Композиция на основе 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанола для лечения кандидоза полости рта и способ лечения кандидоза Российский патент 2025 года по МПК A61K31/95 A61K47/14 A61P1/02 A61P31/10 

Предлагаемая группа изобретений относится к области фармацевтики и ветеринарии и может быть использовано при лечении кандидоза полости рта животных. Возможно использовать при лечении кандидоза полости рта человека.

Далее заявителем приведены термины, использованные в заявленном техническом решении.

Кандидоз - инфекционное заболевание, вызываемое дрожжеподобными грибками рода Candida (является представителем нормальной микробиоты кожи и слизистых оболочек человека, самый распространенный вид - Candida albicans), обусловлено активным размножением грибка на слизистых оболочках полости рта, половых и внутренних органов, и на коже.

Хроническая форма кандидоза - медленное прогрессирование инфекционного заболевания.

Острая форма кандидоза - заболевание, имеющее выраженные клинические симптомы и резкое начало.

Этиотропная терапия - лечение, направленное на устранение причины возникновения заболевания.

Патогенетическая терапия - устранение или подавление механизмов развития болезни.

Симптоматическая терапия - направлена на устранение или снижение проявления симптомов заболевания, негативно влияющих на качество жизни пациента. 

Скрининговые исследования in vitro - начальный этап анализа соединений-кандидатов на биологическую активность в отношении тест-штаммов микроорганизмов.

Спейсер (молекулярный) - подвижная часть молекулы, осуществляющая связь между двумя другими частями молекулы.

КОЕ - колониеобразующая единица.

Кандидоз полости рта - это заболевание, которое возникает из-за поражения полости рта дрожжеподобными грибками рода Candida. Несмотря на то, что Candida относятся к естественным обитателям полости рта и обычно никак себя не проявляют, при снижении местного иммунитета или под воздействием агрессии факторов внешней среды они переходят в активную фазу роста, провоцируя воспалительный процесс в поражённой области. При этом грибы образуют биопленки, в составе которых они становятся более устойчивыми к антибиотикам и могут противостоять защитной системе организма человека.

По клиническому течению выделяют 2 формы кандидоза - острая и хроническая. Во многих случаях, острый процесс переходит в хронический вследствие неправильной диагностики и/или нерационального лечения.

Лечение острого кандидоза слизистой оболочки полости рта требует комплексного подхода, включающего воздействие на грибы рода Candida (этиотропная терапия); купирование воспалительного процесса слизистой оболочки (патогенетическая терапия); устранение боли и облегчение состояния пациента (симптоматическая терапия). В связи с этим важной является проблема поиска новых надежных и в то же время безопасных противогрибковых средств, способных снижать вирулентную степень патогенного потенциала грибов Candida, что будет способствовать эффективной элиминации грибов со слизистой полости рта. Из-за высокой возможности появления резистентности грибов к антимикотикам важно выбирать средства, к которым не развивается устойчивость.

Соединение структурной формулы I, 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол, описано в работах [Pestova S.V., Izmest'ev E.S., Shevchenko O.G., Rubtsova S.A., Kuchin A.V. Synthesis and membrane protective activity of bis-sulfides derived from monoterpenoids and monosaccharides. Rus. J. Bioorg. Chem, 2017, 43, 302-310; Lodochnikova O.A., Islamov D.R., Gerasimova D.P., Zakharychev D.V., Saifina A.F., Pestova S.V., Izmest'ev E.S., Rubtsova S.A., Pavelyev R.S., Rakhmatullin I.Z., Klochkov V.V., Ostolopovskaya O.V., Nikitina L.E., Rollin, P. Isobornanyl sulfoxides and isobornanyl sulfone: Physicochemical characteristics and the features of crystal structure. J. Mol. Struct., 2017, 1239, 130491]. Краткой сущностью известного источника является способы синтеза бис-сульфидов, имеющих в составе терпеновые и моносахаридные фрагменты, а также терпеновых субстратов - спиртов и хлоридов для их получения. Показано, что на мембранопротекторную и антиоксидантную активности при прочих равных условиях оказывает влияние число атомов серы в молекуле и наличие спейсера между ними, таким образом, возможно сделать логический вывод о том, что это повышает эффективность композиции при использовании по назначению.

Противогрибковые свойства соединения 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол исследованы и описаны в ряде работ [Nikitina L.E., Lisovskaya S.А., Startseva V.A. Pavelyev R.S., Gilfanov I.R., Fedyunina I.V., Ostolopovskaya O.V., Akhverdiev R.F. Development of Novel Effective Agents Against Candida albicans Biofilms. BioNanoSci., 2019, 9, 539-544; Nikitina L.E., Lisovskaya S.A., Gilfanov I.R., Pavelyev R.S., Ostolopovskaya O.V., Fedyunina I.V., Kiselev S.V., Azizova Z.R., Pestova S.V., Izmest'ev E.S., Rubtsova S.A., Akhverdiev R.F., Gerasimov A.V., Sarbazyan E.A., Shipina O.T., Boichuk S.V., Izmailov A.G. Thioterpenoids of the Bornane Series with Potent Activity Against Opportunistic Micromycetes. BioNanoSci., 2023, 13, 26-35]. В работах представлены скриннинговые исследования in vitro активности данного соединения на некоторые виды грибов - C. Albicans, Fusarium solani, Aspergillus niger, и их факторы патогенности. Противовоспалительная, антиоксидантная, антиагрегационная и антикоагуляционная активности соединения 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанола описаны в ряде работ [Nikitina L.E., Pavelyev R.S., Gilfanov I.R., Kiselev S.V., Azizova Z.R., Ksenofontov A.A., Bocharov P.S., Antina E.V., Klochkov V.V., Timerova A.F., Rakhmatullin I.Z., Ostolopovskaya O.V., Khelkhal M.A., Boichuk S.V., Galembikova A.R., Andriutsa N.S., Frolova L.L., Kutchin A.V., Kayumov A.R. Unraveling the Mechanism of Platelet Aggregation Suppression by Monoterpenoids. Bioengineering, 2022, 9(1), 24; Ksenofontov A.A., Bocharov P.S., Antina E.V., Shevchenko O.G., Samorodov A.V., Gilfanov I.R., Pavelyev R.S., Ostolopovskaya O.V., Startseva V.A., Fedyunina I.V., Azizova Z.R., Gaysin S.I., Pestova S.V., Izmest'ev E.S., Rubtsova S.A., Khelkhal M.A., Nikitina L.E. Thioterpenoids as Potential Antithrombotic Drugs: Molecular Docking, Antiaggregant, Anticoagulant and Antioxidant Activities. Biomolecules, 2022, 12, 1599].

Таким образом, в описанных выше источниках показаны противогрибковая, противовоспалительная, антиоксидантная, антиагрегационная и антикоагуляционная активности in vitro 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанола, что позволяет заявителю провести дополнительные исследования на предмет возможности создания лекарственной композиции, которую будет возможно использовать для лечения кандидоза полости рта.

Соединение 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол выбрано по показателю специфической чувствительности дрожжевых грибов [S. A. Lisovskaya, A.A. Ksenofontov, P.S. Bocharov, E.V. Antina, .G.B. Guseva, M.B. Berezin, I.R. Gilfanov, R.S. Pavelyev, M.O. Sabantsev, O.V. Ostolopovskaya, E.Y. Trizna, S.V. Pestova, E.S. Izmest'ev, S.A. Rubtsova, A.G. Izmailov, A.A. Rizvanov, L.E. Nikitina, A.R. Kayumov. The Repression of the Candida albicans Growth and Pseudomycelium Formation by Thiomonoterpenoid. Journal of Biological Regulators and Homeostatic Agents. 2024, 38 (5): 3685-3698]. В скрининговом исследовании in vitro показано, что в отношении ряда клинических штаммов дрожжевых грибов Candida albicans вещество проявляло противогрибковую активность в отношении клинических и референтных штаммов. Соединение активно ингибирует ряд патогенных факторов (образование псевдомицелия и адгезию клеток к биотическим и абиотическим поверхностям). Соединение легко проникает через клеточную стенку и цитоплазматическую мембрану грибов [G.B. Guseva, Y. Khrushkova, A.A. Ksenofontov, E.V. Antina, I.R. Gilfanov, S.A. Lisovskaya, E.Y. Trizna, A.R. Kayumov, O.B. Babaeva, S.V. Boichuk, P.D. Dunaev, V. Klochkov, I.Z. Rakhmatullin, L.E. Nikitina, A Novel Terpene-Bodipy Conjugates Based Fluorescent Probes:Synthesis, Spectral Properties, Stability, Penetration Efficiency into Bacterial, Fungal and Mammalian Cells. Available at SSRN: https://ssrn.com/abstract=4903045].

Несмотря на то, что в ряде публикаций раскрываются противогрибковые свойства соединения 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол, все приведенные в указанных источниках примеры проведены в условии моделей in vitro на тест-штаммах и не описаны результатов действия соединения в условии живого макроорганизма.

Для решения описанных выше технических проблем необходима разработка технического решения, позволяющего оценить эффективность препарата in vivo, в условии живого макроорганизма, а именно - подобрать способ лечения данным соединением кандидоза полости рта. Поскольку успешное внедрение в клиническую практику новых методов лекарственного лечения предполагает наличие доказанной в соответствии с современными требованиями высокой степени эффективности и безопасности применения новых лекарств in vivo на лабораторных животных (модель острого кандидоза ротовой полости у крыс) по изучению эффективности соединения, согласно существующим рекомендациям [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая / под ред. А.Н. Миронова. - М.: Гриф и К, 2012. - 944 с.]. В настоящих Методических рекомендациях изложены стандартные методы изучения противогрибковой активности веществ в экспериментах in vivo, на животных, которые являются важным этапом, необходимым для проведения доклинических исследований лекарственных средств с целью регистрации или проведения клинических исследований лекарственного препарата в РФ, согласно Федеральному закону Российской Федерации об обращении лекарственных средств (ст. 4, 11) от 12 апреля 2010 года №61-ФЗ.

На дату представления заявочных материалов заявителем выявлено, что для лечения кандидоза известны ряд препаратов растительного и синтетического происхождения, направленных на этиотропную или симптоматическую терапию. При этом также активно исследуются новые препараты, обеспечивающие комплексный подход к терапии этого заболевания. В клинической практике известны публикации по росту резистентности у грибов Candida albicans к широко применяемым для лечения кандидоза антимикотикам [Методические рекомендации «Диагностика и антимикробная терапия инфекций, вызванных полирезистентными штаммами микроорганизмов» (обновление 2022 г.), Иванова Л.В., Баранцевич Е.П., Шляхто Е.В Резистентность грибов-патогенов к антимикотикам (обзор) // Проблемы медицинской микологии. - 2011, Т.13, №1, С. 14-17].

Из исследованного уровня техники заявителем выявлено изобретение «Способ лечения кандидоза слизистой оболочки полости рта» по патенту RU 2142267, сущностью является способ лечения кандидоза слизистой оболочки полости рта, включающий комплексное и местное лечение, при котором используют противомикотические средства, при комплексном - дифлюкан, при местном - нистатин, отличающийся тем, что дополнительно при местном лечении используют гель на основе тизоля с нистатином в соотношении тизоль - 10 мг, нистатин - 500000 ЕД, который используют в качестве аппликаций на очаг поражения 4-5 раз в сутки после еды курсом 7 дней, при необходимости повторяют.

Недостатком известного способа то, что используемые противогрибковые препараты обладают побочными эффектами, такими как токсическое воздействие на печень, формирование резистентности у штаммов C. albicans и т.д., что снижает его эффективность при использовании по назначению.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение «Способ лечения кандидоза слизистой оболочки рта комплексным фитопрепаратом» по патенту RU 2470654, сущностью является способ для лечения кандидоза слизистой оболочки рта. Используют медицинское масло, получаемое извлечением оливковым маслом (в соотношении масло-сырье 1:10) растительного сбора из корневищ с корнями левзеи или травы смолевки татарской, цветков календулы, травы чистотела, взятых в равных массовых частях. Масло наносят на слизистую оболочку рта в виде аппликаций три раза в день в течение 14 дней.

Недостатком данного способа является рекомендация пациентам воздержаться от приема пищи и воды в течение одного часа после удаления аппликатора, что препятствует его широкому применению по назначению.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение «Способ лечения кандидоза полости рта препаратами Лизобакт и Циклоферон при использовании съемных ортопедических конструкций» по патенту RU 2642053, сущностью является способ лечения кандидоза полости рта у пациентов со съемными ортопедическими конструкциями, включающий коррекцию базиса протеза, а также обработку воспаленных участков мягких тканей протезного ложа 3%-ным раствором перекиси водорода с последующим нанесением на обработанные участки 10%-ной метилурациловой эмульсии, отличающийся тем, что дополнительно назначают лизобакт местно по 1 таблетке 3 раза в сутки, медленно рассасывая препарат, в момент использования препарата ортопедические конструкции снимают; циклоферон принимают внутрь по 1 таблетке 1 раз в сутки за 30 мин до еды; длительность курса терапии две недели.

Недостатком данного способа является отсутствие достоверной информации для объективной оценки эффективности лечения грибковых заболеваний в целом и описания способа лечения кандидоза в частности, что не позволяет сделать какие либо выводы о его эффективности при использовании по назначению.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение «Фармацевтическое средство растительного происхождения в виде спрея» по патенту RU 2801872, сущностью является препарат в форме спрея, обладающий противомикробной активностью в отношении бактерий Staphylococcus aureus, Escherichia coli и грибов Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Basillus subtilis и Candida albicans, полученный из средства по п. 1, содержащий в 100 г препарата: спиртовой экстракт жмыха плодов малины - 5-15 г, полиэтиленгликоль - 1500 30-40 г, поливинилпирролидон - 2 г, 1,10-декамителен-бис (N,N-диметилметоксикарбонилметил) аммония дихлорид - 0,01-0,02 г, вода очищенная - 42-62 г.

Недостатком известного способа является низкая активность в отношении дрожжевых грибов рода Candida, поскольку в оценке активности препарата был применен только диско-диффузионный метод, являющийся недостаточным методом при оценке эффективности препарата в макроорганизме вследствие того, что даёт исключительно качественную оценку (есть эффект или нет), не учитывая штаммовые особенности грибов.

Технической проблемой, решаемой настоящим изобретением, и его техническим результатом является расширение арсенала средств указанного назначения путем разработки композиции на основе 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанола для лечения кандидоза полости рта и способа лечения кандидоза с использованием указанной композиции.

Сущностью заявленного технического решения является композиция для лечения кандидоза полости рта, содержащая: 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - 1 масс.%, эмульгатор твин-80 - 1,22 масс.%, дистиллированная вода - до 100 масс.%. Способ лечения кандидоза полости рта композицией по п.1, заключающийся в том, что берут 0,5 мл композиции и полностью смачивают ей слизистую полости рта 2 раза в сутки.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 - Фиг. 4.

На Фиг. 1 представлены фотографии, показывающие изменение интенсивности воспалительной реакции в ходе эксперимента в очагах кандидоза ротовой полости, вызванного грибами Candida albicans от начала лечения до полного излечения: 1а - через 2 суток после заражения, б - через 4 суток после заражения, 1в - через 7 суток после заражения, 1г - через 12 суток после заражения.

На Фиг. 2 представлен график оценки эффективности заражения и скорости микробной деконтаминации C. albicans при противогрибковой терапии путем подсчета КОЕ из мазков (Log₁₀, КОЕ/мл), взятых из полости рта крыс, где по оси Х указаны дни эксперимента - до заражения и лечение, по оси Y - КОЕ из мазков (Log₁₀, КОЕ/мл). Зеленые линии с квадратами С-1 обозначают заявленную композицию, синие с треугольником - препарат сравнения Кандид, красные с кружками - контрольный опыт без лечения.

На Фиг. 3 представлены результаты культурального исследования - образцы смывов со слизистой ротовой полости у крыс в динамике развития кандидоза ротовой полости, вызванного грибами Candida albicans, до и после заражения - с лечением с использованием заявленной композиции и в отсутствии лечения в течение всего эксперимента: 3а - до заражения, 3б/1 и 3б/2 - на 12 сутки после заражения, 3в/1 - на 4 сутки после начала лечения с использованием заявленной композиции, 3в/2 – на 4 сутки без лечения, 3г/1 - на 6 сутки после начала лечения с лечением с использованием заявленной композиции, 3в/2 - на 6 сутки без лечения.

На Фиг. 4 приведены гистологические срезы языка крыс: 4а - до заражения, 4б - в момент заражения, 4в - на 4 сутки без лечения, 4г - на 4 сутки после лечения с использованием заявленной композиции.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

В заявленном техническом решении использовали следующие реагенты.

2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - получение соединения описано в работах Pestova S.V., Izmest'ev E.S., Shevchenko O.G., Rubtsova S.A., Kuchin A.V. Synthesis and membrane protective activity of bis-sulfides derived from monoterpenoids and monosaccharides. Rus. J. Bioorg. Chem, 2017, 43, 302-310; Lodochnikova O.A., Islamov D.R., Gerasimova D.P., Zakharychev D.V., Saifina A.F., Pestova S.V., Izmest'ev E.S., Rubtsova S.A., Pavelyev R.S., Rakhmatullin I.Z., Klochkov V.V., Ostolopovskaya O.V., Nikitina L.E., Rollin, P. Isobornanyl sulfoxides and isobornanyl sulfone: Physicochemical characteristics and the features of crystal structure. J. Mol. Struct., 2017, 1239, 130491.

Эмульгатор твин-80 - товарный продукт, страна-производитель: Индия. INCI: Polysorbat (Tween) - 80). Применяется в косметической, пищевой и фармацевтической промышленности и предназначен переводить гидрофобные органические соединения (масла) в водорастворимые, с сохранением свойств.

Кандид (клотримазол 1%) - лекарственный препарат, товарный продукт.

Вода дистиллированная - товарный продукт.

Заявленный технический результат достигается разработкой заявленного способа получения композиции на основе 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанола для лечения кандидоза полости рта, композиции, полученной указанным способом, и способа лечения кандидоза.

Заявленный способ получения заявленной композиции на основе 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанола для лечения кандидоза полости рта заключается в следующем.

Берут 1 масс.% соединения 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол, добавляют 1,22 масс.% эмульгатора твин-80, добавляют дистиллированную воду до 100 масс.%, перемешивают при комнатной температуре до однородной массы.

Получают заявленную композицию, содержащую: 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - 1 масс.%, эмульгатор твин-80 - 1,22 масс.%, дистиллированная вода - до 100 масс.%.

Указанное количественное содержание компонентов заявленной композиции является оптимальным и выбрано на основании многочисленных экспериментов.

Заявленный способ лечения кандидоза полости рта заключается в следующем.

В ротовой полости зараженного животного проводят инстилляции заявленной композицией, содержащей 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - 1 масс.%, эмульгатор твин-80 - 1,22 масс.%, дистиллированная вода - до 100 масс.%, для чего берут 0,5 мл композиции, полностью смачивают ей слизистую полости рта 2 раза в сутки под контролем микрофлоры от начала лечения до клинического выздоровления и лабораторной санации.

Далее заявителем приведен пример осуществления заявленного технического решения.

Пример . Осуществление способа лечения кандидоза полости рта с помощью заявленной композиции

1. Получение заявленной композиции заявленным способом

Берут 1 масс.%, например, 1 г соединения 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол, добавляют 1,22 масс.%, например, 1,22 г эмульгатора твин-80, добавляют дистиллированную воду до 100 масс.%, например, 97,78 г, перемешивают при комнатной температуре до однородной массы.

Получают заявленную композицию, содержащую: 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - 1 масс.%, эмульгатор твин-80 - 1,22 масс.%, дистиллированная вода - до 100 масс.%.

2. Лечение кандидоза полости рта с помощью заявленной композиции

В качестве экспериментальных животных использовали 51 крысу линии Вистар, которых в произвольном порядке разделили на три группы по 17 особей в каждой:

1 группа - экспериментальная, лечили заявленным способом заявленной композицией.

2 группа - сравнения, лечили известным лекарственным препаратом Кандид.

3 группа - контрольная, без лечения, смазывали дистиллированной водой.

Для осуществления заявленного способа можно брать животных, зараженных естественным путем, или животных, зараженных искусственно in vivo.

Искусственное воспроизведение острого кандидоза ротовой полости in vivo (заражение) проводили следующим образом: в течение первых шести дней эксперимента крысам всех трех групп вводили per os (перорально) автоматическим дозатором, например, 1 мл суспензии грибов Candida albicans (3×10⁵-3×10⁷ бластоспор).

Для определения эффективности заражения крыс суспензией C. albicans проводили ежедневную оценку степени проявления клинических признаков острого кандидоза: нарушение пищевого поведения, появление белых налетов и эрозий на языке и слизистой оболочке полости рта. Данные представлены на фото на Фиг. 1:

- через 2 суток после заражения (1а) наблюдается покраснение и воспаление слизистой,

- через 4 суток после заражения (1б) наблюдается появление эрозий на языке,

- через 7 суток после заражения (1в) наблюдается появление эрозий на языке,

- через 12 суток после заражения (1г) наблюдается появление белого налета на слизистой оболочке корня языка, что указывает на присутствие грибов кандида.

Для определения эффективности заражения крыс суспензией C. albicans проводили определение изменение интенсивности воспалительной реакции в баллах (б): 0 б - отсутствие, 1 б - слабая, 2 б - умеренно выраженная, 3 б - выраженная, 4 б - резко-выраженная. Данные представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Изменение интенсивности воспалительной реакции по показателям полной балльной шкалы (M+m) в очагах кандидоза ротовой полости, вызванного грибами Candida albicans, при искусственном воспроизведении острого кандидоза ротовой полости in vivo (заражение)

Дни наблюдения Баллы 1 группа 2 группа 3 группа 2 2.7+0.5 2.5+0.5 2.5+0.8 4 3.7+0.5 4.0+0.2 3.8 +0.4 6 5.0+0.6 4.8+0.4 4.7+0.8 8 5.0+0.4 5.0+0.6 5.3+0.5 10 6.8+0.4 6.7+0.5 6.3+0.8 12 8.7+0.5 8.8+0.4 8.7+0.8

В результате заражения можно было наблюдать максимальное проявление признаков острого кандидоза на 12 сутки заражения.

Для оценки обсемененности ротовой полости в ходе всего эксперимента проводили отбор материала из инфицированных особей. Для этого ватным стерильным тампоном осуществляли забор слизи и элементов эпителия с полости рта, после чего для количественной оценки жизнеспособных микроорганизмов подсчитывали количество КОЕ методом серийных разведений с последующим высевом на плотную агаризованную среду.

Динамика культивирования на питательной среде отражена на Фиг. 2 (левая часть, заражение) и Фиг. 3а, 3б/1, 3б/2 (до заражения, заражение).

На Фиг. 2 (левая часть, заражение) представлен график оценки эффективности заражения путем подсчета КОЕ из мазков (Log₁₀, КОЕ/мл), взятых из полости рта крыс. Полученные результаты подтвердили эффективность заражения, и количество КОЕ на 12 сутки заражения составило 10⁷ КОЕ/мл, в то время как нормой является 10² КОЕ/мл (Наличие в микробиологическом посеве грибов рода Candida в количестве 10^1-2 КОЕ/мл не является патогенным, рассматривается как сапрофитное носительство и может наблюдаться даже у полностью здоровых животных [Сахарук Н.А. Микробная флора полости рта в норме и патологии. Морфология грибов рода Candida // Вестник ВГМУ. 2008. №2. URL: https://cyberleninka.ru/article/n/mikrobnaya-flora-polosti-rta-v-norme-i-patologii-morfologiya-gribov-roda-candida (дата обращения: 16.09.2024)]).

На Фиг. 3 представлены фото образцов смывов со слизистой ротовой полости у крыс в динамике развития кандидоза ротовой полости, вызванного грибами Candida albicans: 3а - до заражения, 3б/1 и 3б/2 - на 12 сутки после заражения,

Показано, что до заражения (3а) грибами Candida albicans, микрофлора слизистой была представлена бактериальной флорой, рост грибов в микробиологическом посеве отсутствовал.

На 12 сутки после заражения (3б/1 и 3б/2) перед началом лечения наблюдался сплошной, экспоненциальный рост колоний грибов Candida albicans: выпуклых, блестящих, сметанообразных, белого цвета.

Протекание воспалительного процесса контролировали с помощью гистологического метода, для чего проводили анализ гистологических срезов ткани слизистой полости рта на наличие или отсутствия воспалительных маркеров. Для этого путем случайной выборки отбирали по 2 особи из каждой группы для проведения биопсии. Крыс подвергали эвтаназии этиловым эфиром с применением ингаляционного метода.

Гистологические срезы представлены на Фиг. 4а, 4б (до заражения, заражение). На 12 сутки заражения наблюдалось повышение количества лимфоцитов в связи с повышенным уровнем воспаления.

Далее производили лечение острого кандидоза ротовой полости по заявленному способу:

1 группа - экспериментальная: в ротовой полости зараженного животного проводили инстилляции заявленной композицией, содержащей 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - 1 масс.%, эмульгатор твин-80 - 1,22 масс.%, дистиллированная вода - до 100 масс.%, для чего берут 0,5 мл композиции, полностью смачивают ей слизистую полости рта 2 раза в сутки под контролем микрофлоры от начала лечения до клинического выздоровления и лабораторной санации.

2 группа - сравнения: в ротовой полости зараженного животного проводили инстилляции 1% раствором лекарственного препарата Кандид для местного применения, для чего берут 0,5 мл препарата Кандид, полностью смачивают им слизистую полости рта 2 раза в сутки под контролем микрофлоры от начала лечения до клинического выздоровления и лабораторной санации.

3 группа - контрольная: в ротовой полости зараженного животного проводили инстилляции стерильной дистиллированной водой, полностью смачивая ей слизистую полости рта 2 раза в сутки под контролем микрофлоры от начала лечения до клинического выздоровления и лабораторной санации.

Для оценки обсемененности ротовой полости в ходе всего эксперимента проводили отбор материала из инфицированных особей. Для этого ватным стерильным тампоном осуществляли забор слизи и элементов эпителия с полости рта, после чего для количественной оценки жизнеспособных микроорганизмов подсчитывали количество КОЕ методом серийных разведений с последующим высевом на плотную агаризованную среду.

Для определения эффективности лечения крыс проводили определение изменение интенсивности воспалительной реакции в баллах (М): 0 б - отсутствие, 1 б - слабая, 2 б - умеренно выраженная, 3 б - выраженная, 4 б - резко-выраженная. Данные представлены в Таблице 2.

Таблица 2. Изменение интенсивности воспалительной реакции по показателям полной балльной шкалы (M+m) в очагах кандидоза ротовой полости, вызванного грибами Candida albicans, при лечении

Дни наблюдения Баллы (М) Заявленная композиция Кандид Без лечения 2 7.8+0.5 7.5+0.5 8.3+0.5 4 5.0+0.7 4.8+0.4 6.5+0.6 6 2.8+0.5 2.25+0.5 4.3+0.7 8 1.5+0.1 1.3+0.6 2.0+0.0

Из данных, приведенных в Таблице 2, видно, что обработка заявленной композицией привела к значительному снижению КОЕ на 6 сутки, сопоставимой с группой проходящей лечение препаратом Кандид. В группе 3 (без лечения) клинические проявления кандидоза оставались выражены к 6 суткам эксперимента.

Для оценки обсемененности ротовой полости в ходе всего эксперимента проводили отбор материала из инфицированных особей. Для этого ватным стерильным тампоном осуществляли забор слизи и элементов эпителия с полости рта, после чего для количественной оценки жизнеспособных микроорганизмов подсчитывали количество КОЕ методом серийных разведений с последующим высевом на плотную агаризованную среду.

Динамика культивирования на питательной среде отражена на Фиг. 2 (правая часть, лечение) и Фиг. 3в/1, 3в/2, 3г/1, 3г/2 (лечение на 4 и 6 сутки, без лечения на 4 и 6 сутки).

На Фиг. 2 (правая часть, лечение) представлен график оценки эффективности лечения путем подсчета КОЕ из мазков (Log₁₀, КОЕ/мл), взятых из полости рта крыс. Полученные результаты подтвердили эффективность лечения, и количество КОЕ на 6 сутки лечения заявленной композицией составило 10² КОЕ/мл по сравнению с 10⁷ КОЕ/мл до начала лечения. В группе сравнения при лечении Кандид на 6 сутки количество КОЕ грибов C. albicans составило 10³ КОЕ/мл. В контрольной группе без лечения на 6 сутки количество КОЕ грибов C. albicans составило 10⁵ КОЕ/мл.

На Фиг. 3 представлены фото образцов смывов со слизистой ротовой полости у крыс в динамике лечения: 3в/1 - на 4 сутки после начала лечения с использованием заявленной композиции, 3в/2 - на 4 сутки без лечения, 3г/1 - на 6 сутки после начала лечения с использованием заявленной композиции, 3в/2 - на 6 сутки без лечения.

На Фиг. 3 видно, что:

- на 4 сутки после лечения заявленной композицией (Фиг. 3в/1) наблюдалась резкая убыль числа колоний гриба C. albicans по сравнению с контрольной группой без лечения (Фиг. 3в/2),

- на 6 сутки после лечения заявленной композицией (Фиг. 3г/1) колония гриба C. albicans практически исчезла, в то время как в контрольной группой без лечения наблюдаются присутствие гриба C. albicans (Фиг. 3г/2).

Протекание воспалительного процесса контролировали с помощью гистологического метода, для чего проводили анализ гистологических срезов ткани слизистой полости рта на наличие или отсутствия воспалительных маркеров. Для этого путем случайной выборки отбирали по 2 особи из каждой группы для проведения биопсии. Крыс подвергали эвтаназии этиловым эфиром с применением ингаляционного метода.

Гистологические срезы представлены на Фиг. 4в (лечение Кандидом на 4 сутки), 4г (лечение заявленной композицией на 4 сутки). В результате на 4 сутки при лечении препаратом Кандид наблюдалось уменьшение воспаления более чем в два раза. При лечении соединением I на 4 сутки воспаление снижалось в 1,5 раза, однако следует отметить выраженное формирование слоя слизистой оболочки языка.

Таким образом, из описанного выше можно сделать вывод, что заявителем решена выявленная техническая проблема и достигнут заявленный технический результат - расширен арсенал средств указанного назначения путем разработки способа получения композиции на основе 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанола для лечения кандидоза полости рта, композиции, полученной указанным способом, и способа лечения кандидоза с использованием указанной композиции.

При этом сопоставление полученных результатов в лечении животных заявленной композицией, содержащей соединение I (2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил))сульфанилэтанол и препаратом сравнения Кандид, широко применяемым в клинической практике для лечения кандидоза, показало сопоставимые результаты, что указывает на промышленную применимость заявленного способа в лечении кандидоза ротовой полости животных и человека.

Изобретение направлено на расширение арсенала средств указанного назначения, что актуально ввиду отсутствия широкого спектра лицензированных коммерческих противогрибковых препаратов природного происхождения с низкой токсичностью, достоверно эффективное и безопасное лечение кандидоза ротовой полости.

Группа изобретений относится к области фармацевтики и касается композиции для лечения кандидоза полости рта и способа лечения кандидоза с ее использованием. Предлагаемая композиция содержит: 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - 1 масс.%, эмульгатор твин-80 - 1,22 масс.%, дистиллированная вода - до 100 масс.%. Способ лечения кандидоза полости рта указанной композицией заключается в том, что берут 0,5 мл композиции и полностью смачивают ей слизистую полости рта 2 раза в сутки. Технический результат: расширение арсенала средств указанного назначения. 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Композиция для лечения кандидоза полости рта, содержащая: 2-((1S,2S,4S)-1,7,7-триметилбицикло[2.2.1]гепт-2-ил)сульфанилэтанол - 1 масс.%, эмульгатор твин-80 - 1,22 масс.%, дистиллированная вода - до 100 масс.%.

2. Способ лечения кандидоза полости рта композицией по п.1, заключающийся в том, что берут 0,5 мл композиции и полностью смачивают ей слизистую полости рта 2 раза в сутки.