Способ получения тимусзависимых лимфоцитов Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

со

СХ)

ел Изобретение относится к медицин в частности к способам получения фракции тимусэависимых лимфоцитов. Известен способ получения лимфо цитов-, включающий выделение лимфоци тов из лейкоконцентрата путем пропускания лейкоконцентрата через со бенты, такие как дедероновую ткань полистирол, хлопковые и стеклянные волокна С ЗНедостатком указанного способа является невозможность получения очищенной субпопуляции тимусзависимых лимфоцитов. Способ позволяет получить лишь все лимфоциты. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигае мому эффекту является способ получения очищенной фракции тимусзависи мых лимфоцитов, предусматривающий получение лимфоцитов периферическо крови человека, нанесение их на колонку с синтетическим волокном, пропитанным питательной средой, инкубирование колонки в термостате и элюирование тимусзависимых лимфоцитов из колонки питательной средой f 2 . В качестве синтетического волокна используют нейлон. В результате получают фракцию тимусзависимых лим цитов с содержанием 76,0+5,2% с при месью бурсазавйсимых лимфоцитов 1,5+0,4%. К недостаткам известного способа относится значительная примесь нулевых клеток во фракции, обогащенной тимусзависимыми лимфоцитами, а также использование дорогостоящего импортного волокна. Целью изобретения является повышение степени очистки целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения тимусзависимых лимфоцитов, предусматривающему получение лимфоцито периферической крови человека, нанесение их на колонку с синтетическим волокном, прописанным питательной средой, инкубирование колонки в термостате и элюирование тимусзависимых лимфоцитов из КОЛОНКИ питательной средой, в качестве синтетического волокна используют л авсан Сущность способа заключается в следукмцем. Кровь из вены (10 мл) забирают в пробирки с 0,2 мя гепарина. После отстаивания в термостате при 37 С в течение 30-60- мин отсасывают плаз му и наслаивают на градиент плотное ти верографина, центрифугируют при 4000-45 мин. Лимфоциты отмывают трижды 199 и ресуспензируют этой питательной среде из расчета 4-5 10 кле ок/мп. Лавсановое волокно промывают 23 раза дистиллированной водой и высушивают 24 ч при комнатной температуре. Затем туго заполняют шприц лавсаном до 5-миллилитровой метки с помощью поршня шприца. Через колонку пропускают 3-5 раз 0,1 и. раствор соляной кислоты, выпуская его медленной струей, после чего промывают колонку 8-10 раз дистиллированной водой. Тщательно выдавливают из шприца дистиллированную воду. Наслаивают на колонку 5 мл среды 199, содержащей 5-10% сыворотки крупного рогатого скота и дают ему впитаться в лавсан, после этого поршнем шприца выдавливают питательную среду из лавсана. На шприц надевают инъекционную иглу, устанавливают шприц-в гнездо штатива для пробиок и надевают на конец иглы резиновую пробку для предотвращения вытекания суспензии лимфоцитов после заполнения колонки .На колонку наносят каплями 1 мл приготовленной суспензии лимфоциов,сверху наслаивают питательную среу с таким расчетом,чтобы среда покрывала поверхность лавсана в колонке. После этого колонку помещают в термостат и инкубируют при 1 ч. После окончания инкубации колон- . ку извлекают из термостата, убирают пробку с кончика иглы и- наслаивают на колонку мл питательной среды. С помощью поршня шприца выпускают медленной струей содержимое шприца в пробирку, сильным давлением на поршень шприца выдавливают питательную среду из лавсана. Клетки в элюированной фракции концентрируют центрифугированием. В полученной фракции производят подсчет лимфоцитов в камере Горяева и окрашивают лимфоциты трипановым синим для оценки жизнеспособности клеток. Производят определение числг :имусзависимых лимфоцитов методом спонтанного розеткообразования с бараньими эритроцитами и бурсазавйсимых Лимфоцитов 1 етодом ЕАС-розетко--, образованияi Пример. Исследование про- изводили у 23 здоровых доноров. Готовят суспензию лимфоцитов крови. Лавсан прогнивают и высушивают в течение 24 ч при комнатной температуре, заполняют им шприц-колонку и пропускают 40 мл 0,1 н. соляной кислоты, после чего промывают колонку 100 мл дистиллированной воды, наслаивают 5 мл среды 199. На колонку наносят каплями 1 мл приготовленной суспензии лимфоцитов, сверху наносят питательную среду. Колонку помещают в термостат и инкубируют при 37°С 60 мин. Затем проводят элюцию обогащенной фракции тимусзависимых лимфоцитов 5-10 мл питательной среды со скоростью 20 капель/мин.

Процент жизнеспособности клетокв полученной фракции составляет 95-99%, выход клеток 5-10% от исходного количества нанесенных ita колонку лимфоцитов.

Данные о процентном содержании субпопуляций лимфоцитов до и nocnt разделения на колонке представлены в таблице.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТИМУСЗАВИСИМЫХ ЛИМФОЦИТОВ путем нанесения лимфоцитов периферической крови на колонку с синтетическим волокном, пропитанным питательной средой, инкубирования колонки в термостате и элюирования тимусзависимых лимфоцитов из колонки питательной средой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта, в качестве синтетического волокна используют лавсан. (Л с:

П р им е р 2, Донор Б. Выделено 10 -10° лимфоцитов. Т-лимФоциты составляют 45%, В-лимфоциты - 14%, О-лимфоциты-41% 5 10. Лимфоциты насла вают на колонку с лавсаном, ли фоцитов на колонку с нейлоном. Инкубация 60 мин при 37°С. В элюате из колонки с лавсаном получают содержание клеток: Т-лимфоциты - 94%, В-лим фоциты - 0%, О-лимфоциты.- 6%. В люате из колонки с нейлоном содерт жится 86% Т-лимфоцитов, 2%- В-лимфоцитов и 12% О-лимфоци,тов. П р и м е р 3 . Донор К. Выделетно 12-Ю лимфоцитов . на градиенте плотности фиколл-верографина. Т-лимфоциты составляют 54%, В-лимфоциты 17%, О-лимфоциты - 29%. 510 лимфоцитов наслаивают на колонку с лавсаном, 5-10 лимфоцитов - на колонку с нейлоном. Инкубация 60 мин при 37°С. В элюате из колонки с лавсаном получают следующее содержание клеток: Т-лимфоциты - 98%, В-лимфоци ты - 0%, О-лимфоциты - 2%. В ajTwa из колонки с нейлоном содержатся 84% Т-лимфоцитов, 2% В-лимфоцитов, 14% О-лимфоцитов. Пример 4 Донор Г. Выделено 8% Ю лимфоцитов на градиенте плотности фиколл-верографина. Т-лимфоциты составляют 38%, В-лимфоциты 17%, О-лимфоциты- 45%. 410 лимфоцито наслаивают на колонку с лавсаном, 410 лимфоцитов - на колонку с нейлоном. Инкубация 60 мин. при 37С. В элюате из колонки с лавсаном получают следующее содержание клеток: Т-лимфоциты - 86%, В-гяимфоциты - 1%, О-лимфоциты - 13%. В из колонки .с нейлоном содержится 70% Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов - 3%, О-лимфоцитов - 27%. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет повысить содержание тимусзависимых лимфоцитов на 8-16% с одновременным снижением содержания В-лимфоцитов и О-лимфоцитов сортветственно на 2,0-2,2% и на 12-14%.