Способ получения рибонуклеаз из Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РИБОНУКЛЕЛЗ ИЗ ASPERGILLUS CLAVATUS Изобретение относится к биохимии а именно к способам одновременного получения вне- и внутриклеточных ферментов микробиологическим путем. Известен способ получения гуанил специфичной внеклеточной рибонуклеа зы Aspergillus clavatus, предусматривающий культивирование продуцента на комплексной питательной среде, отделение мицелия фильтрованием, осаждение рибонуклеаз из фильтрата культуральной жидкости с последующей хроматографией ферментов на ДЭАЭ-целлюлозе и кристаллизацией. повторной хроматографии на ДЭ целлюлозе проводят гельфильтрацию на сефадексе С-75. Способ предполагает получение только одного фермен :та из материала одной ферментации 1 Недостатками данного способа являются невысокий-выход фермента и получение только одного фермента. Цель изобретения - повышение выхода целевых продуктов, более полно использование сырья и возможности разделения неспецифичных и гуанилспецифичных рибонуклеаз. Указанная цель достигается тем, что мицелий продуцента лиофильно вы сушивают, экстрагируют из него буфером при рН 4-9 внутриклеточные рибонуклеазы, а затем по единой схеме осуществляют очистку внутриклеточных и внеклеточных рибонуклеаз, полученных осаждением из фильтрата культуральной жидкости, после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе проводят разделение неспецифичных и гуанилспецифичных рибонуклеаз на йЛЕсефадексе, после чего препараты неспецифичных рибонуклеаз подверга рт гельфильтрации на сефадексе G-75 и хроматографии на QАЕ-сефадексе, а препараты гуанилспецифичных рибонуклеаз хроматографируют на КМ-целлюлозе и кристаллизуют. Способ осуществляют по следующей схеме. Гриб Aspergillus clavatus выращивают на комплексной питательной среде. Мицелий отфильтровывают и лиофильно сушат. Белки из лиофильно высушенного мицелия экстрагируют буферным раствором. Белки фильтрата культуральной жидкости осаждают добавлением сульфата аммония и растворяют в буферном растворе. Белки и экстракта и раствора сорбируют на ДЭАЭ-целпюлозе, элюируют. Элюаты хроматографируют на колонках с QAE-сефадексом

для разделения неспецифичных и гуанилспецифичных РНКаз. Далее растворы неспецифичных рибонуклеаэ подвергают гельфильтрации на колонках с сефадексом G-75. Элюаты хроматографируют на колонках с ОАЕ-сефадексом, Растворы гуанилспецифичных рибонуклеаз подвергают хроматографии на колонках с КМ-целлюлозой, затем проводят кристаллизацию ферментов при диализе.

Пример. Гриб Aspergiltus clavat us выращивают в ферментере на комплексной среде. Мицелий отфильтровывают и лиофильно сушат. Белки из лиофильно высушенного мицелия экстрагируют 0,05 М трис-НСе буфером, рН 7,5 (16 л/кг сухого мицелия). Белки фильтрата культуральной жидкости осаждают добавлением сульфата аммония (660 г/л) и растворяют в 0,1 М трис-НСЕ буфере, рН 7,5. Белки из экстракта и раствора белков, осажденных сульфатом аммония, сорбируют в статике на ДЭАЭ-целлюлозе или ДЭАЭсефадексе (5 г сухого сорбента/1 л), уравновешенных 0,1 М трис-НСВ буфером, рН 7,5. Элюцию проводят 2 л 0,5 М ацетатного буфера, рН 4,5. Элюат подвергают хроматографии на колонке с QАЕ-сефадексом (5x50 см), элюцию проводят линейным градиентом ионной силы исходного буфера (0,05-0,5М

Далее очистку неспецифичных и гуанилспецифичных рибонуклеаз проводят раздельно. Растворы неспецифичных рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на колонке с сефадексом G-75 (5x100 см), уравновешенной 0,05 М трис-HCt буфером, рН 7,05, содержащим 0,1 М КСР. Затем проводят хроматографию на колонке с QAE-сефадексом (5x50 см) , фермент элюируют линейным градиентом ионной силы исходного буфера (0,,5 м) . Растворы гуанилспецифичных рибонуклеаз подвергают хроматографии на колонке с КМ-целлюлозой (5x20 см), уравновешенной 0,05 М ацетатным буфером, рН 4,5. Фермент элюируют линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в исходном

буфере. Затем проводят кристаллизацию ферментов при диализе против разбавленных буферов, РН 3,5, 5,0, 5,6.

Описанный способ позволяет получить в результате одного процесса культивирования по единой схеме очистки четыре фермента: неспёцифичные и гуанилспецифичные вне- и внутриклеточные рибонуклеазы.

Формула изобретения

Способ, получения рибонуклеаз из Aspergillus clavatus, предусматривающий культивирование продуцента на комплексной питательной среде, отделение культуральной жидкости от мицелия фильтрованием, осаждение рибонуклеаз из фильтрата культуральной жидкости с последующей хроматографией ферментов на ДЭАЭ-целлюлозе и кристаллизацией, отличающийс я тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, более полного использования сырья и возможности разделения неспецифических и гуанилспецифических рибонуклеаз, мицелий продуцента лиофильно высушивают, экстрагируют из него буфером при рН 4-9 внутриклеточные рибонуклеазы, а затем по единой схеме осуществляют очистку внутриклеточных ферментов и внеклеточных рибонуклеаз, полученных осаждением, из фильтрата культуральной жидкости, после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе проводят разделение неспецифических и гуанилспецифических рибонуклеаз на (1АЕ-сефадексе, после чего препараты неспецифических рибонуклеаз подвергают гельфильтрации на сефадексе G-75 и хроматографии на ЦАЕ-сефадексе, а препараты гуанилспецифичных рибонуклеаз хроматографируют на КМ-целлюлозе и кристаллизуют.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельстве) СССР № 596616, кл. С 12 Р 13/00, 1978.