Способ определения холестерина в крови Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

00

vj

со

00

Изобретение относится к медицине, в частности к электрохимическим спообам анализа коН1|ентрац1 и холестерина и крови путем измерения тока ермент-Hbix реакций при электролизе.

Цель изобретения - упрощение способа за счет исключения стадий,

На фиг. 1 изображена схема измерительной ячейки; на фиг. 2 - калибро- Q вочный график завис:имости тока от концентрации холестерина.

Измерительная ячейка для осуществления способа(фиг.1)состоитиз корпуса 1.изготовленного из органического стек-15 ла и содержащего входной и выходной патрубки для промывки и заполнения ячейки буферным раствором, и измерительной камеры 2 с магнитной мешалкой 3, в которую помещены рабочий 20 Pt-электрод 4, покрытый трехслойной мембраной 5, и Ag/AgCl-электрод 6 сравнения, и которая содержит верхнее отверстие для введения пробы и фермента.25

Трехслойная мембрана 5 изготовлена по известной методике с использованием лавсановой мембраны проницаемостью 10,7% и д,иаметром порО,54 мкм, полупроницаемой ацетатцеллюлозной 30 мембраны, а вместо, ферментативного слоя находится иммобилизованный альбумин. Промывка и заполнение ячейки буферным раствором осуществляется при помоиш двухканального перистальтического насоса. Рабочий и вспомогательный электроды присоединены к поляро- графу с самописцем.

В измерительную ячейку, .содержащую буферный раствор, вводят 0,02 мл ра- .-. створа холестерина и через 10 с 0,05 мл раствора холестеролоксидазы. Под действием фермента окисляется холестерин и выделяется перекись водорода. Электрохимическое ее окисление на Pt-аноде при 0,6 В относительно насьщенного Ag/AgCl-электрода сравнения генерирует анодный ток, величина которого пропорциональна концентрации холестерина. Платиновый -электрод отделен от реакционной смеси трех слойной защитной мембраной, что обеспечивает отсутствие фоновых токов и при введении пробы крови в ячейку.Изменение фонового тока в 50-кратно разбавленной крови не превышает 1-2%, Поэтому концентрацию холестерина в крови определяют по калибровочному графику для чистого раствора. После

45

.0

Q

15 20 25

30

.-.

45

0

анализа ячейка промывается в течение 1,5 мин струей буфера, после чего можно проводить следующее измерение, Пример 1. Определение зависимости величины стационарного тока электрода от концентрации холестеролоксидазы. Электролиз раствора проводят в присутствии 0,2 мМ холестерина в ячейке в 0,01 М фосфатном буфере (рН 7,2), содержащем 0,1 М КС1, 1 мМ ЭДТА, 0,2% дезоксихолата натрия и 5 мМ азида натрия. Полученные результаты приведены в табл. 1.

Данные табл. 1 показывают, что резкая зависимость тока от концентрации фермента наблюдается до 0,33 ед/мл.

Пример 2. Определение зависимости стационарного тока электрода от концентрации холестерина.

Проводят электролиз в присутствии 0,33 ед/мл холестеролоксидазы. Другие условия, как в примере 1. Степень разбавления образцов в ячейке - 50 раз. Результаты приведены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что в интервале концентраций холестерина 1-10 мМ наблюдается прямолинейная зависимость тока от концентрации. По данным табл. 2 строят калибровочный график, используемый затем при определении холестерина в крови (фиг. 2).

Пример 3. Определение зависимости стационарного тока от концентрации азида натрия.

Электролиз раствора проводят в присутствии 20 мкл крови, 0,40 ед. холестеролоксидазы в буферном растворе, содержащем 0,22% дезоксихолата натрия и азид натрия в интервале концентраций 2-14 мМ. Другие условия электролиза, как в примере 1.

Результаты приведены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что при определении холестерина в крови при увеличении концентра1и1И азида натрия до 3,0-4,0 мМ ток электрода увеличивается, в интервале концентраций 4,0-7,0 не меняется, а в дальнейшем начинает падать. При измерении холе1 терина в водных растворах в зтом интервале концентраций азида ток практически не меняется. Таким образом, при реализации способа применяется 4-7 мМ аз1ада натрия в буферном paci воре.

Пример 4. Определение зависимости стационарного тока от концентрации дезоксихолата натрия.

Электролиз раствора проводят ,в присутствии 20 мкл крови, 0,50 ед. холестеролоксидазы в буферном растворе, содержащем 7 мМ азид.з и 0,1- 1,0% дезоксихолата натрия. Другие условия, как в примере 1. Результаты приведены в табл. А,

Данные табл. 4 показывают, что при определении холестерина в крови наибольший ток наблюдается при концентрации дезоксихолата натрия 0,18- 0,22/0.

Ф о р м у л а и 3 о б р f т е н и я

Способ определения холестерина в крови, включающий электролиз исследуемой пробы в фосфатном буфере, содержащем этилендиамиятетраацртат, хлористырг калий, нативную холест1 рол- оксидазу, азид натрия и детергент с последующей регистрацией в личины

анодного тока в сравнении с ко 1тро- лем, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет исключения стадий, электроли;|у подвергают пробу цельной крови, в качестпе детергента приме}:яют дезокси- холат натрия D концентрации 0,18 - 0,22 мае . %,а холестеролоксидазу и натрия использует в концентрации 0,33- -0,5ед./см и4-7мМ соотпетственно. Таблица 1

Изобретение относится к медицине, точнее к электрохимическим способам анализа концентрации холестерина в крови путем измерения тока ферментных реакций при электролизе. Цель изобретения - упрощение способа за счет исключения стадий. Для этого проводят электролиз исследуемой пробы цельной крови в фосфатном буфере,содержащем зтилендиаминтетраацетат,хлористый калий, нативную холестеролок- сидазу, азид натрия и детергент, в качестве которого применяют дезокси- холат натрия. Для осуществления способа используют измерительную ячейку, состоящую из корпуса, входного и выходного патрубков для промывки, измерительной камеры, в которую помещены рабочий Pt-электрод, покрытый 32- слойной мембраной, и Ag/AgCl-элект- рг)Д сравнения с отверстием для введения пробы и фермента. Под действием фермента окисляется холестерин, вьще- ляется перекись водорода. Электрохимическое ее окисление на Pt-аноде при 0,6 В отн.насыщ. Ag/AgCl-элект- рода сравнения генерирует анодньсй ток, величина которого пропорциональна концентрации холестерина. 4 табл. 2 ил. (Л

Холестеролоксидаза,

ед./мл (см )0,033 0,066 0,132 0,198 0,264 0,33 0,50

Ток электрода, мкА0,06 0,12 0,23 0,275 0,29 0,30 0,305

Таблица 2

Концентрация холестерина, мМ0,02 0,04 0,08 0,1 0,12 0,16 0,2

Ток,НА30,5 59,2 118,0 148,0181,0 238,0292,0

Таблица 3

Концентрация азида

натрия, мМ2,0 2,5 3,0 4,0 5,0 7,0 9,0 11,0 14,0

Ток электрода, нА 40,0 45,0 49,0 51,0 52,0 52,0 48,0 45,0 40,0

Таблица 4

Концентрация дезоксихолата натрия,

%0,1 0,13 0,18 0,20 0,22 0,30 0,40 0,60 0,80 1,0

Ток электрода, нА

15 35 48 50 48 45 40 35 30 25

- 77... ). ..

Редактор В. Данко

{,0 0,08OJZ 0,1B0.20

холестерин мМ 6

f с

( оставитель А. Лг уреев

Техред М.ДидыкКорректоре, Шекмар

TV

- ..-.-..-.-.--.-...-.-.vTTJ

rg-a-.-.v .-..-.1

. . .;- , V . V ;. : .|

.- . A ... ..-I