S
(Л
Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами. Способ осуществляется добавлением к фактору некроза опухоли в концентрации 102-108 Ед/мл альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг - 50 мг на 1 мл водного раствора указанного фактора. 3 табл.
Изобретение относится к медицине и касается способа стабилизации высокоочищенного фактора некроза опухоли из плазмы кролика, индуцированного липополисахаридами.
Получение высокоочищенногс фактора некроза опухоли.
Самкам кроликов, каждая из которых имеет массу от 2 до 3 кг, внутривенно вводили 75 мл клеток Propionib.ac- terium acnes (Corynebacterium parvum Wellcome Research Labr England), убитых формалином. Спустя 8 дней каждому из кроликов внутривенно вводили 100 мг эндотоксина (липополи- сахарид, полученньй из E.coli 0,26:В6) От каходого кролика получали кровь пункцией сердца через 2 ч после инъекции эндотоксина и полученную таким образом кровь смешивали с небольшим количеством гепарина. Эту кровь подвергали центрифугированию в течение 15 мин при скорости 3000 об/мин. В результате получена плазма, содержащая некротический фактор опухоли, имеющий активность, равную 2500 ед/мл.
Полученную таким образом плазму или сыворотку (10 л), содержащую некротический фактор опухоли, разбавляли 5 л 0,03 11 фосфатного буферного раствора, рН 7,8. Разбавленную плазму вносили в колонку размером см с DEAE-сефарозой CL-6B, Pharmacia Fine Chemicals АВ, Sweden, уравновешенную О,ОЗМ фосфатным буферным раствором, рН 7,8, содержащим 0,13 М хлористого натрия. Эту колонку промывали 2,5 л 0,03м фосфатного буферного раствора рН 7,8, содержащего 0,13 М хлористого натрия, и сорбированный некротический фактор опухоли разбавляют раствором хлорида натао ел
со
Ь ы
рия при линейном изменении его кон- цер1траиии в количестве, от 5 л 0,ОЗМ фосфатного буЛера, рН 7,8, содержащего 0,15 М хлористого натрия, до 5,0 л 0,03Мфосфатного буфера, имею- ш,его рН 7,8, содержащего 0,03 М хлорида натрия. Фракции, обладающие активностью фактора некроза опухоли, сливали вместе, подвергали диализу в течение 12 ч с применением 0,03 М трис-НС1буфера, рН 7,2, содержащего 0,13 М хлористого натрия,
Диализованный раствор некротического фактора опухоли подвергали повторному хроматографит- Ованию на колонке типа DEAE-Sepharose CL-бБ (размером см), урав}ювешенную 0,03 М трис-HCl буфером, рН 7,2, содержащим 0,15 М хлорида натрия. Адсорбированньш некротический фактор опухоли подвергали элюирова- нию при линейном изменении концентрации хлорида натрия, раствором, содержащим 500 мл уравновешивающего буферного раствора, и 500 мл 0,03 М трис-НС буферным раствором, рН7,8 содержащим 0,3 М хлорида натрия.
Полученный концентрат подвергали гель-фильтрации через колонку типа Sepharose S-200, размером 5X100 см, фирмы Pharmacia, уравновещенную с помощью 5 Ml I фосфатного буферного раствора, рН 7,0, содержащим 0,15 М хлорида натрия. Элюирование осуществляли с помощью буферного уравнове- шивайщего раствора. Скорость подачи составила 80 мл/ч„ Фракции с активностью некротического фактора опухоли сливали вместе и подвергали концентрированию посредством ультрафиль рации.
Полученный таким образом некротический фактор некроза опухоли характеризовался характерной активностью, равной 5,0.10 ед/мг белка и имел чистоту в 10000 раз более высокую, чем чистота плазмы.
Полученный таким образом раствор некротического фактора опухоли подвергали повторномгу рехроматографи- рованию на той же сймой колонке Sepharose с использованием того же самого буферного раствора и в результате был получен раствор некротического фактора некроза опухли, имеющий характерную активность, равную 1,0-10 ед/мг белка.
0
5
0
5
W
45
50
55
Пример 1. Некротический фактор некроза опухоли кроликов, .обладающий характерной активностью, равной 5,010 ед/мл, полученный как указано выше, разбавляли 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 7,0, содержащим О,15 М хлорида натрия, с получением в результате раствора некротического фактора опухоли с активностью 1200 ед/мл. К этому раствору некротического фактора опухоли добавляли альбутиин человеческой сыворотки (USA) в количестве 0,1 мг/мл и 1,0 мг/мл USA- фракция альбумина человеческой сыво- ротк1 (Cohu-, фракция V), фирмы Sigmc Cenr Compary.
Для каждого из полученных в результате растворов производилось определение остаточной активности по отношению к: образпам, соответственно подвергнутым хранению в течение 2, 7 и 30 дней при 4°С, образцам, подвергнутым 1-му и 3-м циклам замораживания при -70 С и оттаиванию, образпам, подвергнутым замораживанию при -70°С, ляофилизацип и хранению Б течение 7 дней при 25 С. При проведении таких испытаний раствор некротического фактора опухоли, к которому не добавляли стабилизирующий агент, использовали как контрольный раствор. Что касается лио- филизованной композиции, то эту композицию подвергали растворению в стерильной дистиллированной воде и затем подвергали анализу для определения активности по некротическому фактору опухоли.
Остаточную активность определяли in vitro и in vivo.
In vivo активность фактора некроза опухоли определяли измерением ци- тотоксической активности против L-У- клеток: в качестве емкостей для культур использовали 96-ячеечные микро- титровальные пластины, клетки выращивали в минимальной среде Игла, содержащей прогретую фетальную сыворотку теленка. Образец некротического фактора опухоли объемом 0,1 мл последовательно разбавляли средой и L-M суспензию клеток (0,1 мл, 1140 клеток) перемешивали в каждой из ячеек пластинок, пластинки выдерживали при в течение 48 ч в атмосфере с содержанием 5% двуокиси углерода. В конце периода выращива
ния добавляли 20%-иый впдмьш раствор глутарового альдегида (20 мл) для фи . сации клеток. После фиксации пластины промывали дистиллированной водой, высушивали и затем окрашивали клетки 0,05%-Hbtt i красителем Метилен голубой. Пластины тщательно промывали дистиллированной водой для удаления избыточного количества красителя и высушивали. Затем в каждую ячейку добавляли 0,2 мл 3%-ной соляной кислоты для вымывания красителя из окрашенных клеток. Поглощение каждой ячейки :измеряли при: длине вол- ны 665 нм с помощью прибора Titertek Mactiobon фирмы Flow Laboratories Inc. Поглощение является пропорциональным количеству видимых клеток. Активность некротического фактора опухоли, выраженная в единицах на миллиметр, измеряли, как обратную величину разведения некротического фактора опухоли, которая вызывает 50%-ную цитотоксичность и которую можно вьгоазить графически между разбавлением и поглощением. In vitro остаточную активность определяли в процентах и рассчитывали по экспериментальным данным и в соответствии
со следующим уравнением:
д Остаточная активность - х/од,
где А - активность по некротическому
фактору опухоли образца по- еле хранения или физической обработки,
В - активность образца по некротическому фактору опухоли перед хранением или физической обработкой.
В соответствии с методом in vivo каждый образец раствора подвергали концентрированию с получением концентраций, которые в 20 раз выше, че первоначальные.
Далее 0,5 мл кажд.ого из полученных таким образом концентрированных растворов некротического фактора опухоли вводили инъекцией в хвостовую вену, каждой из мышей с опухолью, разбитых на группы по 5 мьш:ей. Активность некротического фактора.опухоли анализировали спустя 24 ч в соответствии с критериями, указанными в табл,1, где (-) - нет изменений; (+) - незначит.ельный геморагический некроз;
5
59
5 0 5 0
0
5
0
5
146
(2 + + ) - умеренные геморагический некроз (центральный некроз, охпаты- вающий примерно 50% поверхности опухоли) ; (++ + ) - значительны; геморагический некроз (массовьп некроз).
Пример 2, Некротический фактор опухоли, имеющий характерную активность, равную 1,0у10 ед/мг, полученный в соответствии с описанньши ранее, подвергали разбавлению с помощью 0,1 М фосфатного раствора, имеюшего величину водородного показателя, равную 7 ед. рН и содержа- ш,его 0,15 М хлорида натрия. В результате бьши полл чены растворы некротического фактора опухоли, соответственно имеющие активности по некроти
ческому фактору опухоли, равные 1vIO, 1 ЛОЗ, 1 Ю, 140, 1 ПО, 1 ИО и 1x10 - ад/мл. К эликвотным долям каждого из приготовленных таким образом растворов производилось добавление USA в таком количестве, чтобы обеспечить получение в результате раствора, имеющего концентрацию, равную 1,0 мг/мл. Каждьш из полученных таким образом растворов некротического фактора опухоли подвергали хранению в течение 7 дней при 4 С и затем производился анализ этих растворов на активность некротического фактора опухоли в соответствии с методом in vitro. «. Остаточная активность по некроти- ческому фактору опухоли бьша рассчитана по той же методике, что и в примере 1. В качестве контрольной бьша взята другая аликвотная доля каждого из растворов некроти геского фактора оп гколи, в который не вводили USA, и эти контрольные аликвотные доли также подвергали анализу на определение активности некротического фактора.
Полученные результаты представлены в табл. 2о
Стаб шизирующий эффект различных концентраций USA при концентрации фактора некроза опухоли 1,210 ед/мл представлен в табл.3.
Из результатов табл.3 следует, что стабилизирующ1гй эффект на активность фактора некроза опухоли выявлен в концентрации от 10 до 50000 мкг/мл раствора фактора.
Формула изобретения
Способ стабилизации высокооч1пцен- ного фактора некроза опухоли из
плазмы или сыворотки кролика, индуцированного липополисахаридами, путем добавления к водному раствору, содержащему укпяянньй фактор в кон
Таблица 2
Остаточная активность по некротическому фактору опухоли,%, при концентрации USA, мг/мл
Концентрация USA, мкг/мл
16059148
центрами ед/мл, альбумина человеческой сыворотки в количестве 10 мкг - 50 мг на 1 мл водного раствора.
Таблица
Таблица 3
Остаточная активность некротического фактора опухоли, хранение при 4 С в течение 7 дней
