Способ культивирования изолированных пыльников злаковых растений Советский патент 1992 года по МПК C12N5/04 A01H4/00 

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в эмбриологии при уточнении стадий микроспорогенеза, в

генетике и биотехнологии при культивировании пыльников гибридных растений с целью получения гибридных линий продайнутых поколений и селекции - для создания многообразного исходного материала и константных гибридных линий.

Известен способ культивирования пыльников злаков, при котором котором пыльники имплантируются на искусственную питательную среду на стадии, когда микроспора проходит фазу клеточного цикла.

Недостатком этого способа является невозможность точного определения названной стадии развития микроспор.

Известны работы, в которых указывается, что оптимальной стадией является стадия средней или поздней вакуолизированной микроспоры.

Однако и в этой,работе не указывается, как ее определить, поскольку показано, что наличие вакуоли является не самым главным признаком при определении стадии развития микроспоры. Основным критерием при определении стадий одноядерного пыльцевого зерна является расположение ядра по отношению к поре. Наличие большой вакуоли, оттесняющей ядро к стенке, противоположной поре прорастания, позволяет отнести такую микроспору к поздней одноядерной стадии,

Вакуоль появляется уже в средней одноядерной стадии развития микроспоры. Ядро при этом занимает различное положение по отношению к поре.

В то же время известно, что в один и тот же момент наблюдения в одном и том же пыльнике будут наличествовать микроспоры на разных стадиях развития.

Недостатком известных способов является расплывчатость и неконкретность в определении стадии имплантации микроспор.

На основании цитологического изучения большого количества микроспор в пыльниках некоторых видов злаковых, таких, как яровая мягкая пшеница, озимая рожь и тритикале, в течение ряда лет дает основание уточнить имеющуюся классификацию стадий микроспорогенеза и дополнить ее новыми характеристиками, касающимися как состояния микроспор, так и стенок пыльника. Подвергается существенной коррекции поздняя одноядерная стадия развития микроспоры пыльника, на которой ядро микро; споры оттесняется центральной вакуолью на противоположную поре микроспоры сторону. Она продолжительна .во времени и за это время происходят существенные изменения в стенке пыльника. Синхронизация стадий микроспорогенеза и состояния стенок пыльника проведена впервые.

Из анатомии растений известно, что стенка пыльника состоит из экзотеция, эндотеция и тапетума. На поздних стадиях развития пыльника в эндотеции появляются фиброзные утолщения.

Однако в этих ссылках нет указаний на состояние микроспор или пыльцевых зерен,

соответствующих данной стадии,

Мелкие фиброзные бляшки впервые появляются, когда популяция микроспор в пыльнике имеет следующий состав: 50% микроспор на средней стадии микроспорогенеза; 50% микроспор на поздней стадии. Синхронно с увеличением популяции поздних микроспор утолщается и фиброзный слой эндотеция. Изолирование пыльников на этой стадии и культивирование их на

питательной среде in vitro позволяет получать наивысший выход эмбриоидных структур.

Целью изобретения является увеличение выхода эмбриоидных структур.

Способ состоит в том, что проводят определение стадии развития микроспор, культивирование их на питательных средах, получение эмбриоидов и регенерацию из них растений, при этом основной упор делается на точное определение стадии развития микроспор, способных к прямому эмбриоидогенезу.

Способ осуществляют следующим образом.

У пыльников средней части колоса определяют стадию развития микроспор. Для этого готовят сдавленный ацетокармино- вый препарат. Проводят подсчет числа микроспор с различной стадией развития. Для

определения стадии развития микроспор извлекают пыльник из колоска средней части колоса. Располагают его в каплю 1 %-ного ацетокармина на предметном стекле. Каплю разогревают на пламени спиртовки, не

допуская закипания. Затем препарат каптируют покровным стеклом и раздавливают. Исследуют препарат в микроскопе в проходящем свете. Отмечают стадии развития микроспор, подсчитывают количество микроспор.

На этом же препарате исследуют стенки пыльника. Фиброзные утолщения имеются, если большинство микроспор (70-90%) находятся на поздней одноядерной стадии единственное ядро микроспоры оттеснено вакуолью к стенке микроспоры, отстоящей напротив поры. Отбирают колосья, содержащие такие микроспоры (т.е. хорошо развитые фиброзные утолщения в стенке

пыльника), стерилизуютдиацидом, изолируют пыльники, культивируют их на питательной среде Potatoll (табл. 5). в которой представлен состав питательной среды для

инициации эмбриоидов в культуре изолированных пыльников яровой пшеницы.

Поверхностно стерилизованные пыльники, извлеченные из двух нижних цветков 6-8 колосков средней части одного колоса, помещают в одну биологическую пробирку с питательной средой, Штативы с пробирками ставят в темноту на 7 дней в термостаты с температурой +32°С. Затем культивирование продолжают в темноте при 27°С до образования эмбриоидов.

П р и м е р 1. Колосья сорта яровой мягкой пшеницы Скала срезают в поле или в теплице. Цитологически выявляют наличие фиброзных утолщений в эндотеции с одновременным подсчетом числа поздних микроспор. При нахождении соответствующей стадии колосья стерилизуют, изолируют пыльники и имплантируют их на питательную среду. Через 28-30 дней культивирования появляются первые эмбриоды (табл. 1).

П р и м. е р 2. Аналогично примеру 1 производят культивирование изолированных пыльников сорта Соналика (табл. 2).

П р и м е р 3. Аналогично примеру 1 определяют стадию развития микроспор и

0

5

0

5

фиброзных утолщений у Линии 35. Данные приведены в табл. 3.

П р и м е р 4. Аналогично примеру 1 исследуют культуры изолированных пыльников озимой ржи сорта Чулпан и тритикале (табл. 4).

Преимуществами изобретения являются высокий выход эмбриоидов, быстрота определения стадии развития, большая экономия времени, средств и реактивов, возможность круглогодичного эксперимента, многократное увеличение выхода эмбриоидов и растений в культуре in vitro no сравнению с известным способом.

Формула изобретения Способ культивирования изолированных пыльников злаковых растений путем помещения пыльников на искусственную питательную среду и выращивания до образования эмбриоидов, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода эмб- риоидных структур, перед помещением пыльников на питательную среду цитологически выявляют наличие фиброзных утолщений эндотеция стенки пыльника среднего колоска колоса.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при культивировании пыльников гибридных растений для получения нового исходного материала. Целью изобретения является увеличение выхода эмбриоидных структур. Способ предусматривает выращивание пыльников на искусственной питательной среде с получением растений-регенерантов, при этом перед помещением пыльника на среду цитологически выявляют наличие фиброзных утолщений эндотеция стенки пыльника среднего колоска колоса, что соответствует наиболее благоприятной для андрогенеза стадии развития микроспор. 5 табл. СО С vi N3 0 оо оо

Таблица

е

1988 1988

Есть Нет Есть Нет

Та б л .и ца 2

Т а- б л и ца 3

314 117 412 115

2k

1,5

62

2,5

Состав питательной среды Potato II

MgS04- Н20

ZnS04-7Hfcp

KJТиамин-НС11,0

Глицин

Лиридоксин-HClИикЪти новая кислота

Аспарагиновая кислота

Сахароза700

,1

Индолилуксусная кислота

КинетинМезо-инозитРН5,8

172468810

ТаблицаБ