: 2, 12, 22 или 32.

[0007] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L), где: (a) V_H содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 32; и/или (b) V_L содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления антитела или антигенсвязывающего фрагмента аминокислотная последовательность V_H и аминокислотная последовательность V_L выбраны из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7 (7-I1-B), соответственно; SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 17 (2-C8-A), соответственно; SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 27 (10-O18-A), соответственно; и SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 37 (6-G23-F), соответственно.

[0008] Дополнительно или в качестве альтернативы, в отдельных вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей технологии связывается с эпитопом, присутствующим в полипептиде DLL3 млекопитающих. Эпитоп может представлять собой конформационный эпитоп или неконформационный эпитоп.Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления полипептид DLL3 млекопитающих содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 54. В некоторых вариантах осуществления полипептид DLL3 млекопитающих имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 27-492 из SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51 (например, полипептид DLL3 млекопитающих может включать внеклеточный домен DLL3 человека). Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент подвергается внутриклеточной интернализации при экспрессии антитела или антигенсвязывающего фрагмента, связанного с полипептидом DLL3, на поверхности клетки (например, поверхности опухолевой клетки).

[0009] Дополнительно или в качестве альтернативы, в любом из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, антитело или антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит Fc-домен изотипа, выбранного из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD и IgE. Дополнительно или в качестве альтернативы, в любом из вариантов осуществления, раскрытых в настоящей заявке, его антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab')₂, Fab', scFv и Fv. Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей технологии представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или биспецифичное антитело.

[0010] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к рекомбинантной последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей любые из антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантная последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31 и 36.

[0011] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину или вектору, содержащим любую из рекомбинантных последовательностей нуклеиновых кислот, раскрытых в настоящей заявке.

[0012] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к композиции, содержащей антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей технологии и фармацевтически приемлемый носитель, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент необязательно конъюгированы с агентом, выбранным из группы, состоящей из изотопов, красителей, хромогенов, контрастных веществ, лекарственных средств, токсинов, цитокинов, ферментов, ингибиторов ферментов, гормонов, антагонистов гормонов, факторов роста, радионуклидов, металлов, липосом, наночастиц, РНК, ДНК или любой их комбинации.

[0013] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения DLL3-ассоциированного рака у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества антитела или антигенсвязывающего фрагмента согласно настоящей технологии, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом. Примеры таких дополнительных терапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленным, изотопы, лекарственные средства, токсины, цитокины, ферменты, ингибиторы ферментов, гормоны, антагонисты гормонов, факторы роста, радионуклиды, металлы, липосомы, наночастицы, РНК, ДНК или любую их комбинацию. DLL3-ассоциированный рак может представлять собой мелкоклеточный рак легкого, крупноклеточную нейроэндокринную карциному, легочный нейроэндокринный рак, внелегочные нейроэндокринные виды рака или меланому.

[0014] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения уровней экспрессии белка DLL3 в биологическом образце, включающему приведение указанного биологического образца в контакт с антителом или антигенсвязывающим фрагментом, описанными в настоящей заявке, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент конъюгированы с детектируемой меткой; и обнаружение сигнала, генерируемого указанной детектируемой меткой, в указанном биологическом образце.

[0015] Кроме того, в настоящей заявке раскрыты наборы для обнаружения и/или лечения DLL3-ассоциированных видов рака, содержащие по меньшей мере одну композицию на основе иммуноглобулина согласно настоящей технологии (например, любое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей заявке) или ее функциональный вариант (например, содержащий замену вариант), и инструкции по применению. В отдельных вариантах осуществления композиция на основе иммуноглобулина связана с одной или более детектируемыми метками. В одном из вариантов осуществления указанные одна или более детектируемых меток включают радиоактивную метку, флуоресцентную метку или хромогенную метку.

[0016] Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления набор дополнительно содержит вторичное антитело, которое специфично связывается с композицией на основе иммуноглобулина к DLL3, описанной в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления вторичное антитело связано с по меньшей мере одной детектируемой меткой, выбранной из группы, состоящей из радиоактивной метки, флуоресцентной метки или хромогенной метки.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0017] На ФИГ. 1 показаны результаты анализа Fab ZAP анализа интернализации на основе цитотоксичности - проведенного для исследования интернализации DLL3 указанными антителами. В качестве положительного контроля использовали эталонное моноклональное антитело к DLL3 SC16. См. WO 2015127407. Все исследованные антитела к DLL3 проявляли активность уничтожения, сопоставимую с эталонным моноклональным антителом. При более высоких концентрациях антител к DLL3 наблюдали «хук»-эффект, поскольку свободные антитела к DLL3 конкурировали с клеточносвязанными антителами к DLL3 за Fab ZAP.

[0018] На ФИГ. 2A-2D показаны кривые связывания для антител 7-11-В (ФИГ. 2А), 6-G23-F (ФИГ. 2 В), 10-О18-А (ФИГ. 2С) и 2-С8-А (ФИГ. 2D), измеренные с помощью Octet НТХ при 25°С с использованием PBS 0,1%, BSA 0,02% и Tween 20 в качестве буфера для связывания и 10 мМ глицина с рН 1,7 в качестве буфера для регенерации. Моноклональные антитела (5 мкг/мл каждого) загружали на сенсоры к мышиному Fc, и загруженные сенсоры погружали в указанные разведения рекомбинантного белка DLL3 человека (аминокислоты А1а27-А1а479, кат.№9749-DL, R&D Systems) в начальной концентрации 200 нМ с 7 последовательными разведениями 1:3. Для каждого разведения DLL3 показаны фактические измерения и аппроксимации кривых.

[0019] На ФИГ. 2Е показаны значения констант диссоциации (K_D) для четырех моноклональных антител, описанных в настоящей заявке (6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-018-А), которые были рассчитаны с использованием кривых связывания, показанных на ФИГ. 2A-2D, и с применением одновалентной (1:1) модели связывания.

[0020] На ФИГ. 3А показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_H антитела 7-I1-В, представленные как SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, соответственно. CDR1 V_H (SEQ ID NO: 3) показана жирным шрифтом, CDR2 V_H (SEQ ID NO: 4) подчеркнута, и CDR3 V_H (SEQ ID NO: 5) показана курсивом с подчеркиванием.

[0021] На ФИГ. 3В показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_L антитела 7-I1-В, представленные как SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7, соответственно. CDR1 V_L (SEQ ID NO: 8) показана жирным шрифтом, CDR2 V_L (SEQ ID NO: 9) подчеркнута, и CDR3 V_L (SEQ ID NO: 10) показана курсивом с подчеркиванием.

[0022] На ФИГ. 4А показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_H антитела 2-С8-А, представленные как SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 12, соответственно. CDR1 V_H (SEQ ID NO: 13) показана жирным шрифтом, CDR2 V_H (SEQ ID NO: 14) подчеркнута, и CDR3 V_H (SEQ ID NO: 15) показана курсивом с подчеркиванием.

[0023] На ФИГ. 4В показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_L антитела 2-С8-А, представленные как SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, соответственно. CDR1 V_L (SEQ ID NO: 18) показана жирным шрифтом, CDR2 V_L (SEQ ID NO: 19) подчеркнута, и CDR3 V_L (SEQ ID NO: 20) показана курсивом с подчеркиванием.

[0024] На ФИГ. 5А показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_H антитела 10-О18-А, представленные как SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 22, соответственно. CDR1 V_H (SEQ ID NO: 23) показана жирным шрифтом, CDR2 V_H (SEQ ID NO: 24) подчеркнута, и CDR3 V_H (SEQ ID NO: 25) показана курсивом с подчеркиванием.

[0025] На ФИГ. 5В показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_L антитела 10-О18-А, представленные как SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 27, соответственно. CDR1 V_L (SEQ ID NO: 28) показана жирным шрифтом, CDR2 V_L (SEQ ID NO: 29) подчеркнута, и CDR3 V_L (SEQ ID NO: 30) показана курсивом с подчеркиванием.

[0026] На ФИГ. 6А показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_H антитела 6-G23-F, представленные как SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 32, соответственно. CDR1 V_H (SEQ ID NO: 33) показана жирным шрифтом, CDR2 V_H (SEQ ID NO: 34) подчеркнута, и CDR3 V_H (SEQ ID NO: 35) показана курсивом с подчеркиванием.

[0027] На ФИГ. 6В показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность домена V_L антитела 6-G23-F, представленные как SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 37, соответственно. CDR1 V_L (SEQ ID NO: 38) показана жирным шрифтом, CDR2 V_L (SEQ ID NO: 39) подчеркнута, и CDR3 V_L (SEQ ID NO: 40) показана курсивом с подчеркиванием.

[0028] На ФИГ. 7 показано, что моноклональные антитела (mAb) 6-G23-F, 10-О18-А и 2-С8-А избирательно связывают DLL3, но не DLL1 или DLL4. mAb 7-I1-В связывает как DLL3, так и DLL4, но не DLL1.

[0029] На ФИГ. 8А показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность дельта-подобного канонического лиганда Notch 3 (DLL3) Homo sapiens, изоформы 1, представленные как SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 50, соответственно. На ФИГ. 8 В показаны нуклеотидная последовательность и аминокислотная последовательность дельта-подобного канонического лиганда Notch 3 (DLL3) Homo sapiens, изоформы 2, представленные как SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 51, соответственно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0030] Следует понимать, что конкретные аспекты, режимы, варианты осуществления, вариации и признаки настоящей технологии описаны ниже с разной степенью подробности, чтобы обеспечить понимание сущности настоящей технологии.

[0031] При практическом осуществлении настоящих способов используются многие стандартные методы молекулярной биологии, биохимии белков, клеточной биологии, иммунологии, микробиологии и рекомбинантных ДНК. См., например, Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; серию Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology, серию Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PGR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; патент США №4683195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) ^4 Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression inMammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); и Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology. Способы обнаружения и измерения уровней полипептидных продуктов экспрессии генов (т.е. уровня трансляции генов) хорошо известны в данной области техники и включают использование методов обнаружения полипептидов, таких как методы обнаружения и количественной оценки антител (см. также Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)).

[0032] DLL3 избирательно экспрессируется в высокодифференцированных легочных нейроэндокринных опухолях, включая SCLC и LCNEC. Повышенная экспрессия DLL3 наблюдалась в ксенотрансплантатных опухолях SCLC и LCNEC, полученных от пациента, а также была подтверждена в первичных опухолях. См. Saunders et at, Sci Translational Medicine 7(302): 302ral36 (2015). Повышенная экспрессия DLL3 также наблюдалась при внелегочных нейроэндокринных видах рака, включая нейроэндокринную карциному предстательной железы (Риса et al., Sci Transl Med 11(484): pii: eaav0891 (2019). Хотя DLL3 экспрессируется на поверхности таких опухолевых клеток, он не экспрессируется в нормальных тканях. Настоящее изобретение относится к композициям на основе иммуноглобулинов (например, антителам или их антигенсвязывающим фрагментам), которые интернализируются при связывании с DLL3 на опухолевых клетках и, таким образом, подходят для доставки токсичной полезной нагрузки в эти опухолевые клетки. Композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии применимы в способах обнаружения или лечения DLL3-acco4HHpoBaHHbix видов рака у нуждающегося в этом субъекта. Соответственно, различные аспекты настоящих способов относятся к получению, определению характеристик и манипуляциям с антителами к DLL3. Композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии применимы отдельно или в комбинации с дополнительными терапевтическими агентами для лечения рака. В некоторых вариантах осуществления композиция на основе иммуноглобулина представляет собой гуманизированные антитело, химерное антитело или биспецифичное антитело.

Определения

[0033] Определения некоторых терминов, используемых в настоящем описании, приведены ниже. Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящей заявке, в целом имеют значение, общепринятое для специалистов в области техники, к которой относится настоящая технология.

[0034] Формы единственного числа, используемые в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения, также включают множественное число, если иное явно не следует из контекста. Например, упоминание «клетки» включает комбинацию двух или более клеток и т.д. В целом, номенклатура, используемая в настоящей заявке, и лабораторные процедуры по культивированию клеток, молекулярной генетике, органической химии, аналитической химии, химии нуклеиновых кислот и гибридизации нуклеиновых кислот, описанные ниже, хорошо известны и обычно используются в данной области техники.

[0035] В контексте настоящей заявки термин «приблизительно» применительно к числу, как правило, включает числа, которые находятся в пределах 1%, 5% или 10% от указанного числа в любую сторону (большую или меньшую), если иное не указано или не следует из контекста (за исключением случаев, когда такое число составляет менее 0% или превышает 100% от возможного значения).

[0036] В контексте настоящей заявки «введение» агента или лекарственного средства субъекту включает любой способ введения или доставки субъекту соединения для осуществления его предполагаемой функции. Введение может быть осуществлено любым подходящим способом, включая пероральное, интраназальное, парентеральное (внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное), ректальное, интратекальное, внутриопухолевое или местное введение. Введение включает самостоятельное введение и введение другим человеком.

[0037] Термин «адъювант» относится к одному или более веществам, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В данном контексте адъювант применяют для усиления иммунного ответа на один или более вакцинных антигенов или антител. Адъювант может быть введен субъекту до, в комбинации с или после введения вакцины. Примеры химических соединений, пригодных в качестве адъювантов, включают соединения алюминия, масла, блок-полимеры, иммуностимулирующие комплексы, витамины и минералы (например, витамин Е, витамин А, селен и витамин В12), Quil А (сапонины), компоненты клеточной стенки бактерий и грибов (например, липополисахариды, липопротеины и гликопротеины), гормоны, цитокины и костимулирующие факторы.

[0038] В контексте настоящей заявки термин «аминокислота» используется для обозначения любой органической молекулы, которая содержит по меньшей мере одну аминогруппу и по меньшей мере одну карбоксильную группу. Как правило, по меньшей мере одна аминогруппа находится в а-положении относительно карбоксильной группы. Термин «аминокислота» включает встречающиеся в природе аминокислоты и синтетические аминокислоты, а также аналоги и миметики аминокислот, которые функционируют аналогично встречающимся в природе аминокислотам. Встречающиеся в природе аминокислоты представляют собой аминокислоты, кодируемые генетическим кодом, а также аминокислоты, модифицируемые на последующих стадиях, например, гидроксипролин, у-карбоксиглутамат и О-фосфосерин. Аналоги аминокислот относятся к соединениям, которые имеют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота, т.е. а-углерод, связанный с водородом, карбоксильной группой, аминогруппой и R-группой, например, гомосерин, норлейцин, сульфоксид метионина, метионин метилсульфоний. Такие аналоги имеют модифицированные R-группы (например, норлейцин) или модифицированные пептидные остовы, но сохраняют ту же основную химическую структуру, что и встречающаяся в природе аминокислота. Миметики аминокислот относятся к химическим соединениям, структура которых отличается от общей химической структуры аминокислоты, но которые функционируют аналогично встречающейся в природе аминокислоте. Аминокислоты могут обозначаться в настоящей заявке либо общеизвестными трехбуквенными обозначениями, либо однобуквенными обозначениями, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре Международного биохимического союза ИЮПАК.

[0039] В контексте настоящей заявки термин «антитело» обобщенно относится к иммуноглобулинам или иммуноглобулин-подобным молекулам, включая, например, не ограничиваясь перечисленным, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, их комбинации и схожие молекулы, продуцируемые во время иммунного ответа у любого позвоночного, например, у млекопитающих, таких как люди, козы, кролики и мыши, а также у видов, не являющихся млекопитающими, например, иммуноглобулины акул. В контексте настоящей заявки «антитела» (включая интактные иммуноглобулины) и «антигенсвязывающие фрагменты» специфично связываются с представляющей интерес молекулой (или группой в высокой степени схожих представляющих интерес молекул) по существу с исключением связывания с другими молекулами (например, антителами и фрагментами антител, которые имеют константу связывания с представляющей интерес молекулой, которая по меньшей мере на 10³ М^-1, по меньшей мере на 10⁴ М^-1 или по меньшей мере на 10⁵ М^-1 превышает константу связывания с другими молекулами в биологическом образце). Термин «антитело» также включает генетически сконструированные формы, такие как химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгатные антитела (такие как биспецифичные антитела). См. также Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, 111.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997.

[0040] В частности, антитело относится к полипептидному лиганду, содержащему по меньшей мере вариабельную область легкой цепи иммуноглобулина или вариабельную область тяжелой цепи иммуноглобулина, которая специфично распознает и связывает эпитоп антигена. Антитела состоят из тяжелой и легкой цепи, каждая из которых содержит вариабельную область, называемую вариабельной областью тяжелой цепи (V_H) и вариабельной областью легкой цепи (V_L). Вместе область V_H и область V_L отвечают за связывание антигена, распознаваемого антителом. Как правило, иммуноглобулин содержит тяжелые (Н) цепи и легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Существует два типа легких цепей: лямбда (λ) и каппа (κ). Существует пять основных классов (или изотипов) тяжелых цепей, которые определяют функциональную активность молекулы антитела: IgM, IgD, IgG, IgA и IgE. Каждая тяжелая и легкая цепь содержит константную область и вариабельную область (эти области также известны как «домены»). В комбинации вариабельные области тяжелой и легкой цепи специфично связывают антиген. Вариабельные области легкой и тяжелой цепи содержат «каркасную» область, которая прерывается тремя гипервариабельными областями, также называемым «определяющими комплементарность областями» или «CDR». Размеры каркасной области и CDR были определены (см. источник Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991, включенный в настоящую заявку посредством ссылки). База данных Kabat сейчас поддерживается с использованием интернет-ресурса. Последовательности каркасных областей различных легких или тяжелых цепей являются относительно консервативными в пределах вида. Каркасная область антитела, представляющая собой объединенные каркасные области, составляющие легкую и тяжелую цепи, в значительной степени принимает β-складчатую конформацию, а области CDR образуют петли, которые соединяются с β-складчатой структурой, а в некоторых случаях образуют ее часть. Таким образом, каркасные области выполняют функцию скаффолда, который обеспечивает расположение областей CDR в правильной ориентации с помощью внутрицепочечных нековалентных взаимодействий.

[0041] Области CDR главным образом отвечают за связывание с эпитопом антигена. Области CDR каждой цепи обычно обозначают CDR1, CDR2 и CDR3, с последовательной нумерацией, начиная с N-конца, и также, как правило, идентифицируют по цепи, в которой расположена конкретная CDR. Таким образом, CDR3 V_H расположена в вариабельном домене тяжелой цепи антитела, в котором она содержится, a CDR1 V_L представляет собой CDR1 из вариабельного домена легкой цепи антитела, в котором она содержится. Антитело, которое связывает белок DLL3, имеет специфичную последовательность областей V_H и V_L и, таким образом, специфичные последовательности CDR. Антитела с разными специфичностями (т.е. разными сайтами связывания для различных антигенов) имеют разными CDR. Несмотря на то, что именно области CDR варьируют между разными антителами, только ограниченное количество аминокислотных положений в пределах областей CDR непосредственно вовлечены в связывание антигена. Указанные положения в пределах областей CDR называются определяющими специфичность остатками (SDR). «Композиции на основе иммуноглобулинов» в контексте настоящей заявки относятся к антителам (включая моноклональные антитела, поликлональные антитела, гуманизированные антитела, химерные антитела, рекомбинантные антитела, мультиспецифичные антитела, биспецифичные антитела и т.д.), а также фрагментам антител. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связывается с антигеном.

[0042] В контексте настоящей заявки термин «относящийся к антителу полипептид» означает антигенсвязывающие фрагменты антител, включая одноцепочечные антитела, которые могут содержать вариабельную область (области), отдельно или в комбинации со всеми или частью следующих элементов полипептида: шарнирная область, домены CH₁, СН₂ и СН₃ молекулы антитела. Технология также охватывает любые комбинации вариабельной области (областей) и шарнирной области, доменов CH₁, СН₂ и СН₃. Относящиеся к антителам молекулы, пригодные для настоящих способов, включают, не ограничиваясь перечисленным, Fab, Fab' и F(ab')₂, Fd, одноцепочечные Fv (scFv), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Fv (sdFv) и фрагменты, содержащие домен V_L или V_H. Примеры включают: (i) Fab-фрагмент, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и CH₁; (ii) F(ab’)₂-фрагмент, двухвалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов V_H и CH₁; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов V_L и V_H одного плеча антитела, (v) dAb-фрагмент (Ward et al, Nature 341: 544-546, 1989), состоящий из домена V_H; и (vi) выделенную определяющую комплементарность область (CDR). В связи с этим «фрагменты антитела» или «антигенсвязывающие фрагменты» могут содержать часть полноразмерного антитела, как правило, его антигенсвязывающую или вариабельную область. Примеры фрагментов антител или антигенсвязывающих фрагментов включают Fab-, Fab'-, F(ab')₂- и Fv-фрагменты; диатела; линейные антитела; одноцепочечные молекулы антител и мультиспецифичные антитела, образованные из фрагментов антител.

[0043] Термин «биспецифичное антитело» или «BsAb» в контексте настоящей заявки относится к антителу, которое может связываться одновременно с двумя мишенями, которые имеют различную структуру, например, двумя различными антигенами-мишенями, двумя различными эпитопами на одном антигене-мишени. В данной области техники известно множество разнообразных структур биспецифичных антител. В некоторых вариантах осуществления каждый антигенсвязывающий фрагмент биспецифичного антитела включает области V_H и/или V_L; в некоторых из таких вариантов осуществления области V_H и/или V_L представляют собой области, содержащиеся в конкретном моноклональном антителе. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело содержит два антигенсвязывающих фрагмента, каждый из которых включает области V_H и/или V_L из разных моноклональных антител. В некоторых вариантах осуществления биспецифичное антитело содержит два антигенсвязывающих фрагмента, где один из двух указанных антигенсвязывающих фрагментов включает молекулу иммуноглобулина, имеющую области V_H и/или V_L, содержащие области CDR из первого моноклонального антитела, а другой антигенсвязывающий фрагмент включает фрагмент антитела (например, Fab, F(ab'), F(ab')₂, Fd, Fv, dAB, scFv и т.д.), содержащий области V_H и/или V_L, которые содержат области CDR из второго моноклонального антитела.

[0044] В контексте настоящей заявки термин «конъюгированный» относится к ассоциации двух молекул любым способом, известным специалистам в данной области техники. Подходящие типы ассоциаций включают химические связи и физические связи. Химические связи включают, например, ковалентные связи и координационные связи. Физические связи включают, например, водородные связи, биполярные взаимодействия, ван-дер-ваальсовы силы, электростатические взаимодействия, гидрофобные взаимодействия и ароматические стэкинг-взаимодействия.

[0045] В контексте настоящей заявки термин «диатела» относится к малым фрагментам антитела с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые содержат вариабельный домен тяжелой цепи (V_H), соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (V_L) в той же полипептидной цепи (V_H V_L). Использование линкера, слишком короткого, чтобы было возможно спаривание между двумя доменами на одной цепи, вынуждает домены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих сайта. Диатела описаны более подробно, например, в ЕР 404097; WO 93/11161; и Hollinger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993).

[0046] В контексте настоящей заявки термины «одноцепочечные антитела» или «одноцепочечный Fv (scFv)» относятся к слитой молекуле из двух доменов Fv-фрагмента, V_L и V_H. Одноцепочечные молекулы антител могут содержать полимер из нескольких отдельных молекул, например, представлять собой димер, тример или другие полимеры. Более того, несмотря на то, что два домена Fv-фрагмента, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть соединены с помощью рекомбинантных методов посредством синтетического линкера, который обеспечивает их получение в виде одной белковой цепи, в которой области V_L и V_H спариваются с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv)). Bird et al. (1988) Science 242:423-426 и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883. Такие одноцепочечные антитела могут быть получены рекомбинантными методами или путем ферментативного или химического расщепления интактных антител.

[0047] Любые из указанных выше фрагментов антител получают с помощью стандартных методов, известных специалистам в данной области техники, и указанные фрагменты подвергают такому же скринингу, как и интактные антитела, на предмет специфичности связывания и нейтрализующей активности.

[0048] В контексте настоящей заявки «антиген» относится к молекуле, с которой антитело (или его антигенсвязывающий фрагмент) может селективно связываться. Антиген-мишень может представлять собой белок, углевод, нуклеиновую кислоту, липид, гаптен или другое встречающееся в природе или синтетическое соединение. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень может представлять собой полипептид (например, полипептид DLL3, включающий внеклеточный домен DLL3). Антиген также может быть введен животному для индукции у него иммунного ответа.

[0049] Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к фрагменту полноразмерной структуры иммуноглобулина, который содержит часть полипептида, отвечающую за связывание с антигеном. Примеры антигенсвязывающих фрагментов, пригодных для настоящей технологии, включают scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' и F(ab')₂, но не ограничиваются указанными.

[0050] Под «аффинностью связывания» подразумевается сила всех нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном или антигенным пептидом). Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y может в целом быть представлена константой диссоциации (K_D). Аффинность может быть измерена стандартными методами, известными в данной области техники, включая методы, описанные в настоящей заявке. Низкоаффинный комплекс содержит антитело, которое в целом имеет тенденцию легко диссоциировать от антигена, тогда как высокоаффинный комплекс содержит антитело, которое в целом имеет тенденцию оставаться связанным с антигеном в течение более продолжительного времени.

[0051] В контексте настоящей заявки термин «биологический образец» означает материал образца, происходящий из живых клеток. Биологические образцы могут включать ткани, клетки, белковые или мембранные экстракты клеток и биологические жидкости (например, асцитную жидкость или спинномозговую жидкость (СМЖ)), выделенные из организма субъекта, а также ткани, клетки и жидкости, присутствующие в организме субъекта. Биологические образцы согласно настоящей технологии включают, не ограничиваясь перечисленным, образцы, взятые из ткани молочной железы, ткани почки, шейки матки, эндометрия, головы или шеи, желчного пузыря, ткани околоушной железы, предстательной железы, головного мозга, гипофиза, ткани почки, мышцы, пищевода, желудка, тонкой кишки, ободочной кишки, печени, селезенки, поджелудочной железы, ткани щитовидной железы, ткани сердца, ткани легкого, мочевого пузыря, жировой ткани, ткани лимфатического узла, матки, ткани яичника, ткани надпочечников, ткани семенника, миндалин, тимуса, крови, волос, щеки, кожи, сыворотки, плазмы, СМЖ, спермы, секрета предстательной железы, семенной жидкости, мочи, фекалий, пота, слюны, мокроты, слизи, костного мозга, лимфы и слезной жидкости. Биологические образцы также могут быть получены из биоптатов внутренних органов или из опухолей. Биологические образцы могут быть получены от субъектов для диагностики или исследования или могут быть получены от не страдающих заболеванием индивидуумов для применения в качестве контролей или для фундаментальных исследований. Образцы могут быть получены с помощью стандартных методов, включая, например, венепункцию и хирургическую биопсию. В отдельных вариантах осуществления биологический образец представляет собой образец мокроты или образец ткани, полученный с помощью пункционной биопсии или хирургической биопсии.

[0052] В контексте настоящей заявки термин «антитело с привитыми CDR» означает антитело, в котором по меньшей мере одна CDR антитела-«акцептора» заменена на CDR-«трансплантат» из антитела-«донор а», обладающего желаемой антигенной специфичностью.

[0053] В контексте настоящей заявки термин «химерное антитело» означает антитело, в котором константная область Fc моноклонального антитела из одного вида (например, константная область Fc мыши) заменена на константную область Fc из антитела другого вида (например, константную область Fc человека) с помощью технологий рекомбинантных ДНК. См. в целом Robinson et at, PCT/US 86/02269; Akira et at, европейскую патентную заявку №184187; TaniguCH₁, европейскую патентную заявку №171496; Morrison et at, европейскую патентную заявку №173494; Neuberger et at, WO 86/01533; Cabilly et al. патент США №4816567; Cabilly et at, европейскую патентную заявку №0125023; Better et al, Science 240: 1041-1043, 1988; Liu et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987; Liu et at, J. Immunol 139: 3521-3526, 1987; Sun et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218, 1987; Nishimura et at, Cancer Res 47: 999-1005, 1987; Wood et at, Nature 314: 446-449, 1885; и Shaw et al, J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559, 1988.

[0054] В контексте настоящей заявки термин «консенсусная FR» означает каркасную область (FR) антитела в консенсусной последовательности иммуноглобулина. Области FR антитела не контактируют с антигеном.

[0055] В контексте настоящей заявки «контроль» представляет собой альтернативный образец, используемый в эксперименте в целях сравнения. Контроль может быть «положительным» или «отрицательным». Например, когда целью эксперимента является определение корреляции эффективности терапевтического агента при лечении конкретного типа заболевания, как правило, используются положительный контроль (соединение или композиция, которая, как известно, проявляет желаемый терапевтический эффект) и отрицательный контроль (субъект или образец, который не получает терапию или получает плацебо).

[0056] В контексте настоящей заявки термин «эффективное количество» относится к количеству, достаточному для достижения желаемого терапевтического и/или профилактического эффекта, например, количеству, которое приводит к предупреждению или ослаблению заболевания или состояния, описанного в настоящей заявке, или одного или более признаков или симптомов, связанных с заболеванием или состоянием, описанным в настоящей заявке. В контексте терапевтического или профилактического применения количество композиции, вводимое субъекту, будет варьировать в зависимости от конкретной композиции, выраженности, типа и степени тяжести заболевания и от особенностей индивидуума, таких как общее состояние здоровья, возраст, пол, масса тела и переносимость лекарственных средств. Специалист в данной области техники сможет определить подходящие дозировки в зависимости от указанных и других факторов. Композиции также могут быть введены в комбинации с одним или более дополнительными терапевтическими соединениями. Согласно способам, описанным в настоящей заявке, терапевтические композиции могут быть введены субъекту, имеющему один или более признаков или симптомов заболевания или состояния, описанного в настоящей заявке. В контексте настоящей заявки «терапевтически эффективное количество» композиции относится к уровням композиции, при которых физиологические эффекты заболевания или состояния облегчаются или устраняются. Терапевтически эффективное количество может быть введено за одно или более введений.

[0057] «Выделенный» или «очищенный» полипептид или пептид по существу не содержит клеточного материала или других загрязняющих полипептидов из клеточного или тканевого источника, из которого получен агент, или по существу не содержит химических прекурсоров или других химических веществ при химическом синтезе. Например, выделенные антитела к DLL3 или антигенсвязывающие фрагменты согласно настоящей технологии не содержат материалов, которые могли бы препятствовать диагностическому или терапевтическому применению агента. Такие препятствующие вещества могут включать ферменты, гормоны и другие белковые и небелковые растворенные вещества.

[0058] В контексте настоящей заявки термин «эпитоп» означает белковую детерминанту, способную специфично связываться с антителом. Эпитопы обычно состоят из химически активных поверхностных групп молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и обычно имеют специфические характеристики трехмерной структуры, а также специфические характеристики заряда. Конформационные и неконформационные эпитопы различаются тем, что связывание с конформационными эпитопами, в отличие от неконформационных эпитопов, теряется в присутствии денатурирующих растворителей. В некоторых вариантах осуществления «эпитоп» белка DLL3 представляет собой область белка, с которой специфично связываются антитела к DLL3 согласно настоящей технологии. В некоторых вариантах осуществления эпитоп представляет собой конформационный эпитоп или неконформационный эпитоп.Для скрининга антител к DLL3, которые связываются с эпитопом, может быть проведен стандартный анализ перекрестного блокирования, такой как анализ, описанный в Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Указанный анализ может быть использован для определения того, связывается ли антитело к DLL3 с тем же сайтом или эпитопом, что и антитело к DLL3 согласно настоящей технологии. В качестве альтернативы или дополнительно, может быть осуществлено картирование эпитопа с помощью методов, известных в данной области техники. Например, последовательность антитела может быть подвергнута мутагенезу, такому как сканирование аланином, для идентификации контактных остатков. В другом методе пептиды, соответствующие различным областям белка DLL3, могут быть использованы в конкурентных анализах с исследуемыми антителами или исследуемым антителом и антителом с охарактеризованным или известным эпитопом.

[0059] В контексте настоящей заявки термин «экспрессия» включает одно или более из следующего: транскрипция гена в мРНК-предшественник; сплайсинг и другой процессинг мРНК-предшественника с получением зрелой мРНК; стабилизация мРНК; трансляция зрелой мРНК в белок (включая использование кодонов и доступность тРНК); и гликозилирование и/или другие модификации продукта трансляции, если это необходимо для надлежащей экспрессии и функционирования.

[0060] В контексте настоящей заявки термин «ген» означает сегмент ДНК, который содержит всю информацию для регулируемого биосинтеза продукта РНК, включая промоторы, экзоны, интроны и другие нетранслируемые области, которые контролируют экспрессию.

[0061] В контексте настоящей заявки «гомология», или «идентичность», или «сходство» относится к сходству последовательностей между двумя пептидами или между двумя молекулами нуклеиновых кислот.Гомология может быть определена путем сравнения положения в каждой из последовательностей, которые могут быть выровнены с целью сравнения. Когда положение в сравниваемой последовательности занято тем же основанием или аминокислотой, молекулы в этом положении являются гомологичными. Степень гомологии между последовательностями представляет собой функцию количества совпадающих или гомологичных положений, общих для последовательностей. Наличие у полинуклеотида или области полинуклеотида (или полипептида или области полипептида) определенного процента (например, по меньшей мере 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99%) «идентичности последовательности» другой последовательности означает, что при выравнивании указанный процент оснований (или аминокислот) является одинаковым при сравнении двух последовательностей. Указанное выравнивание и процент гомологии или идентичности последовательностей могут быть определены с использованием программного обеспечения, известного в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления для выравнивания используют параметры по умолчанию. Одной из программ для выравнивания является BLAST с использованием параметров по умолчанию. В частности, программы представляют собой BLASTN и BLASTP с использованием следующих параметров по умолчанию: Genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by =HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIR. Подробную информацию об указанных программах можно найти в Национальном центре биотехнологической информации (National Center for Biotechnology Information). Биологически эквивалентные полинуклеотиды представляют собой полинуклеотиды, обладающие определенным процентом гомологии и кодирующие полипептиды, имеющие одинаковую или схожую биологическую активность. Две последовательности считаются «неродственными» или «негомологичными», если они идентичны друг другу менее чем на 40% или менее чем на 25%.

[0062] В контексте настоящей заявки «гуманизированные» формы антител нечеловеческого происхождения (например, мышиных) представляют собой химерные антитела, которые содержат минимальную последовательность, происходящую из иммуноглобулина нечеловеческого происхождения. По большей части гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины, в которых остатки гипервариабельной области реципиента заменены на остатки гипервариабельной области из вида, отличного от человека (антитела-донора), такого как мышь, крыса, кролик или отличный от человека примат, имеющей желаемую специфичность, аффинность и антигенсвязывающую способность. В некоторых вариантах осуществления остатки каркасной области (FR) Fv человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками нечеловеческого происхождения. Более того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не содержатся в антителе-реципиенте или антител е-до норе. Такие модификации вводят для дополнительного улучшения характеристик антитела, таких как аффинность связывания. В целом, гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов (например, Fab, Fab', F(ab')₂ или Fv), в которых все или по существу все гипервариабельные петли соответствуют гипервариабельным петлям иммуноглобулина нечеловеческого происхождения, и все или по существу все области FR являются областями консенсусной последовательности FR человеческого иммуноглобулина, несмотря на то, что области FR могут включать одну или более аминокислотных замен, улучшающих аффинность связывания. Количество указанных аминокислотных замен в области FR, как правило, составляет не более 6 в Н-цепи и не более 3 в L-цепи. Гуманизированное антитело необязательно может также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило, человеческого иммуноглобулина. Для получения дополнительной информации см. Jones et al, Nature 321:522-525 (1986); Riеchmamvet al, Nature 332:323-327 (1988); и Presta, Curr. Op.Struct. Biol. 2:593-596 (1992). См., например, Ahmed & Cheung, FEBS Letters 588(2):288-297 (2014); Saxena & Wu, Frontiers in immunology 7: 580 (2016).

[0063] В контексте настоящей заявки термин «гипервариабельная область» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые отвечают за связывание антигена. Гипервариабельная область, как правило, содержит аминокислотные остатки из «определяющей комплементарность области», или «CDR» (например, примерно в области остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в V_L и примерно в области остатков 31-35 В (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) в V_H (Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), и/или указанные остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в V_L и 26-32 (H1), 52А-55 (Н2) и 96-101 (Н3) в V_H (Chothia and LeskJ. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).

[0064] В контексте настоящей заявки термины «идентичный» или процент «идентичности» применительно к двум или более последовательностям нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми или имеют определенный процент аминокислотных остатков или нуклеотидов, которые являются одинаковыми (т.е. идентичны в указанной области приблизительно на 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более (например, нуклеотидная последовательность, кодирующая антитело, описанное в настоящей заявке, или аминокислотная последовательность антитела, описанного в настоящей заявке)) при сравнении и выравнивании для максимального соответствия в пределах окна сравнения или обозначенной области по результатам измерения с использованием алгоритмов сравнения последовательностей BLAST или BLAST 2.0 с параметрами по умолчанию, описанными ниже, или с помощью выравнивания вручную и визуальной оценки (например, с использованием веб-сайта NCBI). Тогда такие последовательности называют «по существу идентичными». Этот термин также относится или может применяться к последовательности, комплементарной исследуемой последовательности. Этот термин также включает последовательности, которые имеют делеции и/или добавления, а также последовательности, которые имеют замены. В некоторых вариантах осуществления идентичными являются области длиной по меньшей мере приблизительно в 25 аминокислот или нуклеотидов или длиной в 50-100 аминокислот или нуклеотидов.

[0065] В контексте настоящей заявки термин «интактное антитело» или «интактный иммуноглобулин» означает антитело, которое содержит по меньшей мере два полипептида тяжелой (Н) цепи и два полипептида легкой (L) цепи, связанные между собой дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящей заявке HCVR или V_H) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, CH₁, СН₂ и СН₃. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначаемой в настоящей заявке LCVR или V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена, C_L. Области V_H и V_L могут дополнительно быть разделены на области гипервариабельности, называемые определяющими комплементарность областями (CDR) и чередующиеся с областями, которые являются более консервативными, называемыми каркасными областями (FR). Каждая V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR₁, CDR₁, FR₂, CDR₂, FR₃, CDR₃, FR₄. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классического пути комплемента.

[0066] В контексте настоящей заявки термины «индивидуум», «пациент» или «субъект» могут представлять собой отдельный организм, позвоночное, млекопитающее или человека. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, пациент или субъект представляет собой человека.

[0067] Термин «моноклональное антитело» в контексте настоящей заявки относится к антителу, полученному из популяции по существу однородных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в состав популяции, являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Например, моноклональное антитело может представлять собой антитело, происходящее из единственного клона, включая любой эукариотный, прокариотный или фаговый клон, а не способ, с помощью которого получено указанное антитело. Композиция моноклональных антител проявляет единственную специфичность связывания и аффинность только в отношении конкретного эпитопа. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против единственного антигенного сайта. Более того, в отличие от традиционных (поликлональных) препаратов антител, которые, как правило, включают различные антитела, направленные против различных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминантам на антигене. Определение «моноклональное» относится к характеристике антитела, указывающей на его получение из по существу однородной популяции антител, и не ограничивается получением антитела с помощью какого-либо конкретного способа. Моноклональные антитела могут быть получены с применением целого ряда методов, известных в данной области техники, включая, например, не ограничиваясь перечисленным, гибридомные, рекомбинантные технологии и технологии фагового дисплея. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящими способами могут быть созданы с помощью гибридомной технологии, впервые описанной Kohler et al, Nature 256:495 (1975), или могут быть созданы с помощью методов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США №4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из фаговых библиотек антител, например, с использованием методов, описанных в Clackson et al, Nature 352:624-628 (1991) и Marks et al, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991).

[0068] В контексте настоящей заявки под термином «фармацевтически приемлемый носитель» подразумеваются все возможные растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые соединения, изотонические и замедляющие абсорбцию соединения и т.д., совместимые с введением в фармацевтических целях. Фармацевтически приемлемые носители и их лекарственные формы известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences (20^th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA.).

[0069] В контексте настоящей заявки термин «поликлональное антитело» означает препарат антител, происходящих по меньшей мере из двух (2) различных продуцирующих антитела клеточных линий. Указанный термин включает препараты по меньшей мере двух (2) антител, которые содержат антитела, специфично связывающиеся с разными эпитопами или областями антигена.

[0070] В контексте настоящей заявки термин «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота» означает любую РНК или ДНК, которая может представлять собой немодифицированную или модифицированную РНК или ДНК. Полинуклеотиды включают, не ограничиваясь перечисленным, одно- и двуцепочечную ДНК, ДНК, которая представляет собой смесь одно- и двуцепочечных областей, одно- и двухцепочечную РНК, РНК, которая представляет собой смесь одно- и двухцепочечных областей, и гибридые молекулы, содержащие ДНК и РНК, которые могут быть одноцепочечными или чаще двуцепочечными, или представлять собой смесь одно- и двуцепочечных областей. Кроме того, «полинуклеотид» относится к трехцепочечным областям, содержащим РНК или ДНК или РНК и ДНК. Термин «полинуклеотид» также включает молекулы ДНК или РНК, содержащие одно или более модифицированных оснований, и молекулы ДНК или РНК, имеющие остовы, модифицированные для повышения стабильности или в других целях.

[0071] В контексте настоящей заявки термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются взаимозаменяемо и означают полимер, содержащий две или более аминокислот, соединенных друг с другом с помощью пептидных связей или модифицированных пептидных связей, т.е. пептидные изостеры. Полипептид относится как к коротким цепям, обычно называемым пептидами, гликопептидами или олигомерами, так и к длинным цепям, обычно называемым белками. Полипептиды могут содержать аминокислоты, отличные от 20 генетически кодируемых аминокислот.Полипептиды включают аминокислотные последовательности, модифицированные в ходе естественных процессов, таких как посттрансляционный процессинг, или с помощью методов химической модификации, которые хорошо известны в данной области техники.

[0072] В контексте настоящей заявки термин «предупреждение» или «осуществление предупреждения» расстройства или состояния относится к соединению, которое в статистической выборке снижает частоту возникновения расстройства или состояния в обработанном образце по сравнению с необработанным контрольным образцом или вызывает отсрочку начала или уменьшает степень тяжести одного или более симптомов расстройства или состояния по сравнению с необработанным контрольным образцом.

[0073] В контексте настоящей заявки термин «рекомбинантный» применительно, например, к клетке или нуклеиновой кислоте, белку или вектору указывает на то, что указанная клетка, нуклеиновая кислота, белок или вектор были модифицированы путем введения гетерологичной нуклеиновой кислоты или белка или путем изменения нативной нуклеиновой кислоты или белка, или на то, что материал происходит из клетки, модифицированной таким образом. Таким образом, например, рекомбинантные клетки экспрессируют гены, которые не содержатся в нативной (нерекомбинантной) форме указанных клеток, или экспрессируют нативные гены, для которых в других случаях наблюдается аномальная экспрессия, недостаточная экспрессия или полное отсутствие экспрессии.

[0074] В контексте настоящей заявки термин «раздельное» терапевтическое применение относится к введению по меньшей мере двух активных ингредиентов в одно время или по существу в одно время разными способами.

[0075] В контексте настоящей заявки термин «последовательное» терапевтическое применение относится к введению по меньшей мере двух активных ингредиентов в разное время, где способы введения являются одинаковыми или разными. В частности, последовательное применение относится к полному введению одного из активных ингредиентов до начала введения другого или других ингредиентов. Таким образом, возможно вводить один из активных ингредиентов за нескольких минут, часов или дней до введения другого активного ингредиента или ингредиентов. В этом случае не происходит одновременного лечения.

[0076] В контексте настоящей заявки термин «одновременное» терапевтическое применение относится к введению по меньшей мере двух активных ингредиентов одинаковым способом и в одно и то же время или по существу в одно и то же время.

[0077] В контексте настоящей заявки термин «специфично связывается» относится к молекуле (например, антителу или его антигенсвязывающего фрагменту), которая распознает и связывает другую молекулу (например, антиген), но которая по существу не распознает и не связывает другие молекулы. Термины «специфичное связывание», «специфично связывается с» или «специфичный к» конкретной молекуле (например, полипептиду или эпитопу на полипептиде) в контексте настоящей заявки могут относиться, например, к молекуле, имеющей K_D для молекулы, с которой она связывается, равную приблизительно 10^-4 М, 10^-5 М, 10^-6 М, 10^-7 М, 10^-8 М, 10^-9 М, 10^-10 М, 10^-11 М или 10^-12 М. Термин «специфично связывается» также может относиться к связыванию, при котором молекула (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент) связывается с конкретным полипептидом (например, полипептидом DLL3) или эпитопом на конкретном полипептиде по существу без связывания с любым другим полипептидом или эпитопом полипептида.

[0078] В контексте настоящей заявки по термином «терапевтический агент» подразумевается соединение, которое при присутствии в эффективном количестве оказывает желаемый терапевтический эффект на нуждающегося в этом субъекта.

[0079] «Лечить» или «лечение» в контексте настоящей заявки включает лечение заболевания или расстройства, описанного в настоящей заявке, у субъекта, такого как человек, и включает: (i) подавление заболевания или расстройства, т.е. сдерживание его развития; (ii) облегчение заболевания или расстройства, т.е. стимуляцию регрессии расстройства; (iii) замедление прогрессирования расстройства; и/или (iv) подавление, облегчение или замедление прогрессирования одного или более симптомов заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления «лечение» означает, что симптомы, связанные с заболеванием, например, облегчаются, снижаются, вылечиваются или переводятся в состояние ремиссии.

[0080] Также следует понимать, что различные способы лечения расстройств, как описано в настоящей заявке, относятся к «по существу» лечению, включающему полное излечение, а также неполное излечение, при котором достигается некоторый релевантный с биологической или медицинской точки зрения результат.Лечение может представлять собой непрерывное длительное лечение хронического заболевания или однократное или многократное введение для лечения острого состояния.

[0081] Предусмотрена модификация (модификации) аминокислотной последовательности антител к DLL3, описанных в настоящей заявке. Например, указанная модификация может быть желательна для улучшения аффинности связывания и/или других биологических свойств антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела к DLL3 получают путем введения подходящих нуклеотидных изменений в нуклеиновую кислоту антитела или путем пептидного синтеза. Такие модификации включают, например, делеции, и/или вставки, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Могут быть введены любые комбинации делеции, вставки и замены для получения представляющего интерес антитела, при условии что полученное антитело обладает желаемыми свойствами. Модификация также включает изменение профиля гликозилирования белка. Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают гипервариабельные области, но также рассматриваются изменения в FR. «Консервативные замены» приведены в таблице ниже.

[0082] Один из типов содержащего замену варианта включает замену одного или более остатков гипервариабельной области исходного антитела. Удобный способ создания таких содержащих замену вариантов включает созревание аффинности с применением фагового дисплея. В частности, в несколько сайтов гипервариабельной области (например, 6-7 сайтов) вводят мутации для создания всех возможных аминокислотных замен в каждом сайте. Варианты антитела, созданные таким образом, экспонируются в одновалентной форме на частицах нитевидного фага в виде продуктов слияния с продуктом гена III М13, упакованных в каждой частице. Варианты, экспонируемые на фаге, затем подвергают скринингу на предмет их биологической активности (например, аффинности связывания), как раскрыто в настоящей заявке. Для идентификации сайтов гипервариабельной области, являющихся кандидатами для модификации, может быть проведен мутагенез на основе сканирования аланином для идентификации остатков гипервариабельной области, вносящих значительный вклад в связывание антигена. В качестве альтернативы или дополнительно, может быть предпочтительным анализ кристаллической структуры комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Такие контактные остатки и соседние остатки являются кандидатами для замены в соответствии с методами, разработанными в настоящей заявке. После создания таких вариантов панель вариантов подвергают скринингу, как описано в настоящей заявке, и антитела со схожими или лучшими свойствами по результатам одного или более релевантных анализов могут быть выбраны для дальнейшей разработки.

Дельта-подобный 3 (DLL3)

[0083] У Drosophila передача сигналов Notch опосредуется главным образом рецептором Notch. Delta является одним из лигандов Notch у Drosophila, которые активируют передачу сигналов в соседних клетках. У людей имеется четыре известных рецептора Notch (NOTCH1-NOTCH4) и три гомолога Delta, называемых дельта-подобными лигандами: DLL1, DLL3 и DLL4. Сообщалось, что в отличие от DLL1 и DLL4, DLL3 ингибирует передачу сигналов Notch, а не активирует ее.

[0084] DLL3 (также известный как дельта-подобный 3 или SCDO1) является членом семейства дельта-подобных лигандов Notch DSL. Иллюстративные ортологи белка DLL3 включают, не ограничиваясь перечисленным, белок человека (регистрационный №NP_058637 (SEQ ID NO: 50) и NP_982353 (SEQ ID NO: 51)), шимпанзе (регистрационный №XP 003316395 (SEQ ID NO: 52)), мыши (регистрационный №NP 031892 (SEQ ID NO: 53)) и крысы (регистрационный №NP 446118 (SEQ ID NO: 54)). У человека ген DLL3 состоит из 8 экзонов, занимающих 9,5 т.п.о., расположенных на хромосоме 19ql3. Альтернативный сплайсинг в пределах последнего экзона приводит к транскрипту из 2389 п. о. (регистрационный №NM 016941 (SEQ ID NO: 55)) и транскрипту из 2052 п. о. (регистрационный №NM 203486 (SEQ ID NO: 56)). Первый транскрипт кодирует белок длиной 618 аминокислот (регистрационный №NP 058637 (SEQ ID NO: 50)), а последний кодирует белок длиной 587 аминокислот (регистрационный №NP 982353 (SEQ ID NO: 51)). См. ФИГ. 8А-8 В. Эти две белковые изоформы DLL3 в целом на 100% идентичны по их внеклеточным доменам и их трансмембранным доменам, и отличаются только тем, что более длинная изоформа содержит удлиненный цитоплазматический хвост, содержащий 32 дополнительных остатка на карбоксиконце белка.

[0085] Обе изоформы могут быть обнаружены в опухолевых клетках. Фактически, аберрантная экспрессия DLL3 (генотипическая и/или фенотипическая) связана с различными субпопуляциями туморогенных клеток, такими как раковые стволовые клетки и опухоль-инициирующие клетки. Соответственно, настоящее изобретение относится к антителам к DLL3, которые могут быть особенно эффективны для нацеливания на такие клетки (например, раковые стволовые клетки, опухоль-инициирующие клетки и раковые заболевания, например, мелкоклеточный рак легкого, крупноклеточную нейроэндокринную карциному, легочные нейроэндокринные виды рака, внелегочные нейроэндокринные виды рака и меланому), тем самым облегчая лечение, контроль или предупреждение опухолевых расстройств.

Композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии

[0086] Настоящая технология описывает способы и композиции для создания и применения композиций на основе иммуноглобулинов к DLL3 (например, антител к DLL3 или их антигенсвязывающих фрагментов). Композиции на основе иммуноглобулинов к DLL3 согласно настоящему изобретению могут быть пригодны для диагностики или лечения DLL3-ассоциированных видов рака (например, мелкоклеточного рака легкого, крупноклеточной нейроэндокринной карциномы, легочных нейроэндокринных видов рака, внелегочных нейроэндокринных видов рака и меланомы). Композиции на основе иммуноглобулинов к DLL3 в пределах объема настоящей технологии включают, например, не ограничиваясь перечисленным, моноклональные, химерные, гуманизированные, биспецифичные антитела и диатела, которые специфично связывают полипептид-мишень, его гомолог, производное или фрагмент.Настоящее изобретение также относится к антигенсвязывающий фрагментам любого из антител к DLL3, раскрытых в настоящей заявке, где указанный антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab)'₂, Fab', scFv и Fv.

[0087] Настоящая технология раскрывает антитела к DLL3, которые могут способствовать интернализации комплекса DLL3-антитело и, таким образом, пригодны для доставки токсичных полезных нагрузок в опухолевые клетки.

[0088] На ФИГ. 3-6 показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности для V_H и V_L, а также последовательности CDR для антител, раскрытых в настоящей заявке (SEQ ID NO: 1-40). В приведенной ниже таблице также представлены аминокислотные последовательности для V_H и V_L, а также последовательности CDR для антител, раскрытых в настоящей заявке.

[0089] В одном из аспектов настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, содержащему вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L), где (a) V_H содержит последовательность V_H-CDR1, последовательность V_H-CDR2 и последовательность V_H-CDR3, выбранные из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, соответственно; (ii) SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 15, соответственно; (iii) SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 25, соответственно; и (iv) SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35, соответственно; и/или (b) V_L содержит последовательность V_L-CDR1, последовательность V_L-CDR2 и последовательность V_L-CDR3, выбранные из группы, состоящей из (i) SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 10, соответственно; (ii) SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно; (iii) SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 30, соответственно; и (iv) SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 40, соответственно. В некоторых вариантах осуществления антитело дополнительно содержит Fc-домен любого изотипа, включая, не ограничиваясь перечисленным, IgG (включая IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4), IgA (включая IgA1 и IgA2), IgD IgE, или IgM, и IgY. Неограничивающие примеры последовательностей константной области включают следующие последовательности:

[0090] Константная область IgD человека, база данных Uniprot: Р01880 (SEQ ID NO: 41)

[0092] Константная область IgG1 человека, база данных Uniprot: Р01857 (SEQ ID NO: 42)

[0094] Константная область IgG2 человека, база данных Uniprot: Р01859 (SEQ ID NO: 43)

[0096] Константная область IgG3 человека, база данных Uniprot: Р01860 (SEQ ID NO: 44)

[0098] Константная область IgM человека, база данных Uniprot: Р01871 (SEQ ID NO: 45)

[0100] Константная область IgG4 человека, база данных Uniprot: Р01861 (SEQ ID NO: 46)

[0102] Константная область IgA1 человека, база данных Uniprot: Р01876 (SEQ ID NO: 47)

[0104] Константная область IgA2 человека, база данных Uniprot: Р01877 (SEQ ID NO: 48)

[0106] Константная область Ig-каппа человека, база данных Uniprot: Р01834 (SEQ ID NO: 49)

[0108] В некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии содержат константную область тяжелой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную SEQ ID NO: 41-48. Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии содержат константную область легкой цепи, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 99% или на 100% идентичную SEQ ID NO: 49. В некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии связываются с внеклеточным доменом DLL3. В некоторых вариантах осуществления эпитоп представляет собой конформационный эпитоп.

[0109] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной композиции на основе иммуноглобулина (например, антителу или его антигенсвязывающему фрагменту), содержащей аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H), содержащую SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 32, или ее вариант, имеющий одну или более консервативных аминокислотных замен.

[0110] Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии содержат аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина (V_L), содержащую SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 37, или ее вариант, имеющий одну или более консервативных аминокислотных замен.

[0111] В некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии содержат аминокислотную последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и аминокислотную последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина (V_L), выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7 (7-I1-B); SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 17 (2-C8-A); SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 27 (10-O18-А); и SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 37 (6-G23-F), соответственно.

[0112] В любом из вышеуказанных вариантов осуществления композиций на основе иммуноглобулинов последовательности вариабельных доменов НС и LC иммуноглобулина образуют антигенсвязывающий сайт, который связывается с внеклеточным доменом DLL3. В любом из вышеуказанных вариантов осуществления композиций на основе иммуноглобулинов последовательности вариабельных доменов НС и LC иммуноглобулина образуют антигенсвязывающий сайт, который связывается с DLL3 и способствует интернализации композиции на основе иммуноглобулина. В некоторых вариантах осуществления эпитоп представляет собой конформационный эпитоп.

[0113] В некоторых вариантах осуществления последовательности вариабельных доменов НС и LC иммуноглобулина представляют собой компоненты одной и той же полипептидной цепи. В других вариантах осуществления последовательности вариабельных доменов НС и LC иммуноглобулина представляют собой компоненты разных полипептидных цепей. В отдельных вариантах осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело.

[0114] В некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии специфично связываются с по меньшей мере одним полипептидом DLL3. В некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии связываются с по меньшей мере одним полипептидом DLL3 с константной диссоциации (K_D), равной приблизительно 10^-3 М, 10^-4 М, 10^-5 М, 10^-6 М, 10^-7 М, 10^-8 М, 10^-9 М, 10^-10М, 10^-11 М или 10^-12 М. В отдельных вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов представляют собой моноклональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела или биспецифичные антитела. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат каркасную область антитела человека.

[0115] В отдельных вариантах осуществления композиция на основе иммуноглобулина обладает одной или более из следующих характеристик: (а) последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, присутствующей в любой из SEQ ID NO: 7, 17, 27 или 37; и/или (b) последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99% идентична последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, присутствующей в любой из SEQ ID NO: 2, 12, 22 или 32. В еще одном аспекте один или более аминокислотных остатков в композициях на основе иммуноглобулинов, предложенных в настоящей заявке, заменены другой аминокислотой. Замена может представлять собой «консервативную замену», как определено в настоящей заявке.

[0116] В отдельных вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов содержат константную область IgG1, содержащую одну или более аминокислотных замен, выбранных из группы, состоящей из N297A и К322А. Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов содержат константную область IgG4, содержащую мутацию S228P.

[0117] В некоторых аспектах композиции на основе иммуноглобулинов к DLL3, описанные в настоящей заявке, содержат структурные модификации для способствования быстрому связыванию и поглощению клеткой и/или медленному высвобождению. В некоторых аспектах композиция на основе иммуноглобулина к DLL3 согласно настоящей технологии (например, антитело) может содержать делецию в константной области тяжелой цепи СН₂ для способствования быстрому связыванию и поглощению клеткой и/или медленному высвобождению. В некоторых аспектах для способствования быстрому связыванию и поглощению клеткой и/или медленному высвобождению используют Fab-фрагмент.В некоторых аспектах для способствования быстрому связыванию и поглощению клеткой и/или медленному высвобождению используют F(ab)'₂-фрагмент.

[0118] В одном аспекте настоящая технология обеспечивает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любые из композиций на основе иммуноглобулинов, описанных в настоящей заявке. Также в настоящей заявке раскрыты рекомбинантные последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие любые из антител, описанных в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1, 6, 11, 16, 21, 26, 31 и 36.

[0119] В еще одном аспекте настоящая технология обеспечивает клетку-хозяина или вектор экспрессии, экспрессирующий любую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую любую из композиций на основе иммуноглобулинов, описанных в настоящей заявке.

[0120] Композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии (например, антитело к DLL3) могут быть моноспецифичными, биспецифичными, триспецифичными или иметь более высокую степень мультиспецифичности. Мультиспецифичные антитела могут быть специфичными к разным эпитопам одного или более полипептидов DLL3 или могут быть специфичными как к полипептиду(ам) DLL3, так и к гетерологичным композициям, таким как гетерологичный полипептид или материал твердого носителя. См., например, WO 93/17715; WO 92/08802; WO 91/00360; WO 92/05793; Tutt et al, J. Immunol. 147: 60-69 (1991); патенты США №5573920, 4474893, 5601819, 4714681, 4925648; 6106835; Kostelny et at, J. Immunol 148: 1547-1553 (1992). В некоторых вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов являются химерными. В отдельных вариантах осуществления композиции на основе иммуноглобулинов являются гуманизированными.

[0121] Композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии могут дополнительно быть рекомбинантно слиты с гетерологичным полипептидом на N- или С-конце или химически конъюгированы (включая ковалентное и нековалентное конъюгирование) с полипептидами или другими композициями. Например, композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии могут быть рекомбинантно слиты или конъюгированы с молекулами, пригодными в качестве меток в анализах обнаружения, и эффекторными молекулами, такими как гетерологичные полипептиды, лекарственные средства или токсины. См., например, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; патент США №5314995; и ЕР 0396387.

[0122] В любом из вышеуказанных вариантов осуществления композиций на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии антитело или антигенсвязывающий фрагмент антитела могут быть необязательно конъюгированы с агентом, выбранным из группы, состоящей из изотопов, красителей, хромогенов, контрастных веществ, лекарственных средств, токсинов, цитокинов, ферментов, ингибиторов ферментов, гормонов, антагонистов гормонов, факторов роста, радионуклидов, металлов, липосом, наночастиц, РНК, ДНК или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент согласно настоящей технологии могут быть комбинированы с фармацевтически приемлемым носителем. Для образования химической связи или физической связи функциональная группа на композиции на основе иммуноглобулина, как правило, связывается с функциональной группой на агенте. В качестве альтернативы, функциональная группа на агенте связывается с функциональной группой на композиции на основе иммуноглобулина.

[0123] Функциональные группы на агенте и композиции на основе иммуноглобулина могут связываться напрямую. Например, функциональная группа (например, сульфгидрильная группа) на агенте может связываться с функциональной группой (например, сульфгидрильной группой) на композиции на основе иммуноглобулина с образованием дисульфида. В качестве альтернативы, функциональные группы могут связываться посредством поперечно-сшивающего агента (т.е. линкера). Некоторые примеры поперечно-сшивающих агентов описаны ниже. Поперечно-сшивающий агент может быть присоединен либо к агенту, либо к композиции на основе иммуноглобулина. Количество агентов или композиций на основе иммуноглобулинов в конъюгате также ограничивается количеством функциональных групп, присутствующих на партнере по связыванию. Например, максимальное количество агентов, связанных с конъюгатом, зависит от количества функциональных групп, присутствующих на композиции на основе иммуноглобулина. В качестве альтернативы, максимальное количество композиций на основе иммуноглобулинов, связанных с агентом, зависит от количества функциональных групп, присутствующих на агенте.

[0124] В еще одном варианте осуществления конъюгат содержит одну композицию на основе иммуноглобулина, связанную с одним агентом. В одном из вариантов осуществления конъюгат содержит по меньшей мере один агент, химически связанный (например, конъюгированный) с по меньшей мере одной композицией на основе иммуноглобулина. Агент может быть химически связан с композицией на основе иммуноглобулина с помощью любого способа, известного специалисту в данной области техники. Например, функциональная группа на агенте может быть напрямую присоединена к функциональной группе на композиции на основе иммуноглобулина. Некоторые примеры подходящих функциональных групп включают, например, аминогруппу, карбоксильную группу, сульфгидрильную группу, малеимидную группу, изоцианатную группу, изотиоцианатную группу и гидроксильную группу.

[0125] Агент также может быть химически связан с композицией на основе иммуноглобулина посредством поперечно-сшивающих агентов, таких как диальдегиды, карбодиимиды, дималеимиды и т.д. Поперечно-сшивающие агенты могут, например, быть получены из Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, 111. Руководство можно найти на веб-сайте The Pierce Biotechnology, Inc. Дополнительные поперечно-сшивающие агенты включают поперечно-сшивающие агенты на основе платины от Kreatech Biotechnology, В.V., Амстердам, Нидерланды, описанные в патентах США №5580990, 5985566 и 6133038.

[0126] В качестве альтернативы, функциональная группа на агенте и композиции на основе иммуноглобулина может быть одинаковой. Гомобифункциональные поперечно-сшивающие агенты, как правило, используются для поперечного сшивания одинаковых функциональных групп.Примеры гомобифункциональных поперечно-сшивающих агентов включают EGS (т.е. этиленгликоль бис[сукцинимидилсукцинат]), DSS (т.е. дисукцинимидилсуберат), DMA (т.е. диметиладипимидат-2HCl), DTSSP (т.е. 3,3'-дитиобис[сульфосукцинимидилпропионат]), DPDPB (т.е. 1,4-ди-[3'-(2'-пиридилдитио)-пропионамидо]бутан) и ВМН (т.е. бисмалеимидогексан). Такие гомобифункциональные поперечно-сшивающие агенты также доступны от Pierce Biotechnology, Inc.

[0127] В других случаях может являться предпочтительным отщепление агента от композиции на основе иммуноглобулина. Веб-сайт компании Pierce Biotechnology, Inc., описанный выше, также содержит руководство для специалиста в данной области техники по выбору подходящих поперечно-сшивающих агентов, которые могут быть отщеплены, например, с помощью ферментов в клетке. Таким образом, агент может быть отделен от композиции на основе иммуноглобулина. Примеры отщепляемых линкеров включают SMPT (т.е. 4-сукцинимидилоксикарбонилметил-а-[2-пиридилдитио]толуол), сульфо-LC-SPDP (т.е. сульфосукцинимидил-6-(3-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат), LC-SPDP (т.е. сукцинимидил-6-(3-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат), сульфо-LC-SPDP (т.е. сульфосукцинимидил-6-(3-[2-пиридилдитио]-пропионамидо)гексаноат), SPDP (т.е. N-сукцинимидил-3-[2-пиридилдитио]-пропионамидогексаноат) и AEDP (т.е. 3-[(2-аминоэтил)дитио]пропионовой кислоты HCl).

[0128] В еще одном варианте осуществления конъюгат содержит по меньшей мере один агент, физически связанный с по меньшей мере одной композицией на основе иммуноглобулина. Для физического связывания агентов с композициями на основе иммуноглобулинов может быть использован любой способ, известный специалистам в данной области техники. Например, композиции на основе иммуноглобулинов и агенты могут быть смешаны любым способом, известным специалистам в данной области техники. Порядок смешивания неважен. Например, агенты могут быть физически смешаны с композициями на основе иммуноглобулинов с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники. Например, композиции на основе иммуноглобулинов и агенты могут быть помещены в контейнер и взболтаны, например, путем встряхивания указанного контейнера, для смешивания композиций на основе иммуноглобулинов и агентов.

[0129] Композиции на основе иммуноглобулинов могут быть модифицированы с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники. Например, композиция на основе иммуноглобулина может быть модифицирована с помощью поперечно-сшивающих агентов или функциональных групп, как описано выше.

А. Способы получения антител к DLL3 согласно настоящей технологии

[0130] Общий обзор. Сначала выбирают полипептид-мишень, к которому может быть создано антитело согласно настоящей технологии. Например, антитело может быть создано к полноразмерному белку DLL3 или части внеклеточного домена белка DLL3. Методы создания антител, нацеленных на такие полипептиды-мишени, хорошо известны специалистам в данной области техники. Примеры таких методов включают, например, не ограничиваясь перечисленным, методы, включающие библиотеки дисплея, ксенотрансплантацию или мышиные и человеческие гибридомы, и т.п.Полипептиды-мишени в пределах объема настоящей технологии включают любой полипептид, происходящий из белка DLL3, содержащий внеклеточный домен, способный вызывать иммунный ответ.

[0131] Следует понимать, что рекомбинантно сконструированные антитела и фрагменты антител, например, относящиеся к антителам полипептиды, которые направлены на белок DLL3 и его фрагменты, подходят для применения в соответствии с настоящим изобретением.

[0132] Антитела к DLL3, которые можно применять в способах, изложенных в настоящей заявке, включают моноклональные и поликлональные антитела и фрагменты антител, такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, scFv, диатела, легкие цепи антител, тяжелые цепи антител и/или фрагменты антител. Были описаны способы, подходящие для высокоэффективной продукции полипептидов, содержащих Fv-фрагменты антител, например, Fab'- и F(ab')₂-фрагментов антител. См. патент США №5648237.

[0133] Как правило, антитело получают из исходного вида. В частности, получают последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, тяжелой цепи или обеих из антитела исходного вида, обладающего специфичностью к антигену полипептида-мишени. Исходный вид представляет собой любой вид, подходящий для создания антитела согласно настоящей технологии или библиотеки антител, например, крысу, мышь, кролика, курицу, обезьяну, человека и т.д.

[0134] Технологии фагового или фагмидного дисплея представляют собой методы, подходящие для получения антител согласно настоящей технологии. Методы создания и клонирования моноклональных антител хорошо известны специалистам в данной области техники. Экспрессия последовательностей, кодирующих антитела согласно настоящей технологии, может быть осуществлена в Е. coli.

[0135] Из-за вырожденности последовательностей, кодирующих нуклеиновые кислоты, другие последовательности, которые кодируют по существу те же аминокислотные последовательности, что и последовательности встречающихся в природе белков, могут быть использованы при практическом осуществлении настоящей технологии. Указанные последовательности включают, не ограничиваясь перечисленным, последовательности нуклеиновых кислот, включающие целые последовательности или части последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих вышеуказанные полипептиды, измененные путем замены различных кодонов, кодирующих функционально эквивалентный аминокислотный остаток в последовательности, что приводит к получению «молчащего» изменения. Следует понимать, что нуклеотидная последовательность иммуноглобулина в соответствии с технологией согласно настоящему изобретению может выдерживать гомологичное изменение вплоть до 25% последовательности при расчете с помощью стандартных методов ("Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, стр. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.), при условии, что такой вариант приводит к получению функционального антитела, которое распознает белки DLL3. Например, один или более аминокислотных остатков в полипептидной последовательности могут быть заменены другой аминокислотой со схожей полярностью, действующей как функциональный эквивалент, что приводит к «молчащему» изменению. Замены для аминокислот в последовательности могут быть выбраны из других членов класса, к которому принадлежит данная аминокислота. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин. Полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин. Положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин. Отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. Также в объем технологии согласно настоящему изобретению включены белки или их фрагменты или производные, по-разному модифицированные во время или после трансляции, например, путем гликозилирования, протеолитического расщепления, связывания с молекулой антитела или другими клеточными лигандами и т.д. Дополнительно, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая иммуноглобулин, может быть мутирована in vitro или in vivo с созданием и/или разрушением последовательностей трансляции, инициации и/или терминации или с созданием вариаций в кодирующих областях и/или образованием новых сайтов рестрикции эндонукле азами или разрушения существующих для облегчения дополнительной модификации in vitro. Может быть использован любой метод мутагенеза, известный в данной области техники, включая, не ограничиваясь перечисленным, сайт-направленный мутагенез in vitro, J. Biol. Chem. 253:6551, применение Tab-линкеров (Pharmacia) и т.д.

[0136] Получение поликлональных антисывороток и иммуногенов. Способы создания антител или фрагментов антител согласно настоящей технологии, как правило, включают иммунизацию субъекта (как правило, субъекта, отличного от человека, такого как мышь или кролик) очищенным белком DLL3 или его фрагментом, или клеткой, экспрессирующей белок DLL3 или его фрагмент.Подходящий иммуногенный препарат может содержать, например, рекомбинантно экспрессированный белок DLL3 или химически синтезированный пептид DLL3. Внеклеточный домен белка DLL3 или его часть или фрагмент могут быть использованы в качестве иммуногена для создания антитела к DLL3, которое связывается с белком DLL3 или его частью или фрагментом, с помощью стандартных методов получения поликлонального и моноклонального антитела.

[0137] Полноразмерный белок DLL3 или его фрагменты пригодны в виде фрагментов в качестве иммуногенов. В некоторых вариантах осуществления фрагмент DLL3 содержит внеклеточный домен DLL3, так что антитело, созданное против пептида, образует специфичный иммунный комплекс с белком DLL3.

[0138] Внеклеточный домен DLL3 имеет 466 аминокислот в длину, охватывая аминокислоты 27-492 полноразмерного белка DLL3. В некоторых вариантах осуществления антигенный пептид DLL3 содержит по меньшей мере 5, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислотных остатков. Более длинные антигенные пептиды иногда является более желаемым по сравнению с более короткими антигенными пептидами, в зависимости от области применения и в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области техники. Мультимеры отдельно взятого эпитопа иногда являются более эффективными, чем мономер.

[0139] При необходимости иммуногенность белка DLL3 (или его фрагмента) может быть повышена путем слияния или конъюгирования с белком-носителем, таким как гемоцианин лимфы улитки (KLH) или овальбумин (OVA). Многие такие белки-носители известны в данной области техники. Также можно комбинировать белок DLL3 со стандартным адъювантом, таким как полный или неполный адъювант Фрейнда, для повышения иммунной реакции на полипептид у субъекта. Различные адъюванты, подходящие для повышения иммунологического ответа, включают, не ограничиваясь перечисленным, адъювант Фрейнда (полный или неполный), минеральные гели (например, гидроксид алюминия), поверхностно-активные вещества (например, лизолецитин, полиолы, плюроники, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, динитрофенол и т.д.), адъюванты для человека, такие как бацилла Кальметта-Герена и Corynebacterium parvum, или аналогичные иммуностимулирующие соединения. Указанные методы являются стандартными в данной области техники.

[0140] При описании настоящей технологии иммунные ответы могут быть описаны как «первичные» или «вторичные» иммунные ответы. Первичный иммунный ответ, который также описывается как «защитный» иммунный ответ, относится к иммунному ответу, возникающему у индивидуума в результате какого-либо первоначального воздействия (например, первоначальной «иммунизации») определенного антигена, например, белка DLL3. В некоторых вариантах осуществления иммунизация может происходить в результате вакцинации индивидуума вакциной, содержащей антиген. Например, вакцина может представлять собой DLL3-вакцину, содержащую один или более антигенов, происходящих из белка DLL3. Первичный иммунный ответ может снижаться или ослабляться с течением времени, и даже может исчезнуть или, по меньшей мере, стать настолько ослабленным, что его невозможно обнаружить. Соответственно, настоящая технология также относится ко «вторичному» иммунному ответу, который также описан в настоящей заявке как «ответ иммунологической памяти». Термин «вторичный иммунный ответ» относится к иммунному ответу, вызываемому у индивидуума после того, как уже был получен первичный иммунный ответ.

[0141] Таким образом, вторичный иммунный ответ может быть вызван, например, для усиления существующего иммунного ответа, который стал сниженным или ослабленным, или для воссоздания предыдущего иммунного ответа, который исчез или больше не обнаруживается. Вторичный ответ или ответ иммунологической памяти может представлять собой либо гуморальный ответ (антител), либо клеточный ответ.Вторичный ответ или гуморальный ответ иммунологической памяти происходит при стимуляции В-клеток памяти, которые образовались при первой презентации антигена. Реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) представляют собой вид клеточного вторичного ответа или ответа иммунологической памяти, который опосредуются CD4⁺ Т-клетками. Первое воздействие антигена примирует иммунную систему, а дополнительное воздействие (воздействия) приводит к ГЗТ.

[0142] После надлежащей иммунизации антитело к DLL3 может быть получено из сыворотки субъекта. При желании молекулы антитела против белка DLL3 могут быть выделены из организма млекопитающего (например, из крови) и дополнительно очищены с помощью хорошо известных методов, таких как хроматография на полипептиде А, для получения фракции IgG.

[0143] Моноклональное антитело. В одном из вариантов осуществления настоящей технологии антитело представляет собой моноклональное антитело к DLL3. Например, в некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело к DLL3 может представлять собой человеческое или мышиное моноклональное антитело к DLL3. Для получения моноклональных антител, направленных против белка DLL3, или их производных, фрагментов, аналогов или гомологов, может быть использован любой метод, который обеспечивает получение молекул антител путем непрерывного культивирования клеточных линий. Такие методы включают, не ограничиваясь перечисленным, гибридомную технологию (см., например, Kohler & Milstein, 1975. Nature 256: 495-497); метод на основе триом; метод на основе гибридомы из В-клеток человека (см., например, Kozbor, et al, 1983. Immunol. Today 4: 72) и метод на основе EBV-гибридомы для получения моноклональных антител человека (см., например, Cole, et al, 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Моноклональные антитела человека могут быть использованы при практическом осуществлении настоящей технологии и могут быть получены с использованием гибридом человека (см., например, Cote, et al, 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) или путем трансформации В-клеток человека вирусом Эпштейна-Барра in vitro (см., например, Cole, et al, 1985. In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Например, может быть выделена популяция нуклеиновых кислот, кодирующих области антител. ПЦР с использованием праймеров, происходящих из последовательностей, кодирующих консервативные области антител, используют для амплификации последовательностей, кодирующих части антител из популяции, и затем из амплифицированных последовательностей воссоздают ДНК, кодирующие антитела или их фрагменты, такие как вариабельные домены. Такие амплифицированные последовательности также могут быть слиты с ДНК, кодирующими другие белки, например, оболочку бактериофага или белок поверхности бактериальной клетки, для экспрессии и экспонирования слитых полипептидов на фаге или бактериях.- Затем амплифицированные последовательности могут быть экспрессированы и далее отобраны или выделены на основе, например, аффинности экспрессированного антитела или его фрагмента к антигену или эпитопу, присутствующему на белке DLL3. В качестве альтернативы, гибридомы, экспрессирующие моноклональные антитела к DLL3, могут быть получены путем иммунизации субъекта с последующим выделением гибридом из селезенки субъекта с использованием стандартных методов. См., например, Milstein et al, (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73:3-46). Скрининг гибридом с использованием стандартных методов позволяет получить моноклональные антитела различной специфичности (т.е. к разным эпитопам) и аффинности. Выбранное моноклональное антитело с желаемыми свойствами, например, связыванием DLL3, может быть использовано в том виде, в котором оно экспрессируется гибридомой, оно может быть связано с молекулой, такой как полиэтиленгликоль (ПЭГ), для изменения его свойств, или кодирующая его кДНК может быть выделена, секвенирована и подвергнута различным манипуляциям. Кроме того, для усиления иммуногенных свойств белка DLL3 к реакционноспособным боковым цепям аминокислот, например, лизина, могут быть добавлены синтетические разветвленные дендримеры. Кроме того, для усиления иммуногенных свойств белка DLL3 могут быть использованы методы на основе CPG-динуклеотида. Другие манипуляции включают замену или удаление определенных аминокислотных остатков, которые способствуют нестабильности антитела во время хранения или после введения субъекту, и методы созревания аффинности для улучшения аффинности антитела к белку DLL3.

[0144] Гибридомная технология В некоторых вариантах осуществления антитело согласно настоящей технологии представляет собой моноклональное антитело к DLL3, продуцируемое гибридомой, которая включает В-клетку, полученную от трансгенного животного, отличного от человека, например, трансгенной мыши, имеющего геном, содержащий трансген тяжелой цепи и трансген легкой цепи человека, слитый с иммортализованной клеткой. Гибридомные технологии включают методы, известные в данной области и описанные в Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al, Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981). Другие способы получения гибридом и моноклональных антител хорошо известны специалистам в данной области техники.

[0145] Технология фагового дисплея. Как отмечено выше, антитела согласно настоящей технологии могут быть получены с применением технологии рекомбинантных ДНК и фагового дисплея. Например, антитела к DLL3 могут быть получены с использованием различных методов фагового дисплея, известных в данной области техники. В методах фагового дисплея функциональные домены антител экспонируются на поверхности фаговой частицы, несущей кодирующие их полинуклеотидные последовательности. Фаги с желаемыми свойствами связывания выбирают из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (например, человека или мыши) путем непосредственного отбора с использованием антигена, как правило, антигена, связанного с твердой поверхностью или гранулой или захваченного на ней. Фаги, используемые в указанных способах, как правило, представляют собой нитевидные фаги, включая fd и М13, в которых домены антител Fv, Fv или стабилизированные дисульфидными связями домены Fv рекомбинантно слиты с белком гена III или гена VIII фага. Кроме того, методы могут быть адаптированы для создания библиотек экспрессии Fab (см., например, Huse, et al, Science 246: 1275-1281, 1989), чтобы обеспечить быструю и эффективную идентификацию моноклональных Fab-фрагментов с желаемой специфичностью к полипептиду DLL3, например, полипептида или его производных, фрагментов, аналогов или гомологов. Другие примеры методов фагового дисплея, которые могут быть использованы для создания антител согласно настоящей технологии, включают методы, описанные в Huston et at, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et at, Proc. Natl Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990; Brinkman et al, J. Immunol Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al, J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al, Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et at, Gene 187: 9-18, 1997; Burton et at, Advances in Immunology 57: 191-280, 1994; PCT/GB91/01134; WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; WO 96/06213; WO 92/01047 (Medical Research Council et at); WO 97/08320 (Morphosys); WO 92/01047 (CAT/MRC); WO 91/17271 (Affymax); и патентах США №5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727 и 5733743. Способы, подходящие для экспонирования полипептидов на поверхности частиц бактериофага путем присоединения полипептидов посредством дисульфидных связей, были описаны Lohning, патент США №6753136. Как описано в приведенных выше источниках, после выбора фага кодирующие антитело области из фага могут быть выделены и использованы для создания полноразмерных антител, включая антитела человека, или любого другого желаемого антигенсвязывающего фрагмента, и экспрессированы в любом желаемом хозяине, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий. Например, также могут быть использованы методы рекомбинантного получения Fab-, Fab'- и F(ab')₂-фрагментов с помощью методов, известных в данной области техники, таких как раскрытыев WO 92/22324; Mullinax et al.,BioTechniques 12: 864-869, 1992; и Sawai et al, AJRI34: 26-34, 1995; и Better et at, Science 240: 1041-1043, 1988.

[0146] В целом, гибридные антитела или фрагменты гибридных антител, клонированные в вектор дисплея, могут быть отобраны с использованием соответствующего антигена для идентификации вариантов, сохранивших хорошую активность связывания, поскольку антитело или фрагмент антитела будет присутствовать на поверхности фаговой или фагмидной частицы. См., например, Barbas III et at, Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001). Однако для указанного процесса могут быть использованы другие форматы векторов, такие как клонирование библиотеки фрагментов антител в литический фаговый вектор (модифицированный Т7 или системы лямбда-Zap) для отбора и/или скрининга.

[0147] Экспрессия рекомбинантных антител к DLL3. Как отмечено выше, антитела согласно настоящей технологии могут быть получены с помощью технологии рекомбинантных ДНК. Рекомбинантные полинуклеотидные конструкции, кодирующие антитело к DLL3 согласно настоящей технологии, как правило, включают последовательность контроля экспрессии, функционально связанную с кодирующими последовательностями цепей антитела к DLL3, включая естественным образом связанные или гетер о логичные промоторные области. В связи с этим другой аспект технологии включает векторы, содержащие одну или более последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих антитело к DLL3 согласно настоящей технологии. Для рекомбинантной экспрессии одного или более полипептидов согласно настоящей технологии нуклеиновую кислоту, содержащую всю или часть нуклеотидной последовательности, кодирующей антитело к DLL3, вставляют в подходящий вектор для клонирования или вектор экспрессии (т.е. вектор, который содержит необходимые элементы для транскрипции и трансляции вставленной кодирующей последовательности полипептида) с помощью технологии рекомбинантных ДНК, хорошо известной в данной области техники и подробно описанной ниже. Способы получения генетически разнообразных популяций векторов были описаны Lerner et al, патенты США №6291160 и 6680192.

[0148] В целом, векторы экспрессии, пригодные для технологии рекомбинантных ДНК, часто представлены в виде плазмид. Согласно настоящему изобретению термины «плазмида» и «вектор» могут использоваться взаимозаменяемо, так как плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Однако подразумевается, что технология согласно настоящему изобретению включает такие другие формы векторов экспрессии, которые технически не представляют собой плазмиды, такие как вирусные векторы (например, репликативно-дефектные ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые выполняют эквивалентные функции. Такие вирусные векторы обеспечивают возможность инфицирования субъекта и экспрессии конструкции у указанного субъекта. В некоторых вариантах осуществления последовательности контроля экспрессии представляют собой системы промоторов эукариот в векторах, способных трансформировать или трансфицировать эукариотические клетки-хозяева. После встраивания вектора в подходящего хозяина указанный хозяин поддерживается в условиях, подходящих для экспрессии на высоком уровне нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитело к DLL3, и сбора и очистки антитела к DLL3, например, перекрестно реагирующих антител к DLL3. См. в целом US 2002/0199213. Эти векторы экспрессии, как правило, способны к репликации в организмах-хозяевах либо в виде эписом, либо в виде части, интегрированной в хромосомную ДНК хозяина. Обычно векторы экспрессии содержат маркеры отбора, например, ген устойчивости к ампициллину или устойчивости к гигромицину, для обеспечения возможности обнаружения клеток, трансформированных желаемыми последовательностями ДНК. Векторы также могут кодировать сигнальный пептид, например, пектатлиазу, пригодный для управления секрецией внеклеточных фрагментов антител. См. патент США №5576195.

[0149] Рекомбинантные векторы экспрессии согласно настоящей технологии содержат нуклеиновую кислоту, кодирующую белок, обладающий свойствами связывания DLL3, в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине, что означает, что рекомбинантные векторы экспрессии включают одну или более регуляторных последовательностей, выбранных с учетом клеток-хозяев, которые предполагается использовать для экспрессии, где указанные последовательности функционально связаны с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей экспрессии. Подразумевается, что в контексте рекомбинантного вектора экспрессии «функционально связанный» означает, что представляющая интерес нуклеотидная последовательность связана с регуляторной последовательностью (последовательностями) таким образом, что обеспечивается возможность экспрессии нуклеотидной последовательности (например, в in vitro системе транскрипции/трансляции или в клетке-хозяине, где вектор вводят в указанную клетку-хозяина). Подразумевается, что термин «регуляторная последовательность» включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Такие регуляторные последовательности описаны, например, в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). Регуляторные последовательности включают последовательности, управляющие конститутивной экспрессией нуклеотидной последовательности во многих типах клеток-хозяев, и последовательности, управляющие экспрессией нуклеотидной последовательности только в определенных клетках-хозяевах (например, тканеспецифичные регуляторные последовательности). Специалистам в данной области техники ясно, что дизайн вектора экспрессии может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина, подлежащей трансформации, желаемый уровень экспрессии полипептида и т.д. Типичные регуляторные последовательности, пригодные в качестве промоторов экспрессии рекомбинантного полипептида (например, антитела к DLL3), включают, например, не ограничиваясь перечисленным, промоторы 3-фосфоглицераткиназы и других гликолитических ферментов. Индуцибельные промоторы дрожжей включают, среди прочего, промоторы из алкогольдегидрогеназы, изоцитохрома С и ферментов, отвечающих за утилизацию мальтозы и галактозы. В одном из вариантов осуществления полинуклеотид, кодирующий антитело к DLL3 согласно настоящей технологии, функционально связан с промотором ага В и может быть экспрессирован в клетке-хозяине. См. патент США №5028530. Векторы экспрессии согласно настоящей технологии могут быть введены в клетки-хозяева для продукции таким образом полипептидов или пептидов, включая слитые полипептиды, кодируемые нуклеиновыми кислотами, как описано в настоящей заявке (например, антитело к DLL3 и т.д.).

[0150] Еще один аспект согласно настоящей технологии относится к экспрессирующим антитело к DLL3 клеткам-хозяевам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую одно или более антител к DLL3. Рекомбинантные векторы экспрессии согласно настоящей технологии могут быть сконструированы для экспрессии антитела к DLL3 в прокариотических или эукариотических клетках. Например, антитело к DLL3 может быть экспрессировано в бактериальных клетках, таких как клетки Escherichia coli, клетках насекомых (с использованием бакуловирусных векторов экспрессии), клетках грибов, например, дрожжей, дрожжевых клетках или клетках млекопитающих. Подходящие клетки-хозяева более подробно обсуждаются в Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990). В качестве альтернативы, рекомбинантный вектор экспрессии может быть транскрибирован и транслирован in vitro, например, с применением регуляторных последовательностей промотора Т7 и полимеразы Т7. Способы, подходящие для получения и скрининга полипептидов, имеющих заданное свойство, например, антител к DLL3, посредством экспрессии случайным образом генерированных полинуклеотидных последовательностей, были описаны ранее. См. патенты США №5763192, 5723323, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, 6492107, 6569641.

[0151] Экспрессию полипептидов в прокариотах наиболее часто осуществляют в Е. coli с помощью векторов, содержащих конститутивные или индуцибельные промоторы, управляющие экспрессией слитых или неслитых полипептидов. Векторы для слияния добавляют ряд аминокислот к кодируемому в них полипептиду, обычно к аминоконцу рекомбинантного полипептида. Такие векторы для слияния, как правило, служат трем целям: (i) повышению экспрессии рекомбинантного полипептида; (ii) повышению растворимости рекомбинантного полипептида; и (iii) помощи в очистке рекомбинантного полипептида, действуя в качестве лиганда в аффинной очистке. Часто в векторах экспрессии для слияния в область соединения сливаемого фрагмента и рекомбинантного полипептида вставляют сайт протеолитического расщепления для обеспечения возможности отделения рекомбинантного полипептида от сливаемого фрагмента после очистки указанного слитого полипептида. Такие ферменты и их последовательности когнатного распознавания включают фактор Ха, тромбин и энтерокиназу. Иллюстративные векторы экспрессии для слияния включают pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Беверли, Массачусетс) и pRIT5 (Pharmacia, Пискатауэй, Нью-Джерси), обеспечивающие слияние глутатион-8-трансферазы (GST), мальтоза-связывающего полипептида Е или полипептида А, соответственно, с рекомбинантным полипептидом-мишенью.

[0152] Примеры подходящих индуцибельных векторов экспрессии в Е. coli, не представляющих собой векторы слияния, включают pTrc (Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315) и pET lid (Studier et al, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89). Способы для направленной сборки отдельных активных пептидных или белковых доменов с получением мультифункциональных полипептидов путем слияния полипептидов были описаны Pack et at, патенты США №6294353, 6692935. Одной из стратегий для максимизации экспрессии рекомбинантного полипептида, например, антитела к DLL3, в Е. coli является экспрессия полипептида в бактерии-хозяине с нарушенной способностью к протеолитическому расщеплению рекомбинантного полипептида. См., например, Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128. Другой стратегией является изменение последовательности нуклеиновой кислоты, подлежащей вставке в вектор экспрессии, таким образом, чтобы отдельные кодоны для каждой аминокислоты представляли собой кодоны, предпочтительно используемые экспрессирующей клеткой-хозяином, например, Е. coli (см., например, Wada, et at, 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118). Такое изменение последовательностей нуклеиновых кислот согласно настоящей технологии может быть осуществлено с помощью стандартных методов синтеза ДНК.

[0153] В еще одном варианте осуществления вектор экспрессии антитела к DLL3 представляет собой дрожжевой вектор экспрессии. Примеры векторов для экспрессии в дрожжах Saccharomyces cerevisiae включают pYepSecl (Baldari, et at, 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, Cell 30: 933-943, 1982), pJRY88 (Schultz et at, Gene 54: 113-123, 1987), pYES2 (Invitrogen Corporation, Сан-Диего, Калифорния) и picZ (Invitrogen Corp, Сан-Диего, Калифорния). В качестве альтернативы, антитело к DLL3 может быть экспрессировано в клетках насекомых с применением бакуловирусных векторов экспрессии. Бакуловирусные векторы, доступные для экспрессии полипептидов, например, антитела к DLL3, в культивируемых клетках насекомых (например, клетках SF9), включают серию рАс (Smith, etal.,Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983) и серию pV_L (Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39).

[0154] В еще одном варианте осуществления нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело к DLL3 согласно настоящей технологии, экспрессируют в клетках млекопитающих с помощью вектора экспрессии у млекопитающих. Векторы экспрессии у млекопитающих включают, например, не ограничиваясь перечисленным, pCDM8 (Seed, Nature 329: 840, 1987) и рМТ2РС (Kaufman, et at, EMBO J. 6: 187-195, 1987). При использовании в клетках млекопитающих функции контроля вектора экспрессии часто обеспечиваются вирусными регуляторными элементами. Например, обычно используемые промоторы происходят из полиомы, аденовируса 2, цитомегаловируса и вируса обезьян 40. Другие подходящие системы экспрессии как для прокариотических, так и для эукариотических клеток, пригодные для экспрессии антитела к DLL3 согласно настоящей технологии, см., например, в главах 16 и 17 источника Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.

[0155] В еще одном варианте осуществления рекомбинантный вектор экспрессии у млекопитающих способен управлять экспрессией нуклеиновой кислоты в определенном типе клеток (например, тканеспецифичные регуляторные элементы). Тканеспецифичные регуляторные элементы известны в данной области техники. Неограничивающие примеры подходящих тканеспецифичных промоторов включают промотор альбумина (специфичный для ткани печени; Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277, 1987), специфичные для лимфоидной ткани промоторы (Calame and Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275, 1988), промоторы T-клеточных рецепторов (Winoto and Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989) и иммуноглобулинов (Banerji, et al, 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, Cell 33: 741-748, 1983.), специфичные для нейронов промоторы (например, промотор нейрофиламентов; Byrne and Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989), специфичные для ткани поджелудочной железы промоторы (Edlund, etal, 1985. Science 230: 912-916) и специфичные для ткани молочной железы промоторы (например, промотор белков молочной сыворотки; патент США №4873316 и публикация европейской заявки №264166). Также включены регулируемые процессом развития промоторы, например, промоторы мышиного hox-гена (Kessel and Gruss, Science 249: 374-379, 1990) и промотор а-фетопротеина (Campes and Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546, 1989).

[0156] Еще один аспект настоящих способов относится к клеткам-хозяевам, в которые был введен рекомбинантный вектор экспрессии согласно настоящей технологии. Термины «клетка-хозяин» и «рекомбинантная клетка-хозяин» в настоящей заявке используются взаимозаменяемо. Необходимо понимать, что такие термины относятся не только к конкретной клетке субъекта, но также к потомству или потенциальному потомству такой клетки. Поскольку в последующих поколениях могут иметь место определенные модификации вследствие мутаций или под влиянием внешней среды, такое потомство может фактически не быть идентичным исходной клетке, но по-прежнему включено в объем указанного термина в контексте настоящей заявки.

[0157] Клетка-хозяин может представлять собой любую прокариотическую или эукариотическую клетку. Например, антитело к DLL3 может быть экспрессировано в бактериальных клетках, таких как Е. coli, клетках насекомых, дрожжей или клетках млекопитающих. Клетки млекопитающих являются подходящим хозяином для экспрессии сегментов нуклеиновых кислот, кодирующих иммуноглобулины или их фрагменты. См. Winnacker, From Genes То Clones, (VCH Publishers, NY, 1987). В данной области техники был разработан ряд подходящих линий клеток-хозяев, способных секретировать интактные гетерологичные белки, и они включают линию клеток яичника китайского хомячка (СНО), различные линии клеток COS, клетки HeLa, L-клетки и линии миеломных клеток. В некоторых вариантах осуществления клетки представляют собой клетки нечеловеческого происхождения. Векторы экспрессии для указанных клеток могут включать экспрессию контрольных последовательностей, таких как точка начала репликации, промотор, энхансер и необходимые информационные сайты процессинга, такие как сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Queen et al, Immunol. Rev. 89: 49, 1986. Иллюстративные последовательности контроля экспрессии представляют собой промоторы, происходящие из эндогенных генов, цитомегаловируса, вируса SV40, аденовируса, вируса папилломы крупного рогатого скота и т.п.Со et al, J Immunol. 148: 1149, 1992. Другие подходящие клетки-хозяева известны специалисту в данной области техники.

[0158] ДНК-вектор может быть введен в прокариотические или эукариотические клетки с помощью традиционных методов трансформации или трансфекции. В контексте настоящей заявки под терминами «трансформация» и «трансфекция» подразумевается ряд известных в данной области техники методов введения чужеродной нуклеиновой кислоты (например, ДНК) в клетку-хозяина, включая соосаждение с фосфатом кальция или хлоридом кальция, ДЭАЭ-декстран-опосредованную трансфекцию, липофекцию, элктропорацию, биолистику или вирусную трансфекцию. Другие методы, применяемые для трансформации клеток млекопитающих, включают использование полибрена, слияние протопластов, использование липосом, электропорации и микроинъекции (см. в целом Sambrook et al., Molecular Cloning). Подходящие способы трасформации или трансфекции клеток-хозяев можно найти в Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989), и других лабораторных руководствах. Векторы, содержащие представляющие интерес сегменты ДНК, могут быть перенесены в клетку-хозяина хорошо известными методами, которые зависят от типа клетки-хозяина.

[0159] Известно, что для стабильной трансфекции клеток млекопитающих в зависимости от используемого вектора экспрессии и метода трансфекции только небольшая фракция клеток может интегрировать чужеродную ДНК в свой геном. Для идентификации и отбора этих способных к интеграции чужеродной ДНК клеток обычно в клетки-хозяева вводят ген, кодирующий маркер отбора (например, ген устойчивости к антибиотикам), наряду с представляющим интерес геном. Различные маркеры отбора включают маркеры, придающие устойчивость к лекарственным средствам, таким как G418, гигромицин и метотрексат.Нуклеиновая кислота, кодирующая маркер отбора, может быть введена в клетку-хозяина в том же векторе, который кодирует антитело к DLL3, или может быть введена в отдельном векторе. Клетки, стабильно трансфицированные введенной нуклеиновой кислотой, можно идентифицировать путем отбора по чувствительности к лекарственному средству (например, клетки со встроенным маркерным геном отбора выживут, тогда как другие клетки погибнут).

[0160] Клетка-хозяин, содержащая антитело к DLL3 согласно настоящей технологии, такая как прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин в культуре, может быть использована для продуцирования (т.е. экспрессии) рекомбинантного антитела к DLL3. В одном из вариантов осуществления способ включает культивирование клетки-хозяина (в которую был введен рекомбинантный вектор экспрессии, кодирующий антитело к DLL3) в подходящей среде таким образом, что происходит продукция антитела к DLL3. В еще одном варианте осуществления способ дополнительно включает стадию выделения антитела к DLL3 из среды или клетки-хозяина. После экспрессии собранные антитела к DLL3, например, антитела к DLL3 или полипептиды, относящиеся к антителам к DLL3, очищают из культуральной среды и клеток-хозяев. Антитело к DLL3 может быть очищено в соответствии со стандартными процедурами в данной области техники, включая очистку с помощью ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), колоночной хроматографии, гель-электрофореза и т.д. В одном из вариантов осуществления антитело к DLL3 продуцируют в организме-хозяине методом согласно Boss et al, патент США №4816397. Как правило, цепи антитела к DLL3 экспрессируются с сигнальными последовательностями и, таким образом, высвобождаются в культур альную среду. Однако если цепи антитела к DLL3 не секретируются клетками-хозяевами в естественных условиях, указанные цепи антитела к DLL3 могут быть высвобождены путем обработки мягким детергентом. Очистка рекомбинантных полипептидов хорошо известна в данной области техники и включает осаждение сульфатом аммония, метод очистки аффинной хроматографией, колоночную хроматографию, метод ионообменной очистки, гель-электрофорез и т.д. (см. в целом Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982).

[0161] Полинуклеотиды, кодирующие антитела к DLL3, например, последовательности, кодирующие антитело к DLL3, могут быть встроены в трансгены для введения в геном трансгенного животного и последующей экспрессии в молоке указанного трансгенного животного. См., например, патенты США №5741957, 5304489 и 5849992. Подходящие трансгены включают кодирующие последовательности легких и/или тяжелых цепей, функционально связанные с промотором и энхансером из специфичного для молочной железы гена, такого как казеин или (3-лактоглобулин. Для получения трансгенных животных указанные трансгены могут быть введены путем микроинъекции в оплодотворенные яйцеклетки или могут быть встроены в геном эмбриональных стволовых клеток, и ядра таких клеток могут быть перенесены в лишенные ядер яйцеклетки.

[0162] Одноцепочечные антитела. В одном из вариантов осуществления антитело к DLL3 согласно настоящей технологии представляет собой одноцепочечное антитело к DLL3. В соответствии с настоящей технологией методы могут быть адаптированы для получения одноцепочечных антител, специфичных к белку DLL3 (см., например, патент США №4946778). Примеры методов, которые могут быть использованы для получения одноцепочечных Fv и антител согласно настоящей технологии, включают описанные в патентах США №4946778 и 5258498; Huston et al, Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. etal.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993; и Skerraef al, Science 240: 1038-1040, 1988.

[0163] Химерные и гуманизированные антитела. В одном из вариантов осуществления антитело к DLL3 согласно настоящей технологии представляет собой химерное антитело к DLL3. В одном из вариантов осуществления антитело к DLL3 согласно настоящей технологии представляет собой гуманизированное антитело к DLL3. В одном из вариантов осуществления настоящей технологии антител о-до нор и антитело-акцептор представляют собой моноклональные антитела от разных видов. Например, антитело-акцептор представляет собой антитело человека (для минимизации его антигенности у человека), в таком случае полученное антитело с привитыми CDR называется «гуманизированным» антителом.

[0164] Рекомбинантные антитела к DLL3, такие как химерные и гуманизированные моноклональные антитела, содержащие как человеческие части, так и части нечеловеческого происхождения, могут быть созданы с применением стандартных технологий рекомбинантных ДНК и находятся в пределах объема настоящей технологии. Для некоторых вариантов применения, включая применение in vivo у человека, антител к DLL3 согласно настоящей технологии, а также применение этих агентов в анализах обнаружения in vitro, можно применять химерные или гуманизированные антитела к DLL3. Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела могут быть получены с помощью технологий рекомбинантных ДНК, известных в данной области техники. Такие подходящие способы включают, например, не ограничиваясь перечисленным, способы, описанные в международной заявке PCT/US 86/02269; патенте США №5225539; европейском патенте №184187; европейском патенте №171496; европейском патенте №173494; публикации международной заявки WO 86/01533; патентах США №4816567; 5225539; европейском патенте №125023; Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al, 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al, 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al, 1987. Proc. Natl Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al, 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al, 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al, 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al, 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al, 1988. Science 239: 1534; Morrison, Science 229: 1202, 1985; Oi et al, BioTechniques 4: 214, 1986; Gillies etal, J. Immunol. Methods, 125: 191-202, 1989; патенте США №5807715; и Beidler, et at, 1988. J. Immunol. 141: 4053-4060. Например, антитела могут быть гуманизированы с применением ряда методов, включая привитие CDR (ЕР 0 239 400; WO 91/09967; патент США №5530101; 5585089; 5859205; 6248516; ЕР460167), венирование или ремоделирование поверхности (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Padlan Е. A., Molecular Immunology, 28: 489-498, 1991; Studnicka et al, Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Rogaskaetal.,PNAS9l: 969-973, 1994) и «перетасовку» цепей (патент США №5565332). В одном из вариантов осуществления кДНК, кодирующую мышиное моноклональное антитело к DLL3, расщепляют рестрикционным ферментом, выбранным специально для удаления последовательности, кодирующей константную Fc-область, и заменяют на эквивалентную часть кДНК, кодирующей человеческую константную Fc-область (см. Robinson et al, PCT/US 86/02269; Akira et al, европейская патентная заявка №184187; TaniguCH₁, европейская патентная заявка №171496; Morrison et al, европейская патентная заявка №173494; Neuberger et al, WO 86/01533; Cabilly et al. патент США №4816567; Cabilly et al, европейская патентная заявка №125023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; и Shaw et al. (1988) J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559; патент США №6180370; патенты США №6300064, 6696248, 6706484, 6828422.

[0165] В одном из вариантов осуществления настоящая технология обеспечивает конструирование гуманизированных антител к DLL3, которые с низкой вероятностью вызывают у человека ответ антител к антителу мыши (здесь и далее называемый «НАМА»), при сохранении эффективной эффекторной функции антитела. В контексте настоящей заявки термины «человеческий (человека)» и «гуманизированный» применительно к антителам относятся к любому антителу, которое, как ожидается, будет вызывать терапевтически переносимый слабый иммуногенный ответ у субъекта, представляющего собой человека. В одном из вариантов осуществления настоящая технология обеспечивает гуманизированные антитела к DLL3, тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов.

[0166] CDR-антитела. В некоторых вариантах осуществления антитело к DLL3 согласно настоящей технологии представляет собой CDR-антитело к DLL3. В целом, антитела-доноры и антитела-акцепторы, используемые для создания CDR-антитела к DLL3, представляют собой моноклональные антитела от разных видов, как правило, антитело-акцептор представляет собой антитело человека (для минимизации его антигенности у человека), в этом случае полученное в результате антитело с привитыми CDR называют «гуманизированным» антителом. Привитие может представлять собой привитие единственной области CDR (или даже части единственной CDR) в единственной V_H или V_L антитела-акцептора или может представлять собой привитие нескольких CDR (или их частей) в одной или обеих из V_H и V_L. Часто все три области CDR во всех вариабельных доменов антитела-акцептора заменяют на соответствующие CDR донора, однако необходимой является замена такого количества CDR, которое требуется для обеспечения надлежащего связывания с белком DLL3 полученного антитела с привитыми CDR. Способы создания антител с привитыми CDR и гуманизированных антител описаны в патенте США №5585089, Queen et al.; патенте США №5693761; патенте США №5693762; и патенте США №5225539, Winter; и ЕР 0682040. Способы, применимые для получения полипептидов V_H и V_L, описаны в Winter et al, патентах США №4816397; 6291158; 6291159; 6291161; 6545142; ЕР 0368684; ЕР 0451216; и ЕР 0120694.

[0167] После выбора подходящих кандидатов каркасной области из того же семейства и/или того же члена семейства получают любую или обе из вариабельных областей тяжелой и легкой цепи путем привития CDR из исходных видов на гибридные каркасные области. Сборку гибридных антител или фрагментов гибридных антител, имеющих гибридные вариабельные области цепи, применительно к любому из указанных выше аспектов можно осуществлять с помощью стандартных способов, известных специалисту в данной области техники. Например, последовательности ДНК, кодирующие гибридные вариабельные домены, описанные в настоящей заявке (т.е. каркасы на основе видов-мишеней и областей CDR из исходных видов), могут быть получены путем синтеза олигонуклеотидов и/или ПЦР. Кроме того, нуклеиновая кислота, кодирующая области CDR, может быть выделена из антител исходного вида с использованием подходящих рестрикционных ферментов и лигирована в каркас вида-мишени путем лигирования с помощью подходящих лигирующих ферментов. В качестве альтернативы, каркасные области вариабельных цепей антитела исходного вида могут быть изменены с помощью сайт-направленного мутагенеза.

[0168] Поскольку гибриды конструируют на основе выбранных вариантов из множества кандидатов, соответствующих каждой каркасной области, существует множество комбинаций последовательностей, которые могут быть сконструированы в соответствии с принципами, описанными в настоящей заявке. Соответственно, могут быть построены библиотеки гибридов, содержащие члены с различными комбинациями отдельных каркасных областей. Такие библиотеки могут представлять собой электронные коллекции в виде баз данных последовательностей или физические коллекции гибридов.

[0169] Указанный процесс, как правило, не изменяет FR антитела-акцептор а, фланкирующие привитые CDR. Тем не менее, специалист в данной области иногда может улучшать антигенсвязывающую аффинность полученного антитела к DLL3 с привитыми CDR путем замены определенных остатков отдельно взятой FR, чтобы сделать FR более схожей с соответствующей FR антител а-до нора. Подходящие положения замен включают аминокислотные остатки, смежные с CDR, или остатки, способные взаимодействовать с CDR (см., например, патент США №5585089, в частности, столбцы 12-16). Специалист в данной области техники также может начать с FR донора и модифицировать ее таким образом, чтобы указанная область обладала большим сходством с FR акцептора или человеческой консенсусной FR. Методы введения этих модификаций известны в данной области техники. В частности, если полученная FR соответствует человеческой консенсусной FR в этом положении или по меньшей мере на 90% или более идентична указанной консенсусной FR, такие модификации не могут значительно повысить антигенность полученного модифицированного антитела к DLL3 с привитыми CDR по сравнению с тем же самым антителом, содержащим полностью человеческую FR.

[0170] Биспецифичные антитела (BsAb). Биспецифичное антитело представляет собой антитело, которое связывается одновременно с двумя мишенями, которые имеют разную структуру, например, двумя разными антигенами-мишенями, двумя разными эпитопами на одном и том же антигене-мишени. BsAb могут быть получены, например, путем комбинирования тяжелых цепей и/или легких цепей, которые распознают разные эпитопы одного и того же или разных антигенов. В некоторых вариантах осуществления с точки зрения молекулярной функции биспецифичный связывающий агент связывает один антиген (или эпитоп) на одном из своих двух связывающих плеч (одна пара VH/VL) и связывает другой антиген (или эпитоп) на своем втором плече (другая пара VH/VL). Согласно данному определению, биспецифичный связывающий агент имеет два разных антигенсвязывающих плеча (как по специфичности, так и по последовательностям CDR) и является одновалентным для каждого антигена, с которым он связывается.

[0171] Биспецифичные антитела (BsAb) и биспецифичные фрагменты антител (BsFab) согласно настоящей технологии содержат по меньшей мере одно плечо, которое специфично связывается с, например, DLL3, и по меньшей мере одно другое плечо, которое специфично связывается со вторым антигеном-мишенью. В отдельных вариантах осуществления BsAb способны связываться опухолевыми клетками, экспрессирующими антиген DLL3 на поверхности клетки.

[0172] Различные биспецифичные слитые белки могут быть получены методами молекулярной инженерии. Например, были сконструированы BsAb, в которых используется целый каркас иммуноглобулина (например, IgG), одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv) или их комбинация. В некоторых вариантах осуществления биспецифичный слитый белок является двухвалентным и содержит, например, scFv с единственным сайтом связывания для одного антигена и Fab-фрагмент с единственным сайтом связывания для второго антигена. В некоторых вариантах осуществления биспецифичный слитый белок является двухвалентным и содержит, например, scFv с единственным сайтом связывания для одного антигена и другой scFv-фрагмент с единственным сайтом связывания для второго антигена. В других вариантах осуществления биспецифичный слитый белок является тетравалентным и содержит, например, иммуноглобулин (например, IgG) с двумя сайтами связывания для одного антигена и два идентичных scFv для второго антигена. Было показано, что BsAb, состоящие из двух последовательно расположенных единиц scFv, являются клинически успешным биспецифичный форматом антител. В некоторых вариантах осуществления были сконструированы BsAb, содержащие два последовательно расположенных одноцепочечных вариабельных фрагмента (scFv), так что scFv, который связывается с опухолевым антигеном (например, DLL3), связан с scFv, которое связывается с другим антигеном-мишенью.

[0173] Недавно разработанные способы получения BsAb включают сконструированные рекомбинантные моноклональные антитела, которые содержат дополнительные остатки цистеина, так что указанные антитела обладает более сильным поперечным сшиванием по сравнению с более распространенными изотипами иммуноглобулинов. См., например, FitzGerald et al, Protein Eng. 10(10): 1221-1225 (1997). Другой подход представляет собой конструирование рекомбинантных слитых белков, связывающих два или более различных одноцепочечных антител или сегментов фрагмента антитела с необходимыми двойными специфичностями. См., например, Coloma et al, Nature Biotech. 15:159-163 (1997). Различные биспецифичные слитые белки могут быть получены методами молекулярной инженерии.

[0174] Биспецифичные слитые белки, связывающие два или более разных одноцепочечных антител или фрагментов антитела, получают аналогичным образом. Для получения разнообразных слитых белков могут быть использованы рекомбинантные методы. В отдельных вариантах осуществления BsAb согласно настоящей технологии содержит иммуноглобулин, который содержит тяжелую цепь и легкую цепь, и scFv. В отдельных вариантах осуществления scFv связан с С-концом тяжелой цепи любого иммуноглобулина к DLL3, раскрытого в настоящей заявке. В отдельных вариантах осуществления scFv связаны с С-концом легкой цепи любого иммуноглобулина к DLL3, раскрытого в настоящей заявке. В различных вариантах осуществления scFv связаны с тяжелыми или легкими цепями через линкерную последовательность. Подходящие линкерные последовательности для связывания внутри рамки считывания Fd тяжелой цепи с scFv вводят в домены V_L и V_каппа посредством ПЦР-реакций. Фрагмент ДНК, кодирующий scFv, затем лигируют в стейджинг-вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую домен СН1. Полученную конструкцию scFv-CH1 вырезают и лигируют в вектор, содержащий последовательность ДНК, кодирующую область V_H антитела к DLL3. Полученный в результате вектор может быть использован для трансфекции подходящей клетки-хозяина, такой как клетка млекопитающего, для экспрессии биспецифичного слитого белка.

[0175] В некоторых вариантах осуществления линкер имеет по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более аминокислот в длину. В некоторых вариантах осуществления линкер характеризуется тем, что имеет тенденцию не принимать жесткую трехмерную структуру, а скорее придает гибкость полипептиду (например, первому и/или второму антигенсвязывающим сайтам). В некоторых вариантах осуществления линкер, используемый в BsAb, описанном в настоящей заявке, выбирают на основании определенных свойств, присущих BsAb, таких как, например, повышение стабильности. В некоторых вариантах осуществления BsAb согласно настоящей технологии содержит линкер G4S. В отдельных вариантах осуществления BsAb согласно настоящей технологии содержит линкер (G₄S)_n, где п равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15 или более.

[0176] Модификации Fc. В некоторых вариантах осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии содержат вариантную Fc-область, где указанная вариантная Fc-область содержит по меньшей мере одну аминокислотную модификацию по сравнению с Fc-областью дикого типа (или исходной Fc-областью), так, что указанная молекула имеет измененную аффинность к Fc-рецептору (например, FcγR), при условии, что указанная вариантная Fc-область не содержит замены в положениях, непосредственно контактирующих с Fc-рецептором, на основе кристаллографического и структурного анализа взаимодействий Fc/Fc-рецептор, таких как раскрытые в Sondermann et al., Nature, 406:267-273 (2000). Примеры положений в Fc-области, которые непосредственно контактируют с Fc-рецептором, таким как FcγR, включают аминокислоты 234-239 (шарнирная область), аминокислоты 265-269 (В/С-петля), аминокислоты 297-299 (С7Е-петля) и аминокислоты 327-332 (F/G-петля).

[0177] В некоторых вариантах осуществления антитело к DLL3 согласно настоящей технологии, обладающее измененной аффинностью к активирующим и/или ингибирующим рецепторам, имеет вариантную Fc-область с одной или более аминокислотными модификациями, где указанные одна или более аминокислотных модификаций представляют собой замену N297 на аланин или замену K322 на аланин.

[0178] Модификации гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии имеют Fc-область с вариантным гликозилированием по сравнению с исходной Fc-областью. В некоторых вариантах осуществления вариантное гликозилирование включает отсутствие фукозы; в некоторых вариантах осуществления вариантное гликозилирование является результатом экспрессии в GnT1-дефицитных клетках СНО.

[0179] В некоторых вариантах осуществления антитела согласно настоящей технологии могут иметь модифицированный сайт гликозилирования по сравнению с соответствующим эталонным антителом, которое связывается с представляющим интерес антигеном (например, DLL3), без изменения функциональности указанного антитела, например, активности связывания с антигеном. В контексте настоящей заявки «сайты гликозилирования» включают любую конкретную аминокислотную последовательность антитела, к которой специфично и ковалентно присоединяется олигосахарид (т.е. углеводы, содержащие два или более простых сахара, связанных вместе).

[0180] Олигосахаридные боковые цепи, как правило, связаны с остовом антитела через N- или О-связи. N-связанное гликозилирование относится к присоединению олигосахаридного фрагмента к боковой цепи аспарагинового остатка. О-связанное гликозилирование относится к присоединению олигосахаридного фрагмента к гидроксиаминокислоте, например, серину, треонину. Например, в клетках СНО может быть продуцирована Fc-гликоформа (hDLL3-IgGln), в которой отсутствуют отдельные олигосахариды, включая фукозу и концевой N-ацетилглюкозамин, и она может проявлять повышенную эффекторную функцию АЗКЦ (антителозависимая клеточная цитотоксичность).

[0181] В некоторых вариантах осуществления содержание углеводов в композициях на основе иммуноглобулинов, раскрытых в настоящей заявке, модифицировано путем добавления или удаления сайта гликозилирования. Способы модификации содержания углеводов в антителах хорошо известны в данной области техники и включены в настоящую технологию, см., например, патент США №6218149; ЕР 0359096 В1; публикацию патентной заявки США №2002/0028486; публикацию международной патентной заявки WO 03/035835; публикацию патентной заявки США №2003/0115614; патент США №6218149; патент США №6472511; все из которых полностью включены в настоящую заявку посредством ссылки. В некоторых вариантах осуществления содержание углеводов в антителе (или его соответствующей части или компоненте) модифицируют путем удаления одного или более эндогенных углеводных фрагментов антитела. В отдельных вариантах осуществления настоящая технология включает удаление сайта гликозилирования Fc-области антитела путем модификации положения 297 с аспарагина на аланин.

[0182] Сконструированные гликоформы могут быть пригодны для множества целей, включая, не ограничиваясь перечисленным, усиление или снижение эффекторной функции. Сконструированные гликоформы могут быть получены любым способом, известным специалисту в данной области техники, например с использованием сконструированных или вариантных экспрессионных штаммов, путем коэкспрессии с одним или более ферментами, например, N-ацетилглюкозаминилтрансферазой III (GnTIII), путем экспрессии молекулы, содержащей Fc-область, в разных организмах или клеточных линиях из разных организмов, или путем модификации углевода(ов) после того, как молекула, содержащая Fc-область, была экспрессирована. Способы получения сконструированных гликоформ известны в данной области техники и включают, не ограничиваясь перечисленным, способы, описанные в источниках Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol. 17: 176-180; Davies et al, 2001, Biotechnol. Bioeng. 74:288-294; Shields et al, 2002, J. Biol Chem. 277:26733-26740; Shinkawa et al, 2003, J. Biol Chem. 278:3466-3473; патенте США№6602684; патентной заявке США №10/277,370; патентной заявке США №10/113,929; публикациях международных патентных заявок WO 00/61739А1; WO 01/292246 А1; WO 02/311140 А1; WO 02/30954 А1; технологии POTILLEGENT (Biowa, Inc. Принстон, Нью-Джерси); технологии конструирования гликозилирования GLYCOMAB™ (GLYCART biotechnology AG, Цюрих, Швейцария), каждый из которых полностью включен в настоящую заявку посредством ссылки. См., например, публикацию международной патентной заявки WO 00/061739; публикацию патентной заявки США №2003/0115614; Okazaki et al, 2004, JMB, 336: 1239-49.

[0183] Слитые белки. В одном из вариантов осуществления антитело к DLL3 согласно настоящей технологии представляет собой слитый белок. Антитела к DLL3 согласно настоящей технологии при слиянии со вторым белком могут быть использованы в качестве антигенной метки. Примеры доменов, которые могут быть слиты с полипептидами, включают не только гетерологичные сигнальные последовательности, но также другие гетерологичные функциональные области. Слияние не обязательно должно быть непосредственным, а может происходить через линкерные последовательности. Более того, слитые белки согласно настоящей технологии также могут быть сконструированы для улучшения характеристик антител к DLL3. Например, область дополнительных аминокислот, в частности, заряженных аминокислот, может быть добавлена к N-концу антитела к DLL3 для улучшения стабильности и устойчивости во время очистки из клетки-хозяина или последующей работы и хранения. Кроме того, к антителу к DLL3 могут быть добавлены пептидные фрагменты для облегчения очистки. Такие области могут быть удалена перед получением готового антитела к DLL3. Добавление пептидных фрагментов для облегчения работы с полипептидами представляет собой изученные и стандартные методы в данной области техники. Антитело к DLL3 согласно настоящей технологии может быть слито с маркерными последовательностями, такими как пептид, облегчающий очистку слитого полипептида. В отдельных вариантах осуществления маркерная аминокислотная последовательность представляет собой гексагистидиновый пептид, такой как метка, представленная в векторе pQE (QIAGEN, Inc., Чатсворт, Калифорния), и другие, многие из которых являются коммерчески доступными. Например, как описано в Gentz et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989, гексагистидин обеспечивает удобную очистку слитого белка. Другая пептидная метка, подходящая для очистки, метка «НА», соответствует эпитопу, происходящему из белка гемагглютинина вируса гриппа. Wilson etal, Cell 37: 767, 1984.

[0184] Таким образом, любой их указанных выше слитых белков может быть сконструирован с использованием полинуклеотидов или полипептидов согласно настоящей технологии. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления слитые белки, описанные в настоящей заявке, имеют повышенное время полужизни in vivo.

[0185] Слитые белки, имеющие связанные дисульфидными связями димерные структуры (благодаря IgG), могут быть более эффективными в связывании и нейтрализации других молекул по сравнению с мономерным секретированным белком или фрагментом белка в отдельности. Fountoulakis et al, J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995.

[0186] Аналогичным образом, в ЕР-А-О 464 533 (канадский эквивалент 2045869) описаны слитые белки, содержащие разные части константной области молекул иммуноглобулинов вместе с другим человеческим белком или его фрагментом. Во многих случаях Fc-часть в слитом белке является благоприятной для терапии и диагностики и, таким образом, может обеспечивать, например, улучшенные фармакокинетические свойства См. ЕР-А 0232 262. В качестве альтернативы, могут быть желательными делеция или модификация Fc-части после того, как слитый белок был экспрессирован, обнаружен и очищен. Например, Fc-часть может препятствовать терапии и диагностике, если слитый белок применяется в качестве антигена для иммунизаций. Для поиска новых лекарственных средств человеческие белки, например, такие как hIL-5, сливают с Fc-частями для высокоэффективных скрининговых анализов для идентификации антагонистов hIL-5. Bennett et al, J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson etal, J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995.

[0187] Меченые антитела к DLL3. В одном из вариантов осуществления антитело к DLL3 согласно настоящей технологии соединено с метящим фрагментом, т.е. детектируемой группой. Конкретная метка или детектируемая группа, конъюгированная с антителом к DLL3, не является ключевым аспектом технологии, при условии, что она по существу не препятствует специфичному связыванию антитела к DLL3 согласно настоящей технологии с белком DLL3. Детектируемая группа может представлять собой любой материал, обладающий поддающимся обнаружению физическим или химическим свойством. Такие детектируемые метки хорошо изучены в области иммуноанализов и визуализации. В целом, почти любая метка, применимая в таких способах, может применяться согласно настоящей технологии. Таким образом, метка представляет собой любую композицию, поддающуюся обнаружению с помощью спектроскопических, фотохимических, биохимических, иммунохимических, электрических, оптических или химических средств. Метки, пригодные для практического применения в настоящей технологии, включают магнитные гранулы (например, Dynabeads™), флуоресцентные красители (например, флуоресцеинизотиоцианат, техасский красный, родамин и т.п.), радиоизотопные метки (например, ³Н, ¹⁴С, ³⁵S, ¹²⁵I, ¹²¹I, ¹³¹I, ¹¹²In, ^99mTc), другие визуализирующие агенты, такие как микропузырьки (для ультразвуковой визуализации), ¹⁸F, ¹¹C, ¹⁵O, ⁸⁹Zr (для позитронно-эмиссионной томографии), ^99mTc, ¹¹¹In (для однофотонной эмиссионной томографии), ферменты (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу и другие обычно используемые в ELISA) и колориметрические метки, такие как коллоидное золото или гранулы из цветного стекла или пластика (например, полистирола, полипропилена, латекса и т.п.). Патенты, где описано применение таких меток, включают патенты США №3817837, 3850752, 3939350, 3996345, 4277437, 4275149 и 4366241, каждый из которых полностью и для любых целей включен в настоящую заявку посредством ссылки. См. также Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6^th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.).

[0188] Метка может быть связана прямо или опосредованно с желаемым компонентом анализа в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. Как указано выше, может быть использован целый ряд различных меток, при этом выбор метки зависит от таких факторов, как необходимая чувствительность, простота конъюгирования с соединением, требуемая стабильность, доступное оборудование и условия утилизации.

[0189] Нерадиоактивные метки часто присоединяют опосредованно. Как правило, молекулу лиганда (например, биотина) ковалентно присоединяют к молекуле. Затем лиганд связывается с антилигандом (например, стрептавидином), который либо сам по себе поддается обнаружению, либо ковалентно связан с сигнальной системой, такой как детектируемый фермент, флуоресцентное соединение или хемилюминесцентное соединение. Может быть использован целый ряд лигандов и антилигандов. Когда для лиганда существует природный антилиганд, например, биотин, тироксин и кортизол, лиганд может быть использован вместе с мечеными природными антилигандами. В качестве альтернативы, любое гаптеновое или антигенное соединение может быть использовано в комбинации с антителом, например, антителом к DLL3.

[0190] Молекулы также могут быть конъюгированы непосредственно с генерирующими сигнал соединениями, например, путем конъюгации с ферментом или флуорофором. Ферменты, представляющие интерес в качестве меток, в основном представляют собой гидролазы, в частности, фосфатазы, эстеразы и гликозидазы, или оксидоредуктазы, в частности, пероксидазы. Флуоресцентные соединения, пригодные в качестве метящих фрагментов, включают, не ограничиваясь перечисленным, например, флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон и т.п. Хемилюминесцентные соединения, пригодные в качестве метящих фрагментов, включают, не ограничиваясь перечисленным, например, люциферин и 2,3-дигидрофталазиндионы, например, люминол. Обзор различных метящих или сигнал-генерирующих систем, которые могут быть использованы, см. в патенте США №4391904.

[0191] Способы обнаружения меток хорошо известны специалистам в данной области техники. Таким образом, например, когда метка представляет собой радиоактивную метку, способы обнаружения включают сцинтилляционный счетчик или фотопленку, как в случае ауторадиографии. Когда метка представляет собой флуоресцентную метку, она может быть обнаружена путем возбуждения флуорохрома светом с подходящей длиной волны и обнаружения полученной в результате флуоресценции. Флуоресценция может быть обнаружена визуально с помощью фотопленки, путем применения электронных детекторов, таких как устройства с зарядовой связью (CCD) или фотоумножители, и т.п. Аналогичным образом, ферментативные метки могут быть обнаружены путем обеспечения подходящих субстратов для фермента и обнаружения полученного продукта реакции. Наконец, простые колориметрические метки могут быть обнаружены просто путем наблюдения цвета, связанного с меткой. Так, в различных анализах с помощью индикаторных полосок конъюгированное золото часто приобретает розовый цвет, а различные конъюгированные гранулы приобретают цвет гранулы.

[0192] Некоторые форматы анализов не требуют применения меченых компонентов. Например, для обнаружения наличия целевых антител, например, антител к DLL3, могут быть использованы анализы агглютинации. В данном случае покрытые антигеном частицы агглютинируются образцами, содержащими целевые антитела. В этом формате нет необходимости метить какой-либо из компонентов, а наличие целевого антитела определяют путем простой визуальной оценки.

В. Идентификация и определение характеристик антител к DLL3 согласно настоящей технологии

[0193] Способы идентификации и/или скрининга антител к DLL3 согласно настоящей технологии. Способы, пригодные для идентификации и скрининга антител к полипептидам DLL3 на предмет антител, обладающих желаемой специфичностью к белку DLL3 (например, антител, связывающихся с внеклеточным доменом DLL3), включают любые иммунологически-опосредованные методы, известные в данной области техники. Компоненты иммунного ответа могут быть определены in vitro с помощью различных способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, (1) цитотоксические Т-лимфоциты могут быть инкубированы с радиоактивно мечеными клетками-мишенями, и лизис указанных клеток-мишеней может быть определен по высвобождению радиоактивности;

(2) хелперные Т-лимфоциты могут быть инкубированы с антигенами и антигенпрезентирующими клетками, и синтез и секреция цитокинов могут быть измерены стандартными методами (Windhagen A et at, Immunity, 2: 373-80, 1995);

(3) антигенпрезентирующие клетки могут быть инкубированы с целым белковым антигеном, и презентация этого антигена на МНС может быть обнаружена либо по анализам активации Т-лимфоцитов, либо с помощью биофизических методов (Harding et at, Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989); (4) тучные клетки могут быть инкубированы с реагентами, которые перекрестно связывают их рецепторы Fc-эпсилон, и может быть измерено высвобождение гистамина путем ферментативного иммуноанализа (Siraganian et at, TIPS, 4: 432-437, 1983); и (5) твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA).

[0194] Аналогичным образом продукты иммунного ответа в любом модельном организме (например, мыши) или в организме субъекта, представляющего собой человека, также могут быть определены с помощью различных способов, которые хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, (1) продукция антител в ответ на вакцинацию может легко быть обнаружена с помощью стандартных способов, используемых в настоящее время в клинических лабораториях, например, ELISA; (2) миграция иммунных клеток к местам воспаления может быть обнаружена путем нанесения царапины на поверхности кожи и размещения стерильного контейнера для захвата мигрирующих клеток на месте царапины (Peters et at, Blood, 72: 1310-5, 1988); (3) пролиферация мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) в ответ на митогены или реакцию смешанной культуры лимфоцитов может быть измерена с использованием ³Н-тимидина; (4) фагоцитарная способность гранулоцитов, макрофагов и других фагоцитов в МНПК может быть измерена путем помещения МНПК в лунки вместе с мечеными частицами (Peters et al, Blood, 72: 1310-5, 1988); и (5) дифференцировка клеток иммунной системы может быть измерена путем мечения МНПК антителами к молекулам CD, таким как CD4 и CD8, и измерения фракции МНПК, экспрессирующих указанные маркеры.

[0195] В одном из вариантов осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии выбирают с помощью дисплея пептидов DLL3 на поверхности реплицируемых единиц генетической информации. См., например, патенты США №5514548, 5837500, 5871907, 5885793, 5969108, 6225447, 6291650, 6492160; ЕР 585 287; ЕР 605522; ЕР 616640; ЕР 1024191; ЕР 589 877; ЕР 774 511; ЕР 844 306. Были описаны способы, подходящие для продуцирования/отбора частицы нитевидного бактерифага, содержащего фагмидный геном, кодирующий связывающую молекулу, обладающую желаемой специфичностью. См., например, ЕР 774 511; US 5871907; US 5969108; US 6225447; US 6291650; US 6492160.

[0196] В некоторых вариантах осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии отбирают с помощью дисплея пептидов DLL3 на поверхности дрожжевой клетки-хозяина. Способы, пригодные для выделения полипептидов scFv с помощью дисплея на поверхности дрожжей, были описаны в Kieke et al, Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10.

[0197] В некоторых вариантах осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии отбирают с помощью рибосомного дисплея. Способы, пригодные для идентификации лигандов в пептидных библиотеках с помощью рибосомного дисплея, были описаны в Mattheakis et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994; и Hanes et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997.

[0198] В отдельных вариантах осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии отбирают с помощью тРНК-дисплея пептидов DLL3. Способы, пригодные для отбора in vitro лигандов с помощью тРНК-дисплея, были описаны Merryman et al, Chem. Biol, 9: 741-46, 2002.

[0199] В одном из вариантов осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии отбирают с помощью РНК-дисплея. Способы, пригодные для отбора пептидов и белков с помощью библиотек РНК-дисплея, были описаны Roberts etal. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 12297-302, 1997; и Nemoto et al, FEBS Lett., 414: 405-8, 1997. Способы, пригодные для отбора пептидов и белков с помощью библиотек дисплея неприродных РНК, были описаны Frankel etal, Curr. Opin. Struct. Biol, 13: 506-12, 2003.

[0200] В некоторых вариантах осуществления антитела к DLL3 согласно настоящей технологии экспрессируют в периплазме грамотрицательных бактерий и смешивают с меченым белком DLL3. См. WO 02/34886. В клонах, экспрессирующих рекомбинантные полипептиды с аффинностью к белку DLL3, концентрация меченого белка DLL3, связанного с антителом к DLL3, повышена, что позволяет выделять клетки из остальной библиотеки, как описано в Harvey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 22: 9193-98 2004 и публикации патентной заявки США №2004/0058403.

[0201] Предполагается, что после отбора желаемых антител к DLL3 указанные антитела можно получать в большом объеме с помощью любого метода, известного специалистам в данной области техники, например, экспрессии в прокариотических или эукариотических клетках, и т.п.Антитела к DLL3, которые представляют собой, например, не ограничиваясь перечисленным, гибридные антитела к DLL3 или их фрагменты, могут быть получены с использованием общепринятых методов конструирования вектора экспрессии, который кодирует тяжелую цепь антитела, в которой области CDR и, если необходимо, минимальная часть каркаса вариабельной области, которые требуются для сохранения специфичности связывания антитела исходного вида (сконструированного в соответствии с методиками, описанными в настоящей заявке), происходят из антитела исходного вида, а остальная часть антитела происходит из иммуноглобулина целевого вида, с которым можно проводить манипуляции, как описано в настоящей заявке, с получением, таким образом, вектора для экспрессии гибридной тяжелой цепи антитела.

[0202] Измерение связывания DLL3. В некоторых вариантах осуществления анализ связывания DLL3 относится к формату анализа, в котором белок DLL3 и антитело к DLL3 смешивают в условиях, подходящих для связывания между белком DLL3 и антителом к DLL3, и проводят количественную оценку величины связывания между белком DLL3 и антителом к DLL3. Величину связывания сравнивают с подходящим контролем, который может представлять собой величину связывания в отсутствие белка DLL3, величину связывания в присутствии композиции неспецифичного иммуноглобулина, или обе из них. Величина связывания может быть оценена любым подходящим способом. Способы анализа связывания включают, например, ELISA, радиоиммуноанализы, сцинтилляционные анализы сближения, анализы переноса энергии флуоресценции, жидкостную хроматографию, анализы методом мембранной фильтрации и т.п.Биофизические анализы для прямого измерения связывания белка DLL3 с антителом к DLL3 представляют собой, например, ядерный магнитный резонанс, флуоресценцию, поляризацию флуоресценции, поверхностный плазмонный резонанс (чипы BIACORE), биослойную интерферометрию и т.п.Специфичное связывание определяют с помощью стандартных анализов, известных в данной области техники, например, анализов связывания радиолигандов, ELISA, FRET, иммунопреципитации, SPR, ЯМР (2D ЯМР), масс-спектрометрии и т.п.Если специфичное связывание кандидатного антитела к DLL3 по меньшей мере на 1 процент превышает связывание, наблюдаемое в отсутствие указанного кандидатного антитела к DLL3, указанное кандидатное антитело к DLL3 пригодно в качестве антитела к DLL3 согласно настоящей технологии.

Применение антител к DLL3 согласно настоящей технологии

[0203] Общие положения. Антитела согласно настоящей технологии пригодны в способах, известных в данной области техники, относящихся к локализации и/или количественному определению полипептидов DLL3 (например, для применения для измерения уровней белка DLL3 в подходящих физиологических образцах, для применения в способах диагностики, для применения для визуализации полипептида и т.д.). Антитела к DLL3 согласно настоящей технологии пригодны для выделения полипептида DLL3 с помощью стандартных методов, таких как аффинная хроматография или иммунопреципитация. Антитело к DLL3 согласно настоящей технологии может облегчать очистку природных иммунореактивных белков DLL3 из биологических образцов, например, сыворотки крови или клеток млекопитающего, а также полученных рекомбинантный путем иммунореактивных белков DLL3, экспрессируемых в системе хозяина. Более того, антитела к DLL3 согласно настоящей технологии могут применяться для обнаружения иммунореактивного белка DLL3 (например, в плазме, клеточном лизате или клеточном супернатанте) для оценки количества и профиля экспрессии иммунореактивного полипептида. Антитела к DLL3 согласно настоящей технологии могут применяться в диагностических целях для мониторинга уровней иммунореактивного белка DLL3 в ткани как часть процедуры клинического исследования, например, для определения эффективности данного режима лечения. Как отмечено выше, обнаружение может быть облегчено путем соединения (т.е. физического связывания) антител к DLL3 согласно настоящей технологии с детектируемым веществом.

[0204] Обнаружение белка DLL3. Пример способа обнаружения наличия или отсутствия иммунореактивного белка DLL3 в биологическом образце включает получение биологического образца от исследуемого субъекта и приведение указанного биологического образца в контакт с антителом к DLL3 согласно настоящей технологии, способным обнаруживать иммунореактивный белок DLL3, таким образом, что в биологическом образце осуществляется обнаружение наличия указанного иммунореактивного белка DLL3. Обнаружение может быть осуществлено с помощью детектируемой метки, присоединенной к антителу.

[0205] Под термином «меченое» применительно к антителу к DLL3 подразумевается прямое мечение антитела путем соединения (т.е. физического связывания) детектируемого вещества с указанным антителом, а также опосредованное мечение антитела путем проведения реакции с другим соединением, которое является напрямую меченым, таким как вторичное антитело. Примеры опосредованного мечения включают обнаружение первичного антитела с помощью флуоресцентно меченных вторичных антител и концевое мечение ДНК-зонда биотином, чтобы его можно было обнаружить с помощью флуоресцентно меченого стрептавидина.

[0206] В некоторых вариантах осуществления антитела к DLL3, раскрытые в настоящей заявке, конъюгированы с одной или более детектируемыми метками. Для таких вариантов применения антитела к DLL3 могут быть мечены детектируемой меткой путем ковалентного или нековалентного присоединения хромогенного, ферментативного, радиоизотопного, изотопного, флуоресцентного, токсичного, хемилюминесцентного агента, контрастного агента для ядерного магнитного резонанса или другой метки.

[0207] Примеры подходящих хромогенных меток включают диаминобензидин и 4-гидроксиазобензол-2-карбоновую кислоту. Примеры подходящих ферментативных меток включают малатдегидрогеназу, стафилококковую нуклеазу, Δ-5-стероидизомеразу, дрожжевую алкогольдегидрогеназу, α-глицерофосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, пероксидазу, щелочную фосфатазу, аспарагиназу, глюкозооксидазу, β-галактозидазу, рибонуклеазу, уреазу, каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, глюкоамилазу и ацетилхолинэстеразу.

[0208] Примеры подходящих радиоизотопных меток включают ³Н, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ³²Р, ³⁵S, ¹⁴С, ⁵¹Cr, ⁵⁷То, ⁵⁸Со, ⁵⁹Fe, ⁷⁵Se, ¹⁵²Eu, ⁹⁰Y, ⁶⁷Cu, ²¹⁷Ci, ²¹¹At, ²¹²Pb, ⁴⁷Sc, ¹⁰⁹Pd и т.п. ¹¹¹In представляет собой пример изотопа, при использовании которого применяется in vivo визуализация, поскольку он позволяет избежать проблем, связанных с дегалогенированием в печени ¹²⁵I- или ¹³¹I-меченых DLL3-связывающих антител. Кроме того, указанный изотоп обладает более предпочтительной для визуализации энергией гамма-излучения (Perkins et al, Eur. J. Nucl. Med. 70:296-301 (1985); Carasquillo et al., J. Nucl. Med. 25:281-287 (1987)). Например, для ¹¹¹In, связанного с моноклональными антителами с 1-(Р-изотиоцианатбензил)-ВРТА, наблюдается слабый захват в неопухолевых тканях, в частности, печени, и повышенная специфичность опухолевой локализации (Esteban et al., J. Nucl. Med. 28:861-870 (1987)). Примеры подходящих нерадиоактивных изотопных меток включают ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Tr и ⁵⁶Fe.

[0209] Примеры подходящих флуоресцентных меток включают метку ¹⁵²Eu, флуоресцеиновую метку, изотиоцианатную метку, родаминовую метку, фикоэритриновую метку, фикоцианиновую метку, аллофикоцианиновую метку, метку зеленого флуоресцентного белка (GFP), метку о-фталевого альдегида и флуорескаминовую метку. Примеры подходящих меток на основе токсинов включают дифтерийный токсин, рицин и холерный токсин.

[0210] Примеры хемилюминесцентных меток включают метку люминола, метку изолюминола, метку ароматического сложного эфира акридиния, имидазольную метку, метку соли акридиния, метку оксалатного сложного эфира, люцифериновую метку, люциферазную метку и эквориновую метку. Примеры контрастных агентов для ядерного магнитного резонанса включают ядра тяжелых металлов, таких как Gd, Мп и железо.

[0211] Способ обнаружения согласно настоящей технологии может применяться для обнаружения наличия иммунореактивного белка DLL3 в биологическом образце in vitro, а также in vivo. In vitro методы обнаружения иммунореактивного белка DLL3 включают твердофазные иммуноферментные анализы (ELISA), вестерн-блоттинг, иммунопреципитацию, радиоиммуноанализ и иммунофлуоресценцию. Кроме того, in vivo методы обнаружения иммунореактивного белка DLL3 включают введение субъекту меченого антитела к DLL3. Например, антитело к DLL3 может быть мечено радиоактивным маркером, присутствие и локализация которого в организме субъекта могут быть обнаружены с помощью стандартных методов визуализации. В одном из вариантов осуществления биологический образец содержит молекулы белка DLL3 из организма исследуемого субъекта.

[0212] Иммуноанализ и визуализация. Антитело к DLL3 согласно настоящей технологии может применяться для анализа уровней иммунореактивного белка DLL3 в биологическом образце (например, плазме человека) с помощью методов на основе антител. Например, экспрессия белка в тканях может быть изучена с помощью классических иммуногистохимических методов. Jalkanen, М. etal.,J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen, M. etal, J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987. Другие методы на основе антител, пригодные для обнаружения экспрессии генов белков, включают иммуноанализы, такие как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) и радиоиммуноанализ (RIA). Подходящие метки для анализа на основе антител известны в данной области техники и включают ферментативные метки, такие как глюкозооксидаза, и радиоизотопы или другие радиоактивные агенты, такие как иод (¹²⁵I, ¹²¹I, ¹³¹I), углерод (¹⁴С), сера (³⁵S), тритий (³Н), индий (¹¹¹In) и технеций (^99mTc), и флуоресцентные метки, такие как флуоресцеин, родамин и зеленый флуоресцентный белок (GFP), а также биотин.

[0213] Помимо анализа уровней иммунореактивного белка DLL3 в биологическом образце, антитела к DLL3 согласно настоящей технологии могут применяться для in vivo визуализации DLL3. Антитела, пригодные для данного метода, включают антитела, детектируемые с помощью рентгенографии, ЯМР или электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Для рентгенографии подходящие метки включают радиоизотопы, такие как барий или цезий, которые испускают детектируемое излучение, но не наносят явного вреда субъекту. Подходящие маркеры для ЯМР и ЭПР включают маркеры с детектируемым характеристическим спином, такие как дейтерий, которые могут быть включены в антитела к DLL3 путем мечения питательных веществ для соответствующего клона scFv.

[0214] Субъекту вводят (например, парентерально, подкожно или внутрибрюшинно) антитело к DLL3 согласно настоящей технологии, которое было мечено подходящим детектируемым фрагментом для визуализации, таким как радиоизотоп (например, ¹³¹I, ¹¹¹In, ⁹⁹mTc, ¹⁸F, ⁸⁹Zr), рентгеноконтрастное вещество или материал, детектируемый с помощью ядерного магнитного резонанса. Специалисту в данной области техники будет ясно, что размер субъекта и используемая система визуализации будут определять количество фрагмента для визуализации, необходимое для получения диагностических изображений. В случае радиоизотопного фрагмента для субъекта, представляющего собой человека, вводимая радиоактивная доза в норме составляет от 5 до 20 милликюри ^99mTc.Меченое антитело к DLL3 затем накапливается в месте расположения клеток, которые содержат определенный полипептид-мишень. Например, меченые антитела к DLL3 согласно настоящей технологии будут накапливаться у субъекта в клетках и тканях, в которых локализовался белок DLL3.

[0215] Таким образом, настоящая технология обеспечивает способ диагностики патологического состояния, включающий: (а) анализ экспрессии иммунореактивного белка DLL3 путем измерения связывания антитела к DLL3 согласно настоящей технологии в клетках или биологической жидкости индивидуума; (b) сравнение количества иммунореактивного белка DLL3, присутствующего в образце, со стандартным эталоном, где увеличение или уменьшение уровней иммунореактивного белка DLL3 по сравнению с эталоном указывает на патологическое состояние.

[0216] Аффинная очистка. Антитела к DLL3 согласно настоящей технологии могут применяться для очистки иммунореактивного белка DLL3 из образца. В некоторых вариантах осуществления антитела иммобилизованы на твердом носителе. Примеры таких твердых носителей включают пластики, такие как поликарбонат, сложные углеводы, такие как агароза и сефароза, акриловые смолы, такие как гранулы из полиакриламида и латекса. Методы связывания антител с такими твердыми носителями хорошо известны в данной области техники (Weir et al., "Handbook of Experimental Immunology" 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby etal.,Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974)).

[0217] Простейшим способом связывания антигена с матрицей связанного с носителем антитела является сбор гранул в колонке и пропускание раствора антигена через указанную колонку. Эффективность этого метода зависит от продолжительности контакта между иммобилизованным антителом и антигеном, которое может быть увеличено за счет снижения скорости потока. Иммобилизованное антитело захватывает антиген по мере его прохождения через колонку. В качестве альтернативы, антиген может взаимодействовать с матрицей связанного с носителем антитела в результате смешивания раствора антигена с носителем (например, гранулами) и вращения или покачивания полученной суспензии с обеспечением максимального контакта между антигеном и иммобилизованным антителом. После завершения реакции связывания суспензию пропускают через колонку для сбора гранул. Гранулы промывают с использованием подходящего промывочного буфера и затем элюируют чистый или по существу чистый антиген.

[0218] Представляющее интерес антитело или полипептид могут быть конъюгированы с твердым носителем, таким как гранула. Кроме того, первый твердый носитель, такой как гранула, также при желании может быть конъюгирован со вторым твердым носителем, который может представлять собой вторую гранулу или другой носитель, с помощью любых подходящих способов, включая способы, раскрытые в настоящей заявке в отношении конъюгации полипептида с носителем. Соответственно, любые из способов и средств конъюгации, раскрытых в настоящей заявке со применительно к конъюгации полипептида с твердым носителем, также могут применяться для конъюгации первого носителя со вторым носителем, где указанные первый и второй носитель могут быть одинаковыми или разными.

[0219] Подходящие линкеры, которые могут представлять собой поперечно-сшивающие агенты, для применения для конъюгации полипептида с твердым носителем, включают множество агентов, которые могут реагировать с функциональной группой, присутствующей на поверхности носителя, или с полипептидом, или с обоими из них. Реагенты, применимые в качестве поперечно-сшивающих агентов, включают гомобифункциональные и, в частности, гетеробифункциональные реагенты. Подходящие бифункциональные поперечно-сшивающие агенты включают, не ограничиваясь перечисленным, N-SIAB, дималеимид, DTNB, N-SATA, N-SPDP, SMCC и 6-HYNIC. Поперечно-сшивающий агент может быть выбран для обеспечения селективно расщепляемой связи между полипептидом и твердым носителем. Например, в качестве средства для отщепления полипептида от твердого носителя может быть использован фотолабильный поперечно-сшивающий агент, такой как 3-амино-(2-нитрофенил)пропионовая кислота. (Brown et al, Mol. Divers, pp, 4-12 (1995); RothsCH₁ld etal, Nucl Acids Res., 24:351-66 (1996); и патент США №5643722). Другие поперечно-сшивающие реагенты хорошо известны в данной области техники (см., например, Wong (1991), выше; и Hermanson (1996), выше).

[0220] Антитело или полипептид могут быть иммобилизованы на твердом носителе, таком как гранула, посредством ковалентной амидной связи, образованной между гранулой, функционализированной карбоксильной группой, и аминоконцом полипептида, или, наоборот, посредством ковалентной амидной связи, образованной между гранулой, функционализированной аминогруппой, и карбоксиконцом полипептида. Кроме того, к носителю может быть присоединен бифункциональный тритиловый линкер, например, к 4-нитрофениловому активному сложному эфиру на смоле, такой как смола Ванга, посредством аминогруппы или карбоксильной группы на смоле через аминосмолу. При использовании подхода на основе бифункционального тритилового линкера может потребоваться обработка твердого носителя летучей кислотой, такой как муравьиная кислота или трифторуксусная кислота, для обеспечения отщепления полипептида и возможности его удаления. В таком случае полипептид может быть нанесен в виде пятна без использования гранул на дно лунки с твердым носителем или на плоскую поверхность твердого носителя. После добавления матричного раствора полипептид может быть десорбирован с получением масс-спектра.

[0221] Гидрофобные тритиловые линкеры также могут применяться в качестве кис л ото лабильных линкеров с использованием летучей кислоты или подходящего матричного раствора, например, матричного раствора, содержащего 3-НРА (3-гидроксипиколиновая кислота), для отщепления аминосвязанной тритиловой группы от полипептида. Кислотолабильность также может быть изменена. Например, тритил, монометокситритил, диметокситритил или триметокситритил могут быть заменены на соответствующие n-замещенные или более кисл ото лабильные тритиламинные производные полипептида, то есть, с полипептидом могут быть созданы тритилэфирные и тритиламинные связи. Соответственно, полипептид может быть удален от гидрофобного линкера, например, путем нарушения гидрофобного притяжения или путем расщепления тритилэфирных или тритиламинных связей в кислых условиях, в том числе, при желании, в типичных условиях МС, где матрица, такая как 3-НРА, действует в качестве кислоты.

[0222] Ортогонально расщепляемые линкеры также могут быть пригодны для связывания первого твердого носителя, например, гранулы, со вторым твердым носителем, или для связывания представляющего интерес полипептида с твердым носителем. При использовании таких линкеров первый твердый носитель, например, гранула, может быть селективно отщеплен от второго твердого носителя без отщепления полипептида от носителя; после этого указанный полипептид может быть впоследствии отщеплен от гранулы. Например, дисульфидный линкер, который может быть отщеплен с использованием восстановителя, такого как DTT (дитиотреитол), может быть использован для связывания гранулы со вторым твердым носителем, а отщепляемая кислотой бифункциональная тритиловая группа может быть использована для иммобилизации полипептида на носителе. При желании, сначала может быть расщеплена связь полипептида с твердым носителем, например, при сохранении интактной связи между первым и вторым носителем. Тритиловые линкеры могут обеспечивать ковалентную или гидрофобную конъюгацию и, независимо от природы конъюгации, тритиловая группа легко расщепляется в кислых условиях.

[0223] Например, гранула может быть связана со вторым носителем через линкерную группу, которая может быть выбрана таким образом, чтобы указанная группа имела длину и химическую природу, обеспечивающие связывание гранул с твердым носителем с высокой плотностью или связывание полипептидов с гранулами с высокой плотностью. Такая линкерная группа может иметь, например, «древовидную» структуру, обеспечивающую множество функциональных групп на сайт присоединения к твердому носителю. Примеры такой линкерной группы включают полилизин, полиглутаминовую кислоту, пентаэритрит и т/эдогидрокси-аминометан.

[0224] Соединение посредством некоеалентного связывания. Антитело или полипептид могут быть конъюгированы с твердым носителем, или первый твердый носитель также может быть конъюгирован со вторым твердым носителем посредством нековалентного взаимодействия. Например, магнитная гранула, изготовленная из ферромагнитного материала, способного намагничиваться, может притягиваться к магнитному твердому носителю и может высвобождаться с носителя при удалении магнитного поля. В качестве альтернативы, твердый носитель может быть снабжен ионным или гидрофобным фрагментом, который обеспечивает взаимодействие указанного ионного или гидрофобного фрагмента соответственно с полипептидом, например, полипептидом, содержащим присоединенную тритиловую группу, или со вторым твердым носителем, имеющим гидрофобные свойства.

[0225] Твердый носитель также может быть снабжен партнером по специфичному связыванию и, следовательно, может быть конъюгирован с полипептидом или вторым твердым носителем, содержащим комплементарный связывающий фрагмент.Например, гранула, покрытая авидином или стрептавидином, может быть связана с полипептидом, содержащим включенный в него биотиновый фрагмент, или со вторым твердым носителем, покрытым биотином или производным биотина, таким как иминобиотин.

[0226] Следует понимать, что любых партнеров по связыванию, раскрытых в настоящей заявке или известных в данной области техники, можно менять местами. Таким образом, биотин, например, может быть включен в полипептид или твердый носитель, и, наоборот, авидин или другой биотин-связывающий фрагмент может быть включен в носитель или полипептид, соответственно. Другие пары специфичного связывания, предусмотренные для применения в настоящей заявке, включают, не ограничиваясь перечисленным, гормоны и их рецепторы, ферменты и их субстраты, нуклеотидную последовательность и ее комплементарную последовательность, антитело и антиген, с которым оно специфично взаимодействует, и другие такие пары, известные специалистам в данной области техники.

А. Диагностические применения антител кРЬЬЗ согласно настоящей технологии

[0227] Общие положения. Антитела к DLL3 согласно настоящей технологии могут применяться в способах диагностики. Таким образом, технология согласно настоящему изобретению обеспечивает способы с применением антител для диагностики активности DLL3 у субъекта. Антитела к DLL3 согласно настоящей технологии могут быть выбраны таким образом, чтобы они имели любой уровень специфичности связывания эпитопа и очень высокую аффинность связывания с полипептидом DLL3. В целом, чем выше аффинность связывания антитела, тем более жесткие условия промывки могут быть использованы в иммуноанализе для удаления неспецифично связанного вещества без удаления полипептида-мишени. Соответственно, антитела к DLL3 согласно настоящей технологии, пригодные для диагностических анализов, обычно имеют аффинность связывания приблизительно 10⁸ М^-1, 10⁹ М^-1, 10¹⁰ М^-1, 10¹¹ М^-1 или 10¹² М^-1. Кроме того, желательно, чтобы антитела к DLL3, применяемые в качестве диагностических реагентов, имели достаточную кинетику скорости ассоциации для достижения равновесия при стандартных условиях в течение по меньшей мере 12 часов, по меньшей мере пяти (5) часов или по меньшей мере одного (1) часа.

[0228] Антител к DLL3 могут применяться для обнаружения иммунореактивного белка DLL3 в различных стандартных форматах анализов. Такие форматы включают иммунопреципитацию, вестерн-блоттинг, ELISA, радиоиммуноанализ и иммунометрические анализы. См. Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988); патенты США №3791932, 3839153, 3850752, 3879262, 4034074 3791932, 3817837, 3839153, 3850752, 3850578, 3853987, 3867517, 3879262, 3901654, 3935074, 3984533, 3996345, 4034074 и 4098876. Биологические образцы могут быть получены из любой ткани или биологической жидкости субъекта. В отдельных вариантах осуществления субъект имеет раннюю стадию рака. В одном из вариантов осуществления ранняя стадия рака определяется по уровню или профилю экспрессии белка DLL3 в образце, полученном от субъекта. В отдельных вариантах осуществления образец выбран из группы, состоящей из мочи, крови, сыворотки, плазмы, слюны, амниотической жидкости, спинномозговой жидкости (СМЖ) и биоптата ткани организма.

[0229] Иммунометрические или сэндвич-анализы представляют собой один из форматов способов диагностики согласно настоящей технологии. См. патенты США №4376110, 4486530, 5914241 и 5965375. В таких анализах используют одно антитело, например, антитело к DLL3, или популяцию антител к DLL3, иммобилизованные на твердом носителе, и другое антитело к DLL3 или популяцию антител к DLL3, находящиеся в растворе. Как правило, антитело к DLL3 в растворе или популяция антител к DLL3 в растворе являются мечеными. При использовании популяции антител указанная популяция может содержать антитела, связывающиеся с разными эпитопами в полипептиде-мишени. Соответственно, одну и ту же популяцию можно использовать как в качестве антитела твердой фазы, так и в качестве антитела в растворе. При использовании моноклональных антитела к DLL3 первое и второе моноклональные антитела к DLL3, обладающие разной специфичностью связывания, используют для твердой фазы и фазы раствора. Антитела твердой фазы (также называемые «захватывающими») и антитела в растворе (также называемые «обнаруживающими») могут связываться с антигеном-мишенью в любом порядке или одновременно. Если сначала происходит контакт с антителом твердой фазы, анализ называют прямым анализом. И наоборот, если сначала происходит контакт с антителом в растворе, анализ называют обратным анализом. Если мишень приходит в контакт с обоими антителами одновременно, анализ называют одновременным анализом. После приведения белка DLL3 в контакт с антителом к DLL3 образец инкубируют в течение времени, которое обычно находится в диапазоне от приблизительно 10 мин до приблизительно 24 ч и, как правило, составляет приблизительно 1 ч. Затем проводят стадию промывки для удаления компонентов образца, не связавшихся специфично с антителом к DLL3, используемым в качестве диагностического реагента. Когда антитела твердой фазы и антитела в растворе связываются на отдельных стадиях, промывку можно осуществлять после одной или обеих стадий связывания. После промывки проводят количественную оценку связывания, как правило, путем обнаружения метки, связанной с твердой фазой, посредством связывания меченого антитела из раствора. Обычно для данной пары антител или популяций антител и данных условий реакции строят градуировочную кривую на основе образцов, содержащих известные концентрации антигена-мишени. Концентрации иммунореактивного белка DLL3 в исследуемых образцах затем определяют путем интерполяции данных по градуировочной кривой (то есть, стандартной кривой). Количество аналита может быть измерено либо по количеству меченого антитела в растворе, связанного в равновесии, либо путем кинетических измерений связанного меченого антитела в растворе в нескольких временных точках до достижения равновесия. Уголь наклона такой кривой является показателем концентрации белка DLL3 в образце.

[0230] Подходящие носители для применения в указанных выше способах включают, например, нитроцеллюлозные мембраны, нейлоновые мембраны и дериватизированные нейлоновые мембраны, а также частицы, такие как агароза, гель на основе декстрана, индикаторные полоски, микрочастицы, микросферы, магнитные частицы, пробирки, лунки титрационного микропланшета, SEPHADEX™ (Amersham Pharmacia Biotech, Пискатауэй, Нью-Джерси) и т.п. Иммобилизация может быть осуществлена путем абсорбции или ковалентного присоединения. Необязательно антитела к DLL3 могут быть соединены с линкерной молекулой, такой как биотин, для присоединения к связанному с поверхностью линкеру, такому как авидин.

[0231] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится к антителу к DLL3 согласно настоящей технологии, конъюгированному с диагностическим агентом. Диагностический агент может содержать радиоактивную или нерадиоактивную метку, контрастный агент (такой как агент для магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии или ультразвукового анализа), и радиоактивная метка может представлять собой изотоп, испускающий гамма-, бета-, альфа-частицы, оже-электроны или позитроны. Диагностический агент представляет собой молекулу, которую вводят в виде конъюгата с фрагментом антитела, т.е. антителом или его фрагментом или субфрагментом, и пригодную для диагностики или обнаружения заболевания путем локализации клеток, содержащих антиген.

[0232] Подходящие диагностические агенты включают, не ограничиваясь перечисленным, радиоизотопы, красители (например, с комплексом биотин-стрептавидин), контрастные агенты, флуоресцентные соединения или молекулы и усилители (например, парамагнитные ионы) для магнитно-резонансной томографии (МРТ). В патенте США №6331175, который полностью включен посредством ссылки, описан метод МРТ и получение антител, конъюгированных с усилителем для МРТ. В некоторых вариантах осуществления диагностические агенты выбраны из группы, состоящей из радиоизотопов, усилителей для применения в магнитно-резонансной томографии и флуоресцентных соединений. Для нагрузки компонента антитела радиоактивными металлами или парамагнитными ионами может требоваться подвергание его реакции с реагентом, имеющим длинный хвост, к которому присоединено множество хелатирующих групп для связывания ионов. Такой хвост может представлять собой полимер, такой как полилизин, полисахарид или другую дериватизированную или дериватизируемую цепь, имеющую боковые группы, с которыми могут связываться хелатирующие группы, такие как, например, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), диэтилентриаминпентауксусная кислота (ДТПА), порфирины, полиамины, краун-эфиры, бис-тиосемикарбазоны, полиоксимы и подобные группы, которые, как известно, являются подходящими для этой цели. Хелаты могут быть связаны с антителами согласно настоящей технологии с применением стандартных химических методов. Хелат обычно связан с антителом с помощью группы, которая обеспечивает образование связи с молекулой с минимальной потерей иммунореактивности и минимальной агрегацией и/или внутренним поперечным связыванием. Другие способы и реагенты для конъюгирования хелатов с антителами раскрыты в патенте США №4824659. Особенно подходящие комбинации металл-хелат включают 2-бензил-ДТПА и его монометильные и циклогексильные аналоги, используемые с диагностическими изотопами для радиовизуализации. Эти же хелаты при связывании в комплекс с нерадиоактивными металлами, такими как марганец, железо и гадолиний, являются подходящими для МРТ при использовании наряду с антителами к DLL3 согласно настоящей технологии.

В. Терапевтические применения антител к DLL3 согласно настоящей технологии

[0233] Композиции на основе иммуноглобулинов (например, антитела или их антигенсвязывающие фрагменты) согласно настоящей технологии могут применяться для лечения DLL3-ассоциированных видов рака. Такое лечение может применяться у пациентов, у которых выявлены патологически высокие уровни DLL3 (например, пациентов, которым провели диагностику с помощью способов, описанных в настоящей заявке), или у пациентов, у которых диагностировано заболевание, которое, как известно, связано с такими патологическими уровнями. В одном из аспектов настоящее изобретение относится к способу лечения DLL3-ассоциированного рака у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение указанному субъекту эффективного количества антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) согласно настоящей технологии. Примеры видов рака, подлежащих лечению антителами согласно настоящей технологии, включают, не ограничиваясь перечисленным: мелкоклеточную карциному легкого (SCLC), крупноклеточную нейроэндокринную карциному (LCNEC), легочные нейроэндокринные виды рака, внелегочные нейроэндокринные виды рака и меланому.

[0234] Композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии могут применяться вместе с другими терапевтическими агентами, подходящими для лечения DLL3-acco4HHpoBaHHbix видов рака. Например, антитела согласно настоящей технологии могут быть введены отдельно, последовательно или одновременно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом, или конъюгированы с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом, где по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из соединений морского происхождения (например, доластатина 10, ауристатинов, тазидотина, доластатина 15 или их вариантов, монометилауристатина Е (ММАЕ), монометилауристатина F (MMAF)) (см. Newman & Cragg, Mar Drugs. 2017 Apr; 15(4): 99), агентов на основе барвинка, антиэстрогенных препаратов, ингибиторов ароматазы, агентов для подавления функции яичников, ингибиторов VEGF/VEGFR, ингибиторов PARP, цитостатических алкалоидов, цитотоксических антибиотиков, антиметаболитов, эндокринных/гормональных агентов, агентов для бисфосфонатной терапии и агентов для таргетной биологической терапии (например, терапевтических пептидов, описанных в US 6306832, WO 2012007137, WO 2005000889, WO 2010096603 и т.д.), алкилирующих агентов, алкилсульфонатов, аманитинов, азиридинов, этилениминов и метиламеламинов, ацетогенинов, камптотецина, бриостатина, каллистатина, СС-1065, криптофицинов, доластатина, дуокармицина, элеутеробина, панкратистатина, саркодиктина, спонгистатина, азотистых ипритов, антибиотиков, ендииновых антибиотиков, динемицина, бисфосфонатов, эсперамицина, хромо протеина, ендииновых антибиотиков, хромофоров, аклациномицинов, актиномицина, антрамицина, азасерина, блеомицинов, кактиномицина, карубицина, карминомицина, карзинофиллина, хромомицинов, дактиномицина, даунорубицина, деторубицина, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцина, доксорубицина ADRIAMYCIN®, эпирубицина, эзорубицина, идарубицина, марцелломицина, митомицинов, микофеноловой кислоты, ногаламицина, оливомицинов, пепломицина, порфиромицина, пуромицина, квеламицина, родорубицина, стрептонигрина, стрептозоцина, туберцидина, убинимекса, циностатина, зорубицина; антиметаболитов, аналогов фолиевой кислоты, аналогов пурина, андрогенов, средств, угнетающих функции надпочечников, пополнителя фолиевой кислоты, такого как фолиновая кислота, ацеглатона, гликозида альдофосфамида, аминолевулиновой кислоты, энилурацила, амсакрина, бестрабуцила, бисантрена, эдатрексата, дефосфамина, демеколцина, диазиквона, эфлорнитина, эллиптиния ацетата, эпотилона, этоглюцида, нитрата галлия, гидроксимочевины, лентинана, лонидаинина, майтанзиноидов, митогуазона, митоксантрона, мопиданмола, нитраэрина, пентостатина, фенамета, пирарубицина, изоксантрона, подофиллиновой кислоты, 2-этилгидразида, прокарбазина, полисахаридного комплекса PSK® (JHS Natural Products, Юджин, Орегон), разоксана; ризоксина; сизофирана; спирогермания; тенуазоновой кислоты; триазиквона; 2,2',2"-трихлортриэтиламина; трихотхецинов (особенно Т-2 токсина, верракурина А, роридина А и ангуидина); уретана; виндезина; вемурафениба; дакарбазина; манномустина; митобронитола; митолактола; пипобромана; гацитозина; арабинозида («Ara-С»); циклофосфамида; тиотепы; таксоидов, хлорамбуцила; гемцитабина GEMZAR®; 6-тиогуанина; меркаптопурина; метотрексата; аналогов платины, винбластина; платины; этопозида (VP-16); ифосфамида; митоксантрона; винкристина; винорелбина NAVELBINE®; новантрона; тенипозида; эдатрексата; дауномицина; аминоптерина; кселода; ибандроната; иринотекана (Camptosar, СРТ-11); ингибитора топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитина; ретиноидов; капецитабина; комбретастатина; лейковорина; оксалиплатина; ингибиторов РКС-альфа, Raf, H-Ras, EGFR и VEGF-A, которые снижают пролиферацию клеток, и фармацевтически приемлемых солей или сольватов, кислот или производных любых из вышеперечисленных. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент представляет собой химиотерапевтический агент.Конкретные химиотерапевтические агенты включают, не ограничиваясь перечисленным, циклофосфамид, фторурацил (или 5-фторурацил, или 5-FU), метотрексат, эдатрексат (10-этил-10-деазааминоптерин), тиотепа, карбоплатин, цисплатин, таксаны, паклитаксел, связанный с белком паклитаксел, доцетаксел, винорелбин, тамоксифен, ралоксифен, торемифен, фулвестрант, гемцитабин, иринотекан, иксабепилон, темозоломид, топотекан, винкристин, винбластин, эрибулин, мутамицин, капецитабин, анастрозол, эксеместан, летрозол, лейпролид, абареликс, бусерелин, гозерелин, мегестрола ацетат, ризедронат, памидронат, ибандронат, алендронат, деносумаб, золедронат, трастузумаб, тайкерб, антрациклины (например, даунорубицин и доксорубицин), бевацизумаб, оксалиплатин, мелфалан, этопозид, мехлорэтамин, блеомицин, ингибиторы микротрубочек, анноновые ацетогенины, ауристатины, майтанзиноиды, тубулизины, калихеамицины, дуокармицины, бензодиазепины, камптотецины или их комбинации.

[0235] Другие совместимые противораковые агенты включают коммерчески или клинически доступные соединения, такие как эрлотиниб (TARCEVA®, Genentech/OSI Pharm.), доцетаксел (TAXOTERE®, Sanofi-Aventis), 5-FU (фторурацил, 5-фторурацил, CAS №51-21-8), PD-0325901 (CAS №391210-10-9, Pfizer), цисплатин (цис-диамин, дихлорплатина (II), CAS №15663-27-1), карбоплатин (CAS №41575-94-4), паклитаксел (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Принстон, Нью-Джерси), трастузумаб (HERCEPTIN®, Genentech), темозоломид (4-метил-5-оксо-2,3,4,6,8-пентазабицикло[4.3.0]нона-2,7,9-триен-9-карбоксамид, CAS №85622-93-1, TEMODAR®, TEMODAL®, Schering Plough), тамоксифен ((Z)-2-[4-(1,2-дифенилбут-1-енил)фенокси]-М,М-диметилэтанамин, NOLVADEX®, ISTUBAL®, VALODEX®) и доксорубицин (ADRIAMYCIN®). Дополнительные коммерчески или клинически доступные противораковые агенты включают бортезомиб (VELCADE®, Millennium Pharm.), сутент (SUNITINIB®, SU11248, Pfizer), летрозол (FEMARA®, Novartis), иматиниба мезилат (GLEEVEC®, Novartis), XL-518 (ингибитор Mek, Exelixis, WO 2007/044515), ARRY-886 (ингибитор Mek, AZD6244, Array BioPharma, Astra Zeneca), SF-1126 (ингибитор PI3K, Semafore Pharmaceuticals), BEZ- 235 (ингибитор PI3K, Novartis), XL-147 (ингибитор РГЗК, Exelixis), PTK787/ZK 222584 (Novartis), фулвестрант (FASLODEX®, AstraZeneca), лейковорин (фолиновая кислота), рапамицин (сиролимус, RAPAMUNE®, Wyeth), лапатиниб (TYKERB®, GSK572016, Glaxo Smith Kline), лонафарниб (SARAS AR™, SCH 66336, Schering Plough), сорафениб (NEXAVAR®, BAY43- 9006, Bayer Labs), гефитиниб (IRESSA®, AstraZeneca), иринотекан (CAMPTOSAR®, CPT-11, Pfizer), типифарниб (ZARNESTRA™, Johnson & Johnson), ABRAXANE™ (без Cremophor), нанодисперсный паклитаксел, стабилизированный альбумином (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, II), вандетаниб (rINN, ZD6474, ZACTIMA®, AstraZeneca), хлорамбуцил, AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen), темсиролимус (TORISEL®, Wyeth), пазопаниб (Glaxo SmithKline), канфосфамид (TELCYTA®, Telik), тиотепа и циклофосфамид (CYTOXAN®, NEOSAR®); винорелбин (NAVELBINE®); капецитабин (XELODA®, Roche), тамоксифен (включая NOLVADEX®; тамоксифена цитрат, FARESTON® (торемифена цитрат) MEGASE® (мегестрола ацетат), AROMASIN® (эксеместан; Pfizer), форместанин, фадрозол, RIVISOR® (ворозол), FEMARA® и ARIMIDEX® (анастрозол; AstraZeneca); дабрафениб (TAFINLAR®, GlaxoSmithKline); дазатиниб (SPRYCEL®, Bristol-Myers Squibb); траметиниб (MEKINIST®, GlaxoSmithKline); нилотиниб (TASIGNA®, Novartis), троксацитабин (1,3-диоксоланнуклеозидный аналог цитозина); антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, такие как ингибитор экспрессии VEGF и ингибитор экспрессии HER2; вакцины, PROLEUKIN® rIL-2; LURTOTECAN® ингибитор топоизомеразы 1; ABARELIX® rmRH; винорелбин и эсперамицины, и фармацевтически приемлемые соли, кислоты или производные любых из вышеперечисленных.

[0236] Композиции согласно настоящей технологии можно необязательно могут быть введены в виде одной болюсной дозы нуждающемуся в этом субъекту. В качестве альтернативы, режим дозирования может включать несколько введений, осуществляемых в различное время после возникновения опухоли.

[0237] Введение может быть осуществлено с помощью любого подходящего способа, включая пероральное, интраназальное, парентеральное (внутривенное, внутримышечное, внутрибрюшинное или подкожное), ректальное, внутричерепное, внутриопухолевое, интратекальное или местное введение. Введение включает самостоятельное введение и введение другим человеком. Также следует понимать, что различные описанные способы лечения патологических состояний относятся к «по существу» лечению, включающему полное излечение, а также неполное излечение, при котором достигается некоторый релевантный с биологической или медицинской точки зрения результат.

[0238] В некоторых вариантах осуществления антитела согласно настоящей технологии включают лекарственные формы, которые могут быть введены нуждающимся в этом субъектам в одной или более дозах. Режимы дозирования можно регулировать для получения желаемого ответа (например, терапевтического ответа).

[0239] Как правило, эффективное количество композиции антитела согласно настоящей технологии, достаточное для достижения терапевтического эффекта, находится в диапазоне от приблизительно 0,000001 мг на килограмм массы тела в сутки до приблизительно 10000 мг на килограмм массы тела в сутки. Как правило, диапазоны доз составляют от приблизительно 0,0001 мг на килограмм массы тела в сутки до приблизительно 100 мг на килограмм массы тела в сутки. Для введения антител к DLL3 дозировка находится в диапазоне от приблизительно 0,0001 до 100 мг/кг, и, как правило, от 0,01 до 5 мг/кг массы тела субъекта раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели. Например, дозировки могут составлять 1 мг/кг массы тела или 10 мг/кг массы тела раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели, или находиться в диапазоне 1-10 мг/кг раз в неделю, раз в две недели или раз в три недели. В одном из вариантов осуществления разовая доза антитела находится в диапазоне 0,1-10000 микрограмм на кг массы тела. В одном из вариантов осуществления концентрации антитела в носителе находятся в диапазоне от 0,2 до 2000 микрограмм на доставляемый миллилитр. Иллюстративная схема лечения предусматривает введение один раз в две недели, или один раз в месяц, или один раз в 3-6 месяцев. Антитела к DLL3 могут быть введены несколько раз. Интервалы между разовыми дозами могут составлять час, день, неделю, месяц или год. Интервалы также могут быть неодинаковыми и определяться на основе измерения уровней антитела в крови субъекта. В некоторых способах дозировку регулируют для достижения концентрации антитела в сыворотке субъекта от приблизительно 75 мкг/мл до приблизительно 125 мкг/мл, от 100 мкг/мл до приблизительно 150 мкг/мл, от приблизительно 125 мкг/мл до приблизительно 175 мкг/мл или от приблизительно 150 мкг/мл до приблизительно 200 мкг/мл. В качестве альтернативы, антитела к DLL3 могут быть введены в виде лекарственной формы с замедленным высвобождением, и в этом случае требуется менее частое введение. Дозировка и частота варьируют в зависимости от периода полужизни антитела в организме субъекта. Дозировка и частота введения могут варьировать в зависимости от того, является лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении вводят относительно низкую дозировку с относительно длинными интервалами в течение длительного периода времени. При терапевтическом применении иногда требуется введение относительно высокой дозировки с относительно короткими интервалами до тех пор, пока прогрессирование заболевания не снизится или не прекратится, или пока у субъекта не будет наблюдаться частичное или полное облегчение симптомов заболевания. После этого пациенту можно осуществлять введение в соответствии с профилактическим режимом.

[0240] В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу обнаружения опухоли у субъекта in vivo, включающему (а) введение указанному субъекту эффективного количества антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента) согласно настоящей технологии, где антитело сконструировано с возможностью локализации в опухоли, экспрессирующей DLL3, и мечено радиоизотопом; и (b) обнаружение наличия опухоли у субъекта путем определения уровней радиоактивности антитела, превышающих эталонное значение. В некоторых вариантах осуществления эталонное значение выражено в единицах инъецированной дозы на грамм (%ИД/г). Эталонное значение может быть рассчитано путем измерения уровней радиоактивности в неопухолевых (нормальных) тканях и расчета значения среднего уровня радиоактивности в неопухолевых (нормальных) тканях±среднеквадратическое отклонение. В некоторых вариантах осуществления соотношение уровней радиоактивности между опухолевой и нормальной тканью составляет приблизительно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1.

[0241] В некоторых вариантах осуществления у субъекта диагностирован или подозревается рак. Уровени радиоактивности антитела могут быть определены с применением позитронно-эмиссионной томографии или однофотонной эмиссионой компьютерной томографии.

[0242] Дополнительно или в качестве альтернативы, в некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту эффективного количества иммуноконъюгата, содержащего антитело согласно настоящей технологии, конъюгированное с радионуклидом. В некоторых вариантах осуществления радионуклид представляет собой испускающий альфа-частицы изотоп, испускающий бета-частицы изотоп, источник оже-электронов или любую их комбинацию. Примеры испускающих бета-частицы изотопов включают ⁸⁶Y, ⁹⁰Y, ⁸⁹Sr, ¹⁶⁵Dy, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁷⁷Lu и ⁶⁷Cu. Примеры испускающих альфа-частицы изотопов включают ²¹³Bi, ²¹¹At, ²²⁵Ac, ¹⁵²Dy, ²¹²Bi, ²²³Ra, ²¹⁹Rn, ²¹⁵Po, ²¹¹Bi, ²²¹Fr, ²¹⁷At и ²⁵⁵Fm. Примеры источников оже-электронов включают ¹¹¹In, ⁶⁷Ga, ⁵¹Cr, ⁵⁸Co, ^99mTc, ^103mRh, ^195mPt, ¹¹⁹Sb, ¹⁶¹Ho, ^189mOs, ¹⁹²Ir, ²⁰¹Tl и ²⁰³Pb. В некоторых вариантах осуществления способа неспецифичное FcR-зависимое связывание в нормальных тканях устранено или снижено (например, благодаря мутации N297A в Fc-области, которая приводит к агликозилированию). Терапевтическая эффективность такого иммуноконъюгата может быть определена путем вычисления соотношения площади под кривой (ППК) для опухоли:ППК для нормальной ткани. В некоторых вариантах осуществления иммуноконъюгат обладает соотношением ППК для опухоли ЛПК для нормальной ткани, равным приблизительно 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1, 55:1, 60:1, 65:1, 70:1, 75:1, 80:1, 85:1, 90:1, 95:1 или 100:1.

[0243] Токсичность. В оптимальном случае эффективное количество (например, доза) антитела к DLL3, описанного в настоящей заявке, обеспечивает благоприятный терапевтический эффект, по существу не вызывая токсичности у субъекта. Токсичность антитела к DLL3, описанного в настоящей заявке, может быть определена с помощью стандартных фармацевтических процедур на клеточных культурах или экспериментальных животных, например, путем определения LD50 (дозы, летальной для 50% популяции) или LDioo (дозы, летальной для 100% популяции). Соотношение доз, вызывающих токсический и терапевтический эффект, представляет собой терапевтический индекс.Данные, полученные по результатам этих анализов на клеточных культурах и в исследованиях на животных, могут быть использованы при составлении диапазона доз, который не является токсичным для применения у человека. Дозировка антитела к DLL3, описанного в настоящей заявке, находится в диапазоне концентраций в циркулирующей крови, которые включают эффективную дозу с низкой или отсутствующей токсичностью. Дозировка может варьировать в пределах указанного диапазона в зависимости от используемой дозированной формы и используемого способа введения. Конкретная лекарственная форма, способ введения и дозировка могут быть выбраны лечащим врачом с учетом состояния субъекта. См., например, Fingl et al, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 (1975).

[0244] Лекарственные формы фармацевтических композиций. В соответствии со способами согласно настоящей технологии, антитело к DLL3 может быть включено в состав фармацевтических композиций, подходящих для введения. Фармацевтические композиции обычно содержат рекомбинантное или по существу очищенное антитело и фармацевтически приемлемый носитель в форме, подходящей для введения субъекту. Фармацевтически приемлемые носители частично определяются конкретной вводимой композицией, а частично - конкретным используемым способом введения композиции. Соответственно, существует широкий спектр подходящих лекарственных форм фармацевтических композиций для введения композиций антитела (см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990). Фармацевтические композиции по общему правилу получают в виде стерильных, по существу изотонических препаратов и в строгом соответствии с требованиями Надлежащей производственной практики (GMP), установленными Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA).

[0245] Термины «фармацевтически приемлемые», «физиологически приемлемые» и их грамматические варианты применительно к композициям, носителям, разбавителям и реагентам используются взаимозаменяемо и означают, что указанные материалы можно вводить субъекту или наносить на тело субъекта, не вызывая нежелательных физиологических эффектов в той степени, которая будет препятствовать введению указанной композиции. Например, «фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество» означает вспомогательное вещество, подходящее для приготовления фармацевтической композиции, которая в целом является безопасной, нетоксичной и желаемой и включает вспомогательные вещества, которые являются приемлемыми для ветеринарного применения, а также для фармацевтического применения у человека. Такие вспомогательные вещества могут быть твердыми, жидкими, полутвердыми или, в случае аэрозольной композиции, газообразными. Термин «фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры» означает соли и сложные эфиры, которые являются фармацевтически приемлемыми и обладают желаемыми фармакологическими свойствами. Такие соли включают соли, которые могут быть образованы в случае, когда кислые протоны, присутствующие в композиции, способны реагировать с неорганическими или органическими основаниями. Подходящие неорганические соли включают соли, образованные с щелочными металлами, например, натрием и калием, магнием, кальцием и алюминием. Подходящие органические соли включают соли, образованные с органическими основаниями, такими как амины, выступающие в роли оснований, например, этаноламин, диэтаноламин, триэтаноламин, трометамин, N-метилглюкамин и т.д. Такие соли также включают соли присоединения кислоты, образованные с неорганическими кислотами (например, соляной и бромистоводородной кислотами) и органическими кислотами (например, уксусной кислотой, лимонной кислотой, малеиновой кислотой и алкан- и аренсульфоновыми кислотами, такими как метансульфоновая кислота и бензолсульфоновая кислота). Фармацевтически приемлемые сложные эфиры включают сложные эфиры, образованные из карбокси-, сульфонилокси- и фосфоноксигрупп, присутствующих в антителе к DLL3, например, Ci-6 алкиловые сложные эфиры. При наличии двух кислотных групп фармацевтически приемлемая соль или сложный эфир может представлять собой монокислоту/моносоль или сложный эфир, или двухосновную соль или сложный эфир; и, аналогичным образом, если присутствует более двух кислотных групп, некоторые или все такие группы могут быть превращены в соли или этерифицированы. Антитело к DLL3, упомянутое согласно настоящей технологии, может присутствовать не в форме соли или в неэтерифицированной форме, или в форме соли и/или этерифицированной форме, и предполагается, что название такого антитела к DLL3 включает как исходное (не в форме соли и неэтерифицированное) соединение, так и его фармацевтически приемлемые соли и сложные эфиры. Кроме того, отдельные варианты осуществления настоящей технологии могут быть представлены в более чем одной стереоизомерной форме, и подразумевается, что название такого антитела к DLL3 включает все отдельные стереоизомеры и все смеси (рацемические или иные) таких стереоизомеров. Специалисту в данной области техники не составит труда определить подходящие временные рамки, последовательность и дозировки введения для конкретных лекарственных средств и композиций согласно настоящей технологии.

[0246] Примеры таких носителей или разбавителей включают, не ограничиваясь перечисленными, воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% раствор человеческого сывороточного альбумина. Также могут быть использованы липосомы и неводные носители, такие как нелетучие растительные масла. Использование таких сред и соединений для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области техники. За исключением случаев, когда какой-либо обычный носитель или соединение несовместимы с антителом к DLL3, рассматривается их использование в композициях. Дополнительные активные соединения также могут быть включены в композиции.

[0247] Фармацевтическую композицию согласно настоящей технологии составляют таким образом, чтобы она была совместима с предполагаемым способом введения. Композиции антител к DLL3 согласно настоящей технологии могут быть введены парентеральным, местным, внутривенным, пероральным, подкожным, интраартериальным, внутрикожным, чрескожным, ректальным, внутричерепным, интратекальным, внутрибрюшинным, интраназальным или внутримышечным способом, или в виде ингалянтов. Антитело к DLL3 необязательно может быть введено в комбинации с другими агентами, которые по меньшей мере частично эффективны при лечении различных DLL3-ассоциированных видов рака.

[0248] Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, нелетучие растительные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные соединения, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие соединения, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА); буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и соединения для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН может быть отрегулирован с помощью кислот или оснований, таких как соляная кислота или гидроксид натрия. Препарат для парентерального введения может быть помещен в ампулы, одноразовые шприцы или многодозовые флаконы, сделанные из стекла или пластика.

[0249] Фармацевтические композиции, подходящие для применения в виде инъекций, включают стерильные водные растворы (при условии растворимости в воде) или дисперсии и стерильные порошки для приготовления стерильных растворов или дисперсий для инъекций непосредственно перед использованием. Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL™ (BASF, Парсиппани, Нью-Джерси) или натрий-фосфатный буфер (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна являться жидкой до такой степени, чтобы ее можно было легко ввести через шприц. Указанная композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязнения микроорганизмами, такими как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.д.) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, за счет использования покрытия, такого как лецитин, за счет поддержания необходимого размера частиц в случае дисперсии и за счет использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных антибактериальных и противогрибковых соединений, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.д. Во многих случаях желательно включать в композицию изотонические соединения, например, сахара, полиспирты, такие как маннит, сорбит, хлорид натрия. Длительная абсорбция композиций для инъекций может быть достигнута путем включения в указанную композицию соединения, замедляющего абсорбцию, например, моностеарата алюминия и желатина.

[0250] Стерильные растворы для инъекций могут быть приготовлены путем включения необходимого количества антитела к DLL3 согласно настоящей технологии в подходящий растворитель с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, по мере необходимости, с последующей стерилизующей фильтрацией. Как правило, дисперсии готовят путем включения антитела к DLL3 в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов для инъекций способы приготовления представляют собой вакуумную сушку и лиофилизацию, которые приводят к получению порошка активного ингредиента с любым дополнительным желаемым ингредиентом из его предварительно стерилизованного фильтрацией раствора. Антитела согласно настоящей технологии могут быть введены в виде инъекции депо-препарата или в виде имплантируемого препарата, который может быть составлен таким образом, чтобы обеспечить замедленное или импульсное высвобождение активного ингредиента.

[0251] Композиции для перорального введения, как правило, включают инертный разбавитель или пригодный для употребления в пищу носитель. Они могут быть заключены в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для перорального терапевтического введения антитело к DLL3 может быть объединено со вспомогательными веществами и использовано в форме таблеток, пастилок или капсул. Композиции для перорального введения также могут быть приготовлены с использованием жидкого носителя для применения в качестве ополаскивателя для рта, где соединение в жидком носителе применяют перорально, используют для полоскания полости рта и выплевывают или проглатывают.В состав композиций могут быть включены фармацевтически совместимые связующие соединения и/или адъювантные материалы. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.д. могут содержать любой из следующих ингредиентов, или соединения аналогичной природы: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное вещество, такое как крахмал или лактоза; дезинтегрирующее соединение, такое как альгиновая кислота, Primogel или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; скользящее вещество, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или вкусоароматическая добавка, такая как мята перечная, метиле ал ицилат или апельсиновый ароматизатор.

[0252] Для введения путем ингаляции антитело к DLL3 доставляют в виде аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или распылителя, который содержит подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода, или ингалятора.

[0253] Системное введение также может осуществляться трансмукозальным или чрескожным способом. Для трансмукозального или чрескожного введения в лекарственную формул включают усилители проникновения, подходящие для проникновения через соответствующий барьер. Такие усилители проникновения, как правило, известны в данной области техники и включают, например, в случае трансмукозального введения, поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот и производные фузидовой кислоты. Трансмукозальное введение может быть достигнуто путем использования назальных спреев или суппозиториев. Для чрескожного введения антитело к DLL3 готовят в виде мазей, бальзамов, гелей или кремов, как в целом известно в данной области техники.

[0254] Антитело к DLL3 также может быть приготовлено в виде фармацевтических композиций в форме суппозиториев (например, с традиционными суппозиторными основами, такими как масло какао и другие глицериды) или микроклизм с удержанием для ректальной доставки.

[0255] В одном из вариантов осуществления антитело к DLL3 объединяют с носителями, которые будут защищать антитело к DLL3 от быстрого выведения из организма, такими как лекарственная форма с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликоле вая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Способы приготовления таких лекарственных форм будут очевидны специалистам в данной области техники. Материалы также могут быть получены коммерческим путем от компаний Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, hie. Суспензии липосом (включая липосомы, нацеленные на инфицированные клетки с помощью моноклональных антител к вирусным антигенам) также могут быть использованы в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области техники, например, как описано в патенте США №4522811.

С. Наборы

[0256] Технология согласно настоящему изобретению обеспечивает наборы для обнаружения и/или лечения ВПЬ3-ассоциированных видов рака, содержащие по меньшей мере одну композицию на основе иммуноглобулина согласно настоящей технологии (например, любое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящей заявке) или ее функциональный вариант (например, содержащий замену вариант). Необязательно, описанные выше компоненты наборов согласно настоящей технологии упаковывают в подходящие контейнеры и маркируют для диагностики и/или лечения DLL3-ассоциированных видов рака. Вышеупомянутые компоненты могут храниться в одно- или многодозовых контейнерах, например, в герметичных ампулах, флаконах, бутылках, шприцах и пробирках, в виде водного, предпочтительно стерильного, раствора, или в виде лиофилизированной, предпочтительно стерильной, лекарственной формы для восстановления. Набор может дополнительно содержать второй контейнер, который содержит разбавитель, подходящий для разбавления фармацевтической композиции с получением большего объема. Подходящие разбавители включают, не ограничиваясь перечисленным, фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество фармацевтической композиции и физиологический раствор. Кроме того, набор может содержать инструкции по разбавлению фармацевтической композиции и/или инструкции по введению разбавленной или неразбавленной фармацевтической композиции. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик, и могут иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет раствора для внутривенного введения или флакон с пробкой, которую можно проткнуть иглой для подкожных инъекций). Набор может также содержать дополнительные контейнеры, содержащие фармацевтически приемлемый буфер, такой как натрий-фосфатный буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Кроме того, он может содержать другие материалы, являющиеся желаемыми с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы, культуральную среду для одного или более подходящих хозяев. Наборы могут необязательно включать инструкции, которые обычно включают в коммерческие упаковки терапевтических или диагностических продуктов, которые содержат информацию, например, о показаниях, применении, дозировке, изготовлении, введении, противопоказаниях и/или особых указаниях относительно использования таких терапевтических или диагностических продуктов.

[0257] Наборы пригодны для обнаружения наличия иммунореактивного DLL3 в биологическом образце, например, любой биологической жидкости, включая, не ограничиваясь перечисленным, например, сыворотку, плазму, лимфу, кистозную жидкость, мочу, стул, спинномозговую жидкость, асцитную жидкость или кровь, и включая биоптаты тканей организма. Например, набор может содержать: одно или более гуманизированных, химерных или биспецифичных антител к DLL3 согласно настоящей технологии (или их антигенсвязывающих фрагментов), способных связываться с DLL3 в биологическом образце; средство для определения количества DLL3 в образце; и средство для сравнения количества иммунореактивного DLL3 в образце со стандартом. Одно или более антител к DLL3 могут быть меченными. Компоненты набора (например, реагенты) могут быть упакованы в подходящий контейнер. Набор может дополнительно содержать инструкции по применению указанного набора для обнаружения иммунореактивного DLL3.

[0258] В случае наборов на основе антител указанный набор может содержать, например, 1) первое антитело, например, гуманизированное, химерное или биспецифичное антитело к DLL3 согласно настоящей технологии (или его антигенсвязывающий фрагмент), присоединенное к твердому носителю, который связывается с полипептидом DLL3; и, необязательно; 2) второе, отличающееся антитело, которое связывается либо с полипептидом DLL3, либо с первым антителом, и конъюгировано с детектируемой меткой.

[0259] Набор также может содержать, например, буферный агент, консервант или агент для стабилизации белка. Набор может дополнительно содержать компоненты, необходимые для обнаружения детектируемой метки, например, фермент или субстрат.Набор также может содержать контрольный образец или набор контрольных образцов, которые можно анализировать и сравнивать с исследуемым образцом. Каждый компонент набора может быть заключен в индивидуальный контейнер, и все такие различные контейнеры могут быть представлены в одной упаковке наряду с инструкциями по интерпретации результатов анализов, проведенных с помощью указанного набора. Наборы согласно настоящей технологии могут содержать письменное приложение на контейнере или внутри контейнера набора. Письменное приложение содержит сведения о том, как применять реагенты, содержащиеся в наборе, например, для обнаружения полипептида DLL3 in vitro или in vivo или для лечения DLL3-ассоциированных видов рака у нуждающегося в этом субъекта. В отдельных вариантах осуществления реагенты можно применять в соответствии со способами согласно настоящей технологии.

ПРИМЕРЫ

[0260] Настоящая технология дополнительно проиллюстрирована с помощью следующих далее примеров, которые никоим образом не ограничивают настоящее изобретение. Следующие примеры демонстрируют получение, определение характеристик и применение иллюстративных антител к DLL3 согласно настоящей технологии.

Пример 1: Создание моноклональных антител

[0261] В качестве иммуногенов использовали внеклеточный домен (ECD) DLL3 (регистрационный номер GenBank Q9NY J7-1), соответствующий аминокислотам А1а27-А1а479, с С-концевой 6xHis-MeTKofi, продуцированный в клетках НЕК293Т, стабильно экспрессирующих полноразмерный DLL3. Мышей AlivaMAb Kappa от Ablexis (Ablexis, Сан-Диего, Калифорния), несущих репертуар иммуноглобулинов человека, иммунизировали либо растворимым DLL3-ECD, либо стабильными клетками, следуя стандартным методикам иммунизации, в течение 3 недель. Спленоциты и клетки дренирующих лимфатических узлов у мышей с высокими сывороточными титрами, специфичными к DLL3, собирали и сливали с клетками мышиной миеломы для создания гибридом с помощью электрослияния. Затем эти гибридомы подвергали скринингу для идентификации антител, которые специфически связывались с растворимым DLL3-ECD, с помощью ELISA и полноразмерного белка DLL3 на стабильно экспрессирующих клетках 293 с помощью проточной цитометрии по сравнению с родительскими клетками 293. Гибридомы отбирали для дальнейшего исследования путем ранжирования в ходе проточной цитометрии по интенсивности окрашивания на трансфектантах DLL3 293 вместе с окрашиванием при 4°С/37°С, как описано ниже.

Пример 2: Анализ интернализации 4/37 с моноклональными антителами 6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-018-А

[0262] Четыре моноклональных антитела (6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-018-А) сравнивали по их способности к интернализации DLL3 путем сравнения окрашивания при 4°С с окрашиванием при 37°С. В качестве положительного контроля интернализации использовали эталонное моноклональное антитело SC16, которое, как известно, интернализируется посредством DLL3 и обладает активностью ADC, и которое ранее было описано в литературе. Клетки NCI-H82 в экспоненциальной фазе роста собирали с помощью трипсина/ЭДТА, однократно промывали в RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), и ресуспендировали в DMEM с добавлением 10% FCS с плотностью 2×10⁷ клеток/мл. 100 мкл (2×10⁶ клеток) добавляли в 96-луночные планшеты с U-образным дном. Исследуемые моноклональные антитела (6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В или 10-О18-А) или эталонное моноклональное антитело добавляли в отдельные лунки для получения конечной концентрации 10 мкг/мл в двух параллельных планшетах. Оба планшета выдерживали при 4°С в течение 30 минут, после чего оба планшета промывали 2× холодным RPMI с добавлением 10% FCS и ресуспендировали в RPMI с добавлением 10% FCS. Один планшет выдерживали при 4°С (контрольный планшет), а другой планшет инкубировали при 37°С в инкубаторе с СО₂ (экспериментальный планшет). После 4 часов инкубации при 37°С в инкубаторе с СО₂ для экспериментального планшета и при 4°С для контрольного планшета клетки промывали 3 раза при 4°С холодным промывочным буфером (PBS, содержащий 0,5% BSA). Затем образцы ресуспендировали в холодном промывочном буфере + R-фикоэритрин-козий F(ab’)₂-фрагмент к мышиному IgG AffiniPure (Jackson 115-116-071) в конечной концентрации 7 мкг/мл в промывочном буфере. После 30 минут инкубации при 4°С клетки трижды промывали в холодном промывочном буфере и фиксировали в 0,5% параформальдегиде в PBS, и анализировали с помощью проточной цитометрии в течение 48 часов. В качестве относительной меры интернализации принимали отношения средней интенсивности флуоресценции (MFI), рассчитанные путем деления MFI, полученной из контрольного планшета (который инкубировали с антителами при 4°С), на соответствующую MFI, полученную из экспериментального планшета (который инкубировали с антителами при 37°С). Высокое значение указывает на более высокую степень интернализации. Как показано в таблице ниже, все моноклональные антитела (6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-О18-А) были способны интернализироваться при связывании с DLL3, но не на уровне эталонного моноклонального антитела.

[0263] Эти результаты демонстрируют, что композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии подвергаются интернализации при связывании с DLL3. Соответственно, композиции на основе иммуноглобулинов, раскрытые в настоящей заявке, могут применяться для доставки терапевтических агентов в DLL3-положительные раковые клетки.

Пример 3: Анализ интернализации на основе тушения для моноклональных антител 6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-018-А.

[0264] Для ранжирования моноклональных антител в отношении интернализации использовали анализ интернализации на основе тушения. Этот метод отражает интернализацию и направление по эндосомному/лизосомному пути. Козий F(ab) против мышиного IgG1 (Jackson Immunoresearch 115-007-185) дважды метили сложным эфиром NHS (N-гидроксисукцинимид) Dy light Dy650 (Thermofisher 02206) и сложным эфиром NHS LICOR IRDye QC1 (LICOR 929-7030) (дважды меченое антитело в настоящем заявке обозначено «F(ab) Dy650-QCl»). Принцип данного анализа заключается в следующем: F(ab) Dy650-QC1 не имеет флуоресценции, поскольку флуоресценция Dy light Dy650 тушится под воздействием IRDye QC1. Тем не менее, при интернализации F(ab) Dy650-QC1 деградирует по пути эндосомы/лизосомы, и результирующее высвобождение IRDye QC1 делает флуоресценцию Dy light Dy650 видимой. Соответственно, сигнал флуоресценции Dy light Dy650 принимали в качестве меры интернализации через лизосомы. Вкратце, клетки NCI-H82 в экспоненциальной фазе роста собирали с помощью трипсина/ЭДТА, однократно промывали в питательной среде RPMI с добавлением 10% FCS и ресуспендировали в питательной среде, и добавляли 1,25×10⁶ клеток (80 мкл) на лунку. Моноклональные антитела к DLL3 в концентрации 200 мкг/мл смешивали с козьим антителом против мышиного IgG1 с Dy650 QC1 при 200 мкг/мл при комнатной температуре в течение 20 минут и добавляли 20 мкл смеси к клеткам. После 30 минут инкубации при 4°С клетки дважды промывали питательной средой, ресуспендировали в питательной среде и переносили в условия 37°С в инкубатор с СО₂ на 4 часа, чтобы обеспечить интернализацию. Затем клетки промывали 2х ледяным PBS, содержащим 0,5% BSA, и анализировали с помощью проточной цитометрии, и определяли среднюю интенсивность флуоресценции. Среднюю интенсивность флуоресценции контрольного эталонного моноклонального образца устанавливали соответствующей 100% интернализации. Как показано в таблице ниже, все четыре моноклональных антитела продемонстрировали интернализацию и направление по эндосомному/лизосомному пути.

[0265] Эти результаты демонстрируют, что композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии подвергаются интернализации при связывании с DLL3 и входят в фагосомный/лизосомальный компартмент клеток. Соответственно, композиции на основе иммуноглобулинов, раскрытые в настоящей заявке, могут применяться для доставки терапевтических агентов в DLL3-положительные раковые клетки.

Пуимер 4: Анализ Fab ZAP для панели моноклональных антител к DLL3.

[0266] В качестве еще одного способа измерения интернализации использовали анализ Fab ZAP. В анализе Fab ZAP измеряют доставку токсина в клетку посредством интернализации моноклонального антитела к DLL3. В анализе Fab ZAP используются конъюгированные с сапориновым токсином тяжелая и легкая цепи антимышиного F(ab) для мечения моноклональных антител токсином. Использовали набор от Advanced Targeting Systems и соблюдали протокол анализа Fab ZAP для характеристики панели моноклональных антител к DLL3. Вкратце, клетки NCI-H82 в экспоненциальной фазе роста собирали с помощью трипсина/ЭДТА, однократно промывали в RMPI с добавлением 10% FCS и высевали с плотностью 5000 клеток/лунку в 96-луночные белые непрозрачные планшеты в 100 мкл RPMI с добавлением 10% FCS. На следующий день добавляли 25 мкл очищенных моноклональных антител (G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В или 10-018-А) или эталонного моноклонального антитела при начальной концентрации 10 мкг/мл и выполняли последовательные трехкратные разведения. Добавляли конъюгированные с сапонином HL F(ab) против мышиного Ig (Fab ZAP) в количестве 25 мкл, что давало конечную концентрацию 4,4 нМ. Через 3-4 дня к планшету добавляли равный объем Cell Titre Glow (Promega G7571), встряхивали на орбитальном шейкере в течение 2 минут, и еще через 10 минут при комнатной температуре считывали люминесценцию с помощью планшет-ридера. Все моноклональные антитела были протестированы как полные титрации, чтобы устранить эффект прозоны. Как показано на ФИГ. 1 и в таблице ниже, все моноклональные антитела проявляли цитотоксическую активность, сопоставимую с эталонным моноклональным антителом. В других экспериментах с этими моноклональными антителами контрольное мышиное моноклональное антитело IgG1 не проявляло цитотоксической активности. Соответственно, эти результаты демонстрируют, что цитотоксическая активность опосредуется распознаванием DLL3, а не FcR.

[0267] Эти результаты демонстрируют, что композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии могут доставлять терапевтические агенты в опухоли, экспрессирующие DLL3 на поверхности своих клеток. Соответственно, композиции на основе иммуноглобулинов, раскрытые в настоящей заявке, могут применяться для доставки терапевтических агентов в DLL3-положительные раковые клетки.

Пример 5: Связывание эпитопа панелью моноклональных антител к DLL3.

[0268] Панель очищенных моноклональных антител к DLL3 и эталонное моноклональное антитело подвергали попарному связыванию с эпитопом на чипе для поверхностного плазмонного резонанса (SPR) Carterra® (Carterra® Inc., Солт-Лейк-Сити, Юта), где каждое моноклональное антитело тестировали на предмет захвата меченого гистидином антигена DLL3 (DLL3-His), а также на конкуренцию со всеми остальными антителами в панели за связывание с DLL3-His. Антитела иммобилизовали на чипе (лиганде) НС200М с помощью стандартных методик образования аминной связи методом печати чипа. Затем в каждом цикле пропускали антиген по всей поверхности чипа с последующим введением одного антитела (аналита). В конце каждого цикла поверхность регенерировали для удаления антигена и аналита перед началом нового цикла. Как показано в таблице ниже, для панели было идентифицировано три различных эпитопных группы, причем 7-I1-В и 2-С8-А были картированы в эпитопную группу 2, в то время как 6-G23-F было отнесено в группу 3, а 10-О18-А было отнесено в группу 1.

[0269] Эти результаты демонстрируют, что композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии связываются с тремя различными эпитопами, присутствующими в белке DLL3. Соответственно, композиции на основе иммуноглобулинов, раскрытые в настоящей заявке, могут применяться в комбинации друг с другом для доставки множества терапевтических агентов в опухолевые клетки, экспрессирующие DLL3.

Пуимеу б: Измерение аффинности.

[0270] Аффинности связывания четырех моноклональных антител (6-G23-F, 2-С8-А, 7-II-В и 10-018-А) определяли с помощью биослойной интерферометрии (BLI) с использованием прибора Octet НТХ при 25°С с использованием PBS 0,1%, BSA 0,02% и Tween 20 в качестве буфера для связывания и 10 мМ глицина с рН 1,7 в качестве буфера для регенерации. Четыре очищенных моноклональных антитела (5 мкг/мл каждое) загружали на сенсоры к мышиному Fc. Загруженные сенсоры погружали в указанные последовательные разведения рекомбинантного белка DLL3 человека (аминокислоты А1а27-А1а479, кат.№9749-DL, R&D Systems) в начальной концентрации 200 нМ с 7 последовательными разведениями 1:3. Как показано на ФИГ. 2A-2D, связывание зависело от концентрации. Константы диссоциации (K_D) рассчитывали с использованием одновалентной (1:1) модели связывания. Как показано на ФИГ. 2Е, все моноклональные антитела имели аффинности в субнаномолярном диапазоне. На ФИГ. 7 показано, что моноклональные антитела (mAb) 6-G23-F, 10-О18-А и 2-С8-А избирательно связывают DLL3, но не DLL1 или DLL4. mAb 7-I1-В связывает как DLL3, так и DLL4, но не DLL 1.

[0271] Эти результаты демонстрируют, что композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии специфично связывают DLL3 с высокой аффинностью. Соответственно, композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии применимы в способах обнаружения белка DLL3 в биологическом образце.

Пуимер 7: Связывание моноклональных антител с туансфициуованными и первичными клетками.

[0272] Четыре моноклональных антитела (6-G23-F, 2-С8-А, 7-И-В и 10-О18-А) тестировали на их способность связываться с DLL3 мыши и яванского макака, а также с эндогенным DLL3 человека, с помощью проточной цитометрии. Для этого клетки НЕК293 трансфицировали плазмидной ДНК, кодирующей полноразмерный DLL3 человека, мыши или яванского макака, и использовали в эксперименте. Вкратце, 10⁶ трансфицированных клеток НЕК293 или первичных клеток NCI-H82 добавляли в буфере для FACS, PBS 0,5% BSA, в лунки 96-луночного планшета с U-образным дном, и добавляли очищенные моноклональные антитела до 10 мкг/мл. После 30 минут инкубации при 4°С клетки промывали 3 раза в буфере для FACS и инкубировали с РЕ-мечеными Н и L F(ab)2 против мышиного IgG на 2-й стадии. После еще 30 минут инкубации при 4°С клетки трижды промывали в буфере FACS и анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде отношения средней интенсивности флуоресценции для моноклонального антитела, деленной на фоновое окрашивание на 2-й стадии. Как показано в таблице ниже, все моноклональные антитела перекрестно реагировали с DLL3 яванского макака и обнаруживали эндогенный DLL3 на клетках NCI Н82, но только 6-G23-F и 7-I1-В связывались с DLL3 мыши.

[0273] Эти результаты демонстрируют, что композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии применимы в способах обнаружения белка DLL3 в биологическом образце.

Пример 8: Секвенирование.

[0274] Вариабельные тяжелые и вариабельные легкие цепи четырех моноклональных антител выделяли из соответствующих гибридом для 7-I1-В, 6-G23-F, 2-С8-А и 10-О18-А методом RACE (быстрая амплификация концов кДНК). РНК выделяли из лизированной гибридомы с помощью набора RNAEasy (Qiagen). мРНК выделяли для синтеза кДНК и получали продукты ПЦР с использованием набора RACE. Затем продукты ПЦР клонировали в вектор ТОРО, подвергали ПЦР-амплификации, после чего выделяли на геле для секвенирования. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельного домена тяжелой цепи (V_H) и вариабельного домена легкой цепи (V_L) показаны в таблице ниже и на ФИГ. 3A-3D (7-I1-В), ФИГ. 4A-4D (2-С8-А), ФИГ. 5A-5D (10-О18-А) и ФИГ. 6A-6D (6-G23-F).

Пример 9: Лечение ксенотрансплаптатов NCI-H209.

[0275] В этом исследовании будут использованы восьминедельные самки бестимусных мышей. Опухолевые клетки NCI-H209 будут выращены до середины логарифмической фазы роста в RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Клетки будут культивированы в колбах для тканевых культур в увлажненном инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Мышам будет подкожно имплантировано в правый бок 5 × 10⁶ опухолевых клеток NCI-H209 в 50% matrigel в общем объеме 0,2 мл. Через восемь дней после инокуляции мыши будут случайным образом распределены на группы, когда опухоли достигнут среднего объема опухоли приблизительно 150 мм³. Мышам на 8, 12 и 15 день путем внутрибрюшинной инъекции будут ведены либо человеческий IgG1 (1 или 10 мг/кг; n=5-15 мышей) в качестве отрицательного контроля, либо один или более конъюгатов антитело-лекарственное средство 6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-О18-А (1 или 10 мг/кг; n=5-15 мышей). Будет измерен рост опухолей.

[0276] Конъюгаты антитело-лекарственное средство 6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-О18-А будут получены с использованием методов, известных из литературы. Некоторые методы описаны в примерах 3-4 в настоящей заявке. Один или более из белкового токсина (например, сапоринового токсина, экзотоксина Pseudomonas и дифтерийного токсина), радионуклида, антрациклина, ингибитора микротрубочек, ингибитора митоза, ДНК-повреждающего агента, нуклеотидного аналога, аналога аминокислоты, аналога витамина будут конъюгированы с 6-G23-F, 2-С8-А, 7-I1-В и 10-О18-А для создания 6-G23-F-ADC, 2-C8-A-ADC, 7-I1-B-ADC и 10-O18-A-ADC, соответственно. В этом исследовании будут использованы восьминедельные самки бестимусных мышей. Опухолевые клетки NCI-H209 будут выращены до середины логарифмической фазы роста в RPMI, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS). Клетки будут культивированы в колбах для тканевых культур в увлажненном инкубаторе при 37°С в атмосфере 5% СО₂ и 95% воздуха. Мышам будет подкожно имплантировано в правый бок 5 × 10⁶ опухолевых клеток NCI-H209 в 50% matrigel в общем объеме 0,2 мл. Через восемь дней после инокуляции мыши будут случайным образом распределены на группы, когда опухоли достигнут среднего объема опухоли приблизительно 150 мм3. Мышам на 8, 12 и 15 день путем внутрибрюшинной инъекции будут ведены либо человеческий IgG1-ADC (0,11 или 1 мг/кг; n=5-15 мышей) в качестве отрицательного контроля, либо один или более из 6-G23-F-ADC, 2-C8-A-ADC, 7-I1-B-ADC или 10-О18-A-ADC (0,1 или 1 мг/кг; n=5-15 мышей). Будет измерен рост опухолей.

[0277] Эти результаты продемонстрируют, что композиции на основе иммуноглобулинов согласно настоящей технологии применимы в способах лечения субъекта, страдающего от DLL3-ассоциированного рака (например, мелкоклеточного рака легкого, крупноклеточной нейроэндокринной карциномы, легочных нейроэндокринных видов рака, внелегочных нейроэндокринных видов рака или меланомы).

ЭКВИВАЛЕНТЫ

[0278] Настоящая технология не ограничивается частными вариантами осуществления, описанными в данной заявке, которые приведены в качестве единичных иллюстраций отдельных аспектов настоящей технологии. В рамках объема и сущности настоящей технологии возможно множество ее модификаций и вариаций, как будет очевидно специалистам в данной области техники. Функционально эквивалентные способы и устройства в пределах объема настоящей технологии, помимо перечисленных в настоящей заявке, будут очевидны специалистам в данной области техники из приведенных выше описаний. Подразумевается, что такие модификации и вариации входят в объем настоящей технологии. Следует понимать, что настоящая технология не ограничивается конкретными способами, реагентами, соединениями, композициями или биологическими системами, которые, безусловно, могут варьировать. Также следует понимать, что терминология, используемая в настоящей заявке, приведена исключительно в целях описания частных вариантов осуществления и не подразумевает ограничительного характера.

[0279] Кроме того, когда признаки или аспекты изобретения описаны посредством формул Маркуша, специалисту в данной области техники будет ясно, что изобретение, таким образом, также описано посредством любого отдельного члена или подгруппы членов формулы Маркуша.

[0280] Специалисту в данной области техники будет ясно, что для всех возможных целей, в частности, для письменного описания, все диапазоны, раскрытые в настоящей заявке, также включают все возможные поддиапазоны и комбинации поддиапазонов. Любой перечисленный диапазон может быть очевидным образом интерпретирован как достаточным образом описывающий и подтверждающий тот же диапазон, разбитый по меньшей мере на равные половины, трети, четверти, пятые, десятые части и т.д. В качестве неограничивающего примера, каждый диапазон, обсуждаемый в настоящем документе, может быть легко разбит на нижнюю треть, среднюю треть и верхнюю треть, и т.д. Специалисту в данной области техники также будет ясно, что все формулировки, такие как «вплоть до», «по меньшей мере», «более чем», «менее чем» и т.д., включают указанное число и относятся к диапазонам, которые могут быть дополнительно разбиты на поддиапазоны, как обсуждается выше. Наконец, как будет ясно специалисту в данной области техники, диапазон включает каждый индивидуальный его член. Таким образом, например, группа, содержащая 1-3 клетки, относится к группам, содержащим 1, 2 или 3 клетки. Аналогичным образом, группа, содержащая 1-5 клеток, относится к группам, содержащим 1, 2, 3, 4 или 5 клеток, и т.д.

[0281] Все патенты, патентные заявки, предварительные заявки и публикации, на которые приводятся ссылки или которые цитируются в настоящей заявке, полностью включены посредством ссылки, включая все графические материалы и таблицы, при условии, что они не противоречат обозначенным в явном виде принципам настоящей заявки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> MEMORIAL SLOAN KETTERING CANCER CENTER

TRI-INSTITUTIONAL THERAPEUTICS DISCOVERY INSTITUTE

<120> DLL3-НАЦЕЛЕННЫЕ АНТИТЕЛА И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 115872-0910

<140> PCT/US2020/041282

<141> 2020-07-08

<150> 62/872,915

<151> 2019-07-11

<160> 59

<170> PatentIn версии 3.5

<210> 1

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 1

gaggtgcagc tggtggagtc tggggggggc ttggtaaagc ctggggggtc ccttagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aacacctgga tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggttggccgt attaaaagca aatctgatgg tgggacaaca 180

gactacgctg cacccgtgaa aggcagattc accatctcaa gagatgattc aaaaaacacg 240

ctgtatctgc aaatgaacag cctgaaaacc gaggacacag ccgtgtatta ctgtacccag 300

tattattgga actcctttga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357

<210> 2

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Lys Ser Lys Ser Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala

50 55 60

Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Gln Tyr Tyr Trp Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 3

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Thr Trp

1 5

<210> 4

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 4

Ile Lys Ser Lys Ser Asp Gly Gly Thr Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 5

Thr Gln Tyr Tyr Trp Asn Ser Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 6

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 6

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc aggcgagtca ggacattagc aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctacgat gcatccaatt tggaaacagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc tgggacagat tttactttca ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagatattg caacatatta ctgtcaacag tatgataatc tcccgctcac tttcggcgga 300

gggaccaagg tggagatcaa a 321

<210> 7

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 7

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 8

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 8

Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 9

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 9

Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr

1 5

<210> 10

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 10

Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr

1 5

<210> 11

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 11

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc ccagagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtggccaac ataaaggaag atggaagtga gaaatactat 180

gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatccg 300

ggctgggctc cctttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 12

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Glu Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 13

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 13

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 14

Lys Glu Asp Gly Ser Glu

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 15

Asp Pro Gly Trp Ala Pro Phe Asp Tyr

1 5

<210> 16

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 16

gacatccaga tgtcccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcgagtca gggcattagc aattatttag cctggtttca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aagttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctcg ccatcagcag cctgcagcct 240

gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt tcccgtacac ttttggccag 300

gggaccacgc tggagatcaa a 321

<210> 17

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 17

Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Thr Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 18

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 18

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 19

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 20

Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Tyr Thr

1 5

<210> 21

<211> 354

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 21

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcaat agttactact ggagctggat ccggcagccc 120

ccagggaagg gactggagtg gattgggtat atcttttaca gtgggatcac caactacaac 180

ccctccctca agagtcgagt caccatatca ttagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240

aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcgag aatcggcgtg 300

gctggttttt actttgacta ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctca 354

<210> 22

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 22

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr

20 25 30

Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Phe Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu

65 70 75 80

Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 23

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 23

Gly Gly Ser Ile Asn Ser Tyr

1 5

<210> 24

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 24

Phe Tyr Ser Gly Ile

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 25

Ile Gly Val Ala Gly Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 26

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 26

gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120

cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180

gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240

cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta cctcaccgct cactttcggc 300

ggagggacca aggtggagat caaa 324

<210> 27

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 27

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 28

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 28

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 29

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 29

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 30

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 30

Gln Gln Tyr Gly Thr Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 31

<211> 360

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 31

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60

tcctgcaagg catctggata caccttcacc agctactata tacactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaata atcgacccaa gtgatggtag cacaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcgg 300

gaatataact actacggttt ggacgtctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360

<210> 32

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Asp Pro Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 33

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

1 5

<210> 34

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 34

Asp Pro Ser Asp Gly Ser

1 5

<210> 35

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 35

Asp Arg Glu Tyr Asn Tyr Tyr Gly Leu Asp Val

1 5 10

<210> 36

<211> 336

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид

<400> 36

gatgttgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccttggaca gccggcctcc 60

atctcctgca ggtctagtca aagcctcgta taccgtgatg gaaacaccta cttgaattgg 120

tttcagcaga ggccaggcca atctccaagg cgcctaattt ataaggtttc taaccgggac 180

tctggggtcc cagacagatt ccgcggcagt gggtcaggca ctgatttcac actgaaaatc 240

agccgggtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgca tgcaaggtac acactggcct 300

ccgacgttcg gccaagggac caaggtggaa atcaaa 336

<210> 37

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<400> 37

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg

20 25 30

Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly

85 90 95

Thr His Trp Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 38

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 38

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val Tyr Arg Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 39

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 39

Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 40

Met Gln Gly Thr His Trp Pro Pro Thr

1 5

<210> 41

<211> 384

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 41

Ala Pro Thr Lys Ala Pro Asp Val Phe Pro Ile Ile Ser Gly Cys Arg

1 5 10 15

His Pro Lys Asp Asn Ser Pro Val Val Leu Ala Cys Leu Ile Thr Gly

20 25 30

Tyr His Pro Thr Ser Val Thr Val Thr Trp Tyr Met Gly Thr Gln Ser

35 40 45

Gln Pro Gln Arg Thr Phe Pro Glu Ile Gln Arg Arg Asp Ser Tyr Tyr

50 55 60

Met Thr Ser Ser Gln Leu Ser Thr Pro Leu Gln Gln Trp Arg Gln Gly

65 70 75 80

Glu Tyr Lys Cys Val Val Gln His Thr Ala Ser Lys Ser Lys Lys Glu

85 90 95

Ile Phe Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro

100 105 110

Thr Ala Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala

115 120 125

Pro Ala Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys

130 135 140

Glu Lys Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu

145 150 155 160

Cys Pro Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala

165 170 175

Val Gln Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val

180 185 190

Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly

195 200 205

Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser

210 215 220

Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu

225 230 235 240

Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu

245 250 255

Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro

260 265 270

Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala

275 280 285

Ala Ser Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile

290 295 300

Leu Leu Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe

305 310 315 320

Ala Pro Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala

325 330 335

Trp Ser Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr

340 345 350

Tyr Thr Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala

355 360 365

Ser Arg Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His Gly Pro Met Lys

370 375 380

<210> 42

<211> 330

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 42

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 43

<211> 326

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 43

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

130 135 140

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

145 150 155 160

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 44

<211> 377

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 44

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro

100 105 110

Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

115 120 125

Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

130 135 140

Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Ile

340 345 350

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn Arg Phe Thr Gln

355 360 365

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 45

<211> 452

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 45

Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Asn

1 5 10 15

Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys Leu Ala Gln Asp

20 25 30

Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr Lys Asn Asn Ser

35 40 45

Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Val Leu Arg Gly Gly Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Pro Ser Lys Asp Val Met Gln

65 70 75 80

Gly Thr Asp Glu His Val Val Cys Lys Val Gln His Pro Asn Gly Asn

85 90 95

Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu Leu Pro Pro Lys

100 105 110

Val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe Gly Asn Pro Arg

115 120 125

Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gln Ala Thr Gly Phe Ser Pro Arg Gln Ile

130 135 140

Gln Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gln Val Gly Ser Gly Val Thr

145 150 155 160

Thr Asp Gln Val Gln Ala Glu Ala Lys Glu Ser Gly Pro Thr Thr Tyr

165 170 175

Lys Val Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Ser Asp Trp Leu Gly Gln

180 185 190

Ser Met Phe Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Gln Gln

195 200 205

Asn Ala Ser Ser Met Cys Val Pro Asp Gln Asp Thr Ala Ile Arg Val

210 215 220

Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe Leu Thr Lys Ser Thr

225 230 235 240

Lys Leu Thr Cys Leu Val Thr Asp Leu Thr Thr Tyr Asp Ser Val Thr

245 250 255

Ile Ser Trp Thr Arg Gln Asn Gly Glu Ala Val Lys Thr His Thr Asn

260 265 270

Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala Val Gly Glu Ala

275 280 285

Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu Arg Phe Thr Cys Thr

290 295 300

Val Thr His Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gln Thr Ile Ser Arg

305 310 315 320

Pro Lys Gly Val Ala Leu His Arg Pro Asp Val Tyr Leu Leu Pro Pro

325 330 335

Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Ile Thr Cys Leu

340 345 350

Val Thr Gly Phe Ser Pro Ala Asp Val Phe Val Gln Trp Met Gln Arg

355 360 365

Gly Gln Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro

370 375 380

Glu Pro Gln Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His Ser Ile Leu Thr Val

385 390 395 400

Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Ala His

405 410 415

Glu Ala Leu Pro Asn Arg Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr

420 425 430

Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Val Met Ser Asp Thr Ala

435 440 445

Gly Thr Cys Tyr

450

<210> 46

<211> 327

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 46

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

<210> 47

<211> 353

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 47

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr

1 5 10 15

Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly

65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro

100 105 110

Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser

115 120 125

Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn

130 135 140

Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe

145 150 155 160

Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu

165 170 175

Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys

180 185 190

Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr

195 200 205

Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn

210 215 220

Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu

225 230 235 240

Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser

245 250 255

Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro

260 265 270

Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly

275 280 285

Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp

290 295 300

Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu

305 310 315 320

Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro

325 330 335

Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys

340 345 350

Tyr

<210> 48

<211> 340

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 48

Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Asp Ser Thr

1 5 10 15

Pro Gln Asp Gly Asn Val Val Val Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe

20 25 30

Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Asn Val

35 40 45

Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr

50 55 60

Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Pro Asp Gly

65 70 75 80

Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp

85 90 95

Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Pro Pro Pro Pro Cys Cys His Pro

100 105 110

Arg Leu Ser Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser

115 120 125

Glu Ala Asn Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly

130 135 140

Ala Thr Phe Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly

145 150 155 160

Pro Pro Glu Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu

165 170 175

Pro Gly Cys Ala Gln Pro Trp Asn His Gly Glu Thr Phe Thr Cys Thr

180 185 190

Ala Ala His Pro Glu Leu Lys Thr Pro Leu Thr Ala Asn Ile Thr Lys

195 200 205

Ser Gly Asn Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser

210 215 220

Glu Glu Leu Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg

225 230 235 240

Gly Phe Ser Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln

245 250 255

Glu Leu Pro Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro

260 265 270

Ser Gln Gly Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala

275 280 285

Ala Glu Asp Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His

290 295 300

Glu Ala Leu Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Met Ala

305 310 315 320

Gly Lys Pro Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp

325 330 335

Gly Thr Cys Tyr

340

<210> 49

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 49

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 50

<211> 618

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 50

Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu

20 25 30

Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser

35 40 45

Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu

50 55 60

Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly

65 70 75 80

Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala

85 90 95

Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe

100 105 110

Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg

115 120 125

Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala

130 135 140

Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg

145 150 155 160

Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala

165 170 175

Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg

180 185 190

Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala

195 200 205

Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys

210 215 220

Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu

225 230 235 240

Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser

245 250 255

Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val

260 265 270

Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser

275 280 285

Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe

290 295 300

Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro

305 310 315 320

Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala

325 330 335

Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys

340 345 350

Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys

355 360 365

Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala

370 375 380

Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys

385 390 395 400

Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser

405 410 415

Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro

420 425 430

Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe

435 440 445

Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys

450 455 460

Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro

465 470 475 480

Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala

485 490 495

Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu

515 520 525

Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu

530 535 540

Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser

545 550 555 560

Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val

565 570 575

Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe

580 585 590

Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gln Arg Gln His Leu Leu Phe

595 600 605

Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys

610 615

<210> 51

<211> 587

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 51

Met Val Ser Pro Arg Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu

20 25 30

Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser

35 40 45

Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu

50 55 60

Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly

65 70 75 80

Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala

85 90 95

Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe

100 105 110

Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg

115 120 125

Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala

130 135 140

Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg

145 150 155 160

Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala

165 170 175

Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg

180 185 190

Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala

195 200 205

Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys

210 215 220

Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu

225 230 235 240

Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser

245 250 255

Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val

260 265 270

Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser

275 280 285

Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe

290 295 300

Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro

305 310 315 320

Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala

325 330 335

Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys

340 345 350

Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys

355 360 365

Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala

370 375 380

Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys

385 390 395 400

Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser

405 410 415

Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro

420 425 430

Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe

435 440 445

Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys

450 455 460

Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro

465 470 475 480

Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala

485 490 495

Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu

515 520 525

Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu

530 535 540

Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser

545 550 555 560

Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val

565 570 575

Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala

580 585

<210> 52

<211> 587

<212> БЕЛОК

<213> Pan troglodytes

<400> 52

Met Val Ser Pro Arg Met Ser Arg Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu

1 5 10 15

Ala Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu

20 25 30

Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser

35 40 45

Pro Cys Ser Ala Arg Val Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu

50 55 60

Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly

65 70 75 80

Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala

85 90 95

Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe

100 105 110

Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg

115 120 125

Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala

130 135 140

Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Thr Trp Ala Arg

145 150 155 160

Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala

165 170 175

Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg

180 185 190

Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala

195 200 205

Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro Val Cys Arg Ala Gly Cys

210 215 220

Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu

225 230 235 240

Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser

245 250 255

Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val

260 265 270

Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser

275 280 285

Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys Ala Cys Pro Arg Gly Phe

290 295 300

Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro

305 310 315 320

Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala

325 330 335

Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys

340 345 350

Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys

355 360 365

Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala

370 375 380

Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys

385 390 395 400

Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser

405 410 415

Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro

420 425 430

Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe

435 440 445

Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys

450 455 460

Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro

465 470 475 480

Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala

485 490 495

Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ala Gln Asp Ala Gly Ala Arg Leu

515 520 525

Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu

530 535 540

Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ala Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser

545 550 555 560

Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Val

565 570 575

Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala

580 585

<210> 53

<211> 585

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 53

Met Val Ser Leu Gln Val Ser Pro Leu Ser Gln Thr Leu Ile Leu Ala

1 5 10 15

Phe Leu Leu Pro Gln Ala Leu Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile

20 25 30

His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Leu Gly Thr Pro Arg Ser Pro Cys

35 40 45

Asn Ala Arg Gly Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro

50 55 60

Gly Val Ser Gln Glu Ala Thr Glu Ser Leu Cys Ala Leu Gly Ala Ala

65 70 75 80

Leu Ser Thr Ser Val Pro Val Tyr Thr Glu His Pro Gly Glu Ser Ala

85 90 95

Ala Ala Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Val Arg Val Pro Phe Arg Asp

100 105 110

Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Val Ile Glu Thr Trp Arg Glu Gln

115 120 125

Leu Gly Glu His Ala Gly Gly Pro Ala Trp Asn Leu Leu Ala Arg Val

130 135 140

Val Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Val

145 150 155 160

Gln Arg Thr Gly Thr Trp Glu Leu His Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys

165 170 175

Glu Pro Pro Ala Val Gly Ala Ala Cys Ala Arg Leu Cys Arg Ser Arg

180 185 190

Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Thr Pro Phe

195 200 205

Pro Asp Glu Cys Glu Ala Pro Ser Val Cys Arg Pro Gly Cys Ser Pro

210 215 220

Glu His Gly Tyr Cys Glu Glu Pro Asp Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly

225 230 235 240

Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu

245 250 255

Asn Ser Arg Val Pro Gly Pro Ala Ser Thr Gly Cys Leu Leu Pro Gly

260 265 270

Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser

275 280 285

Glu Thr Ser Gly Ser Phe Glu Cys Ala Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly

290 295 300

Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe

305 310 315 320

Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Glu Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Val

325 330 335

Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val

340 345 350

Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp

355 360 365

Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro

370 375 380

Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn

385 390 395 400

Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ser Arg Arg Cys Ser Cys Ala

405 410 415

Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala

420 425 430

Ser Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly

435 440 445

Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Val Arg Cys Glu Phe

450 455 460

Ala Val Arg Pro Asp Gly Ala Asp Ala Val Pro Ala Ala Pro Arg Gly

465 470 475 480

Leu Arg Gln Ala Asp Pro Gln Arg Phe Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly

485 490 495

Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala Leu Leu Val Ile His

500 505 510

Val Arg Arg Arg Gly Pro Gly Gln Asp Thr Gly Thr Arg Leu Leu Ser

515 520 525

Gly Thr Arg Glu Pro Ser Val His Thr Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn

530 535 540

Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser Ala Asp

545 550 555 560

Trp Asn His Pro Glu Asp Gly Asp Ser Arg Ser Ile Tyr Val Ile Pro

565 570 575

Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala

580 585

<210> 54

<211> 589

<212> БЕЛОК

<213> Rattus norvegicus

<400> 54

Met Val Ser Leu Gln Val Ser Ser Leu Pro Gln Thr Leu Ile Leu Ala

1 5 10 15

Phe Leu Leu Pro Gln Ala Leu Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile

20 25 30

His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Thr Pro Arg Ser Pro Cys

35 40 45

Asn Ala Arg Gly Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro

50 55 60

Gly Val Ser Gln Glu Ala Ala Glu Ser Leu Cys Ala Leu Gly Ala Ala

65 70 75 80

Leu Ser Thr Ser Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Val Pro Ala

85 90 95

Ala Ala Leu Ser Leu Pro Asp Gly Leu Val Arg Val Pro Phe Leu Asp

100 105 110

Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Leu Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Gln

115 120 125

Leu Gly Glu Arg Ala Ala Gly Pro Ala Trp Asn Leu Leu Ala Arg Val

130 135 140

Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Ala Pro Trp Ala Arg Asp Val

145 150 155 160

Gln Arg Thr Gly Ala Trp Glu Leu His Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys

165 170 175

Glu Pro Pro Ala Val Gly Ala Ala Cys Ala Arg Leu Cys Arg Ser Arg

180 185 190

Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Thr Pro Phe

195 200 205

Pro Asp Glu Cys Glu Ala Pro Arg Glu Ser Leu Thr Val Cys Arg Ala

210 215 220

Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Tyr Cys Glu Glu Pro Asp Glu Cys His

225 230 235 240

Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr

245 250 255

Ser Ser Cys Leu Asn Ser Arg Val Ser Gly Pro Ala Gly Thr Gly Cys

260 265 270

Leu Leu Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly

275 280 285

Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Gly Ser Phe Glu Cys Ala Cys Pro Arg

290 295 300

Gly Phe Tyr Gly Pro Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp

305 310 315 320

Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Glu Asp Pro Asp

325 330 335

Ser Ala Tyr Val Cys His Cys Pro Pro Ala Phe Gln Gly Ser Asn Cys

340 345 350

Glu Arg Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly

355 360 365

Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly

370 375 380

Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg

385 390 395 400

Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala Arg Arg

405 410 415

Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala

420 425 430

Asp Pro Cys Ala Ser Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala

435 440 445

His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Val

450 455 460

Arg Cys Glu Phe Ala Val Arg Pro Asp Gly Ala Asp Ala Val Pro Ala

465 470 475 480

Ala Pro Arg Gly Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln Arg Phe Leu Leu Pro

485 490 495

Pro Ala Leu Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ala Leu

500 505 510

Leu Leu Ile His Val Arg Arg Arg Gly Pro Gly Arg Asp Thr Gly Thr

515 520 525

Arg Leu Leu Ser Gly Thr Arg Glu Pro Ser Val His Thr Leu Pro Asp

530 535 540

Ala Leu Asn Asn Leu Arg Leu Gln Asp Gly Ala Gly Asp Gly Pro Thr

545 550 555 560

Ser Ser Ala Asp Trp Asn His Pro Glu Asp Gly Asp Ser Arg Ser Ile

565 570 575

Tyr Val Ile Pro Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala

580 585

<210> 55

<211> 2341

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 55

actcccgaga cccccccacc agaaggccat ggtctcccca cggatgtccg ggctcctctc 60

ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct cccccagaca cggcccgctg gcgtcttcga 120

gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc aggccctggg gccccgcggt ccccctgcag 180

cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag agtctgcctg aagcctgggc tctcagagga 240

ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc ggcgctgagt gcgcgcggac cggtctacac 300

cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct cccactgccc gacggcctct tgcaggtgcc 360

cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc tttcatcatc gaaacctgga gagaggagtt 420

aggagaccag attggagggc ccgcctggag cctgctggcg cgcgtggctg gcaggcggcg 480

cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga cattcagcgc gcaggcgcct gggagctgcg 540

cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc tgccgtcggg accgcgtgca cgcgcctctg 600

ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg tccgggactg cgcccctgcg caccgctcga 660

ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg agcaggctgc agccctgagc atggcttctg 720

tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga gggctggact ggacccctct gcacggtccc 780

tgtctccacc agcagctgcc tcagccccag gggcccgtcc tctgctacca ccggatgcct 840

tgtccctggg cctgggccct gtgacgggaa cccgtgtgcc aatggaggca gctgtagtga 900

gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt 960

gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc 1020

agaccctgac tctgcctaca tctgccactg cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga 1080

gaagagggtg gaccggtgca gcctgcagcc atgccgcaat ggcggactct gcctggacct 1140

gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga 1200

cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg 1260

cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga 1320

cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg cggccgctgc tacgcccact tctccggcct 1380

cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg agcgcggtgt gagttcccag tgcaccccga 1440

cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta 1500

ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt 1560

gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg 1620

gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc ggatgcactc aacaacctaa ggacgcagga 1680

gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt agattggaat cgccctgaag atgtagaccc 1740

tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc catctacgct cgggaggtag cgacgcccct 1800

tttccccccg ctacacactg ggcgcgctgg gcagaggcag cacctgcttt ttccctaccc 1860

ttcctcgatt ctgtccgtga aatgaattgg gtagagtctc tggaaggttt taagcccatt 1920

ttcagttcta acttactttc atcctatttt gcatccctct tatcgttttg agctacctgc 1980

catcttctct ttgaaaaacc tatgggcttg aggaggtcac gatgccgact ccgccagagc 2040

ttttccactg attgtactca gcggggaggc aggggaggca gaggggcagc ctctctaatg 2100

cttcctactc attttgtttc taggcctgac gcgtctcctc catccgcacc tggagtcaga 2160

gcgtggattt ttgtatttgc tcggtggtgc ccagtctctg ccccagaggc tttggagttc 2220

aatcttgaag gggtgtctgg gggaacttta ctgttgcaag ttgtaaataa tggttattta 2280

tatcctattt tttctcaccc catctctcta gaaacaccta taaaggctat tattgtgatc 2340

a 2341

<210> 56

<211> 2004

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 56

actcccgaga cccccccacc agaaggccat ggtctcccca cggatgtccg ggctcctctc 60

ccagactgtg atcctagcgc tcattttcct cccccagaca cggcccgctg gcgtcttcga 120

gctgcagatc cactctttcg ggccgggtcc aggccctggg gccccgcggt ccccctgcag 180

cgcccggctc ccctgccgcc tcttcttcag agtctgcctg aagcctgggc tctcagagga 240

ggccgccgag tccccgtgcg ccctgggcgc ggcgctgagt gcgcgcggac cggtctacac 300

cgagcagccc ggagcgcccg cgcctgatct cccactgccc gacggcctct tgcaggtgcc 360

cttccgggac gcctggcctg gcaccttctc tttcatcatc gaaacctgga gagaggagtt 420

aggagaccag attggagggc ccgcctggag cctgctggcg cgcgtggctg gcaggcggcg 480

cttggcagcc ggaggcccgt gggcccggga cattcagcgc gcaggcgcct gggagctgcg 540

cttctcgtac cgcgcgcgct gcgagccgcc tgccgtcggg accgcgtgca cgcgcctctg 600

ccgtccgcgc agcgccccct cgcggtgcgg tccgggactg cgcccctgcg caccgctcga 660

ggacgaatgt gaggcgccgc tggtgtgccg agcaggctgc agccctgagc atggcttctg 720

tgaacagccc ggtgaatgcc gatgcctaga gggctggact ggacccctct gcacggtccc 780

tgtctccacc agcagctgcc tcagccccag gggcccgtcc tctgctacca ccggatgcct 840

tgtccctggg cctgggccct gtgacgggaa cccgtgtgcc aatggaggca gctgtagtga 900

gacacccagg tcctttgaat gcacctgccc gcgtgggttc tacgggctgc ggtgtgaggt 960

gagcggggtg acatgtgcag atggaccctg cttcaacggc ggcttgtgtg tcgggggtgc 1020

agaccctgac tctgcctaca tctgccactg cccacccggt ttccaaggct ccaactgtga 1080

gaagagggtg gaccggtgca gcctgcagcc atgccgcaat ggcggactct gcctggacct 1140

gggccacgcc ctgcgctgcc gctgccgcgc cggcttcgcg ggtcctcgct gcgagcacga 1200

cctggacgac tgcgcgggcc gcgcctgcgc taacggcggc acgtgtgtgg agggcggcgg 1260

cgcgcaccgc tgctcctgcg cgctgggctt cggcggccgc gactgccgcg agcgcgcgga 1320

cccgtgcgcc gcgcgcccct gtgctcacgg cggccgctgc tacgcccact tctccggcct 1380

cgtctgcgct tgcgctcccg gctacatggg agcgcggtgt gagttcccag tgcaccccga 1440

cggcgcaagc gccttgcccg cggccccgcc gggcctcagg cccggggacc ctcagcgcta 1500

ccttttgcct ccggctctgg gactgctcgt ggccgcgggc gtggccggcg ctgcgctctt 1560

gctggtccac gtgcgccgcc gtggccactc ccaggatgct gggtctcgct tgctggctgg 1620

gaccccggag ccgtcagtcc acgcactccc ggatgcactc aacaacctaa ggacgcagga 1680

gggttccggg gatggtccga gctcgtccgt agattggaat cgccctgaag atgtagaccc 1740

tcaagggatt tatgtcatat ctgctccttc catctacgct cgggaggcct gacgcgtctc 1800

ctccatccgc acctggagtc agagcgtgga tttttgtatt tgctcggtgg tgcccagtct 1860

ctgccccaga ggctttggag ttcaatcttg aaggggtgtc tgggggaact ttactgttgc 1920

aagttgtaaa taatggttat ttatatccta ttttttctca ccccatctct ctagaaacac 1980

ctataaaggc tattattgtg atca 2004

<210> 57

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид

<400> 57

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 58

<211> 75

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(75)

<223> Эта последовательность может включать 1-15 повторяющихся

звеньев "Gly Gly Gly Gly Ser"

<220>

<223> Подробное описание замен и предпочтительных вариантов

осуществления см. в описании заявки

<400> 58

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

35 40 45

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

50 55 60

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

65 70 75

<210> 59

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Синтетическая

6xHis-метка

<400> 59

His His His His His His

1 5

<---

Группа изобретений относится к области иммунологии. Предложены антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, специфически связывающиеся с DLL3, конъюгат антитела, фармацевтическая композиция для лечения DLL3-ассоциированного рака, кодирующая рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, вектор экспрессии и клетка-хозяин для экспрессии рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, набор для обнаружения DLL3. Предложенные иммуноглобулины избирательно связывают DLL3, имеют аффинность в субнаномолярном диапазоне и могут быть применимы в способе лечения DLL3-ассоциированного рака и способе обнаружения уровней белка DLL3 в биологическом образце. 12 н. и 12 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл., 9 пр.

1. Антитело против дельта-подобного белка 3 (DLL3) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельный домен тяжелой цепи иммуноглобулина (V_H) и вариабельный домен легкой цепи иммуноглобулина (V_L), где:

(a) V_H содержит последовательность V_H-CDR1 согласно SEQ ID NO: 3, последовательность V_H-CDR2 согласно SEQ ID NO: 4 и последовательность V_H-CDR3 согласно SEQ ID NO: 5 и V_L содержит последовательность V_L-CDR1 согласно SEQ ID NO: 8, последовательность V_L-CDR2 согласно SEQ ID NO: 9 и последовательность V_L-CDR3 согласно SEQ ID NO: 10; или

(b) V_H содержит последовательность V_H-CDR1 согласно SEQ ID NO: 13, последовательность V_H-CDR2 согласно SEQ ID NO: 14 и последовательность V_H-CDR3 согласно SEQ ID NO: 15 и V_L содержит последовательность V_L-CDR1 согласно SEQ ID NO: 18, последовательность V_L-CDR2 согласно SEQ ID NO: 19 и последовательность V_L-CDR3 согласно SEQ ID NO: 20; или

(c) V_H содержит последовательность V_H-CDR1 согласно SEQ ID NO: 23, последовательность V_H-CDR2 согласно SEQ ID NO: 24 и последовательность V_H-CDR3 согласно SEQ ID NO: 25 и V_L содержит последовательность V_L-CDR1 согласно SEQ ID NO: 28, последовательность V_L-CDR2 согласно SEQ ID NO: 29 и последовательность V_L-CDR3 согласно SEQ ID NO: 30; или

(d) V_H содержит последовательность V_H-CDR1 согласно SEQ ID NO: 33, последовательность V_H-CDR2 согласно SEQ ID NO: 34 и последовательность V_H-CDR3 согласно SEQ ID NO: 35 и V_L содержит последовательность V_L-CDR1 согласно SEQ ID NO: 38, последовательность V_L-CDR2 согласно SEQ ID NO: 39 и последовательность V_L-CDR3 согласно SEQ ID NO: 40,

причём указанное антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с DLL3.

2. Антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, отличающиеся тем, что аминокислотная последовательность V_H и аминокислотная последовательность V_L выбраны из группы, состоящей из:

SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 7 (7-I1-B), соответственно;

SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 17 (2-C8-A), соответственно;

SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 27 (10-O18-A), соответственно; и

SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 37 (6-G23-F), соответственно.

3. Антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащие:

(a) последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 7, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, присутствующей в SEQ ID NO: 2; или

(b) последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 17, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 12; или

(с) последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 27, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 22; или

(d) последовательность вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена легкой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 37, и последовательность вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина, по меньшей мере на 95% идентичную последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина SEQ ID NO: 32.

4. Антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащие Fc-домен изотипа, выбранного из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD и IgE.

5. Антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-3, отличающиеся тем, что указанный антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab’)₂, Fab’, scF_v и F_v.

6. Антитело против DLL3 по любому из пп. 1-4, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой моноклональное антитело, химерное антитело, гуманизированное антитело или биспецифичное антитело.

7. Антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, отличающиеся тем, что указанные антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент связываются с конформационным эпитопом, присутствующим в полипептиде DLL3 млекопитающих.

8. Антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-6, отличающиеся тем, что указанные антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент связываются с неконформационным эпитопом, присутствующим в полипептиде DLL3 млекопитающих.

9. Антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по п. 7 или 8, отличающиеся тем, что полипептид DLL3 млекопитающих имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотные остатки 27-492 из SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51.

10. Конъюгат антитела против DLL3 для лечения DLL3-ассоциированного рака, содержащий антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9 и дополнительный терапевтический агент, причём указанный конъюгат антитела против DLL3 специфично связывается с DLL3.

11. Конъюгат антитела против DLL3 по п. 10, отличающийся тем, что указанный дополнительный терапевтический агент выбран из группы, состоящей из изотопов, лекарственных средств, токсинов, цитокинов, ферментов, ингибиторов ферментов, гормонов, антагонистов гормонов, факторов роста, радионуклидов, металлов, липосом, наночастиц, РНК, ДНК или любой их комбинации.

12. Конъюгат антитела против DLL3 для обнаружения DLL3-ассоциированного рака, содержащий антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9 и детектируемую метку, причём указанный конъюгат антитела против DLL3 специфично связывается с DLL3.

13. Конъюгат антитела против DLL3 по п. 12, отличающийся тем, что детектируемая метка выбрана из группы, состоящей из изотопов, красителей, хромогенов, контрастных веществ, радионуклидов или любой их комбинации.

14. Фармацевтическая композиция для лечения DLL3-ассоциированного рака, содержащая терапевтически эффективное количество антитела против DLL3 или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемый носитель, причём указанное антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с DLL3.

15. Фармацевтическая композиция для лечения DLL3-ассоциированного рака, содержащая терапевтически эффективное количество конъюгата антитела против DLL3 по п. 10 или 11 и фармацевтически приемлемый носитель, причём указанный конъюгат антитела против DLL3 специфично связывается с DLL3.

16. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, причём указанное антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с DLL3.

17. Рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты по п. 16, содержащая последовательность нуклеотидов, кодирующую V_H, и последовательность нуклеотидов, кодирующую V_L, выбранные из группы, состоящей из: SEQ ID NOs: 1 и 6; SEQ ID NOs: 11 и 16; SEQ ID NOs: 21 и 26; и SEQ ID NOs: 31 и 36.

18. Клетка-хозяин для экспрессии рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты по п. 16 или 17, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 16 или 17, где указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, причём указанное антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с DLL3.

19. Вектор для экспрессии рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты по п. 16 или 17, содержащий рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты по п. 16 или 17, где указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, причём указанное антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с DLL3.

20. Набор для обнаружения DLL3, содержащий антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9 и инструкции по применению, причём указанное антитело против DLL3 или его антигенсвязывающий фрагмент специфично связываются с DLL3.

21. Набор для обнаружения DLL3, содержащий конъюгат, содержащий антитело против DLL3 или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9 и детектируемую метку, и инструкции по применению, при этом указанная детектируемая метка выбрана из группы, состоящей из радиоактивной метки, флуоресцентной метки и хромогенной метки, причём указанный конъюгат антитела против DLL3 специфично связывается с DLL3.

22. Способ лечения DLL3-ассоциированного рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата антитела против DLL3 по п. 10 или 11, причём указанный конъюгат антитела против DLL3 специфично связывается с DLL3.

23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что указанный DLL3-ассоциированный рак представляет собой мелкоклеточный рак легкого, крупноклеточную нейроэндокринную карциному, легочный нейроэндокринный рак, внелегочные нейроэндокринные виды рака или меланому.

24. Способ обнаружения уровней белка DLL3 в биологическом образце, включающий:

приведение указанного биологического образца в контакт с конъюгатом антитела против DLL3 по п. 12 или 13; и

обнаружение сигнала, генерируемого указанной детектируемой меткой, в указанном биологическом образце, причём указанный конъюгат антитела против DLL3 специфично связывается с DLL3.