Способ получения рестриктазы Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 

О5 «vj

Изобретение относится к микробиологии и касается способа получения новой сайт-специфической эндонуклеазы (рестриктазы).

Способы получения рестриктаз традиционны. Получение рестриктазы состоит из нескольких этапов: накопление биомассы, разру шение клеток, получение грубого экстракта, освобождение от нуклеиновых кислот обработкой сульфатом стрептомицина, высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрация на биогеле А-05М, анионообменная хроматография на ДЕАЕ-целлюлозе, катионообменная хроматография на фосфоцеллюлозе .Р-11, диализ против 50% глицерина 1.

Недостатки известного способа состоят в том, что ионообменники обладают незназд тельной емкостью и невысокой разрешающей способностью. Полученные препараты ферментов разбавлены (не концент зированы) и требуют специальной процедуры ковдентрирования. Регенерация ионообмеиников является тру доемкой процедурой и занимает много времени (5-10 дней).

Наиболее близким к изобретению является способ получения рестриктазы из штамма

-d.coll еК 2.

Однако данный способ также имеет указанные недостатки.

Цель изобретения - расширение ассортимента зффективных рестриктаз и сокращение времени их получения.

Для достижения указанной цели в качестве ипамма $.oofii используют штамм изоЬСК продуцирующий рестриктазу -Е.со С с сайтом, имеющим следуюшзто нуклеотидную последовательность:

JNTi;)eWC(N),e(M),g|V,

причем хроматографию осуществляют с испольхованием голубой сефарозы и фенилсефарозы, а элюат собирают в глицерин.

Пример. I. Способ получения фермента содержит следзоощие стадии: получение бактериальной массы, разрушение клеток, получение голубого зкстракта, хроматографию на гог. лубой сефарозе, хроматографию на фенилсефарозе. Элюирующая система представлена градиентом концентрации NaCI от 1,0 до 0,5 М и глицерина от О до 50%. Фермент во фракциях не обнаружен.

Пример 2. Способ получения фермеи- та включает получение бактериальной массы, разрушение клеток, получение грубого эдсстракта, хроматографию на голубой сефарозе, гфоматографию на фешшсефарозе. Элюирующая сие-. тема представлена градиентом концентращш NaCI от 1,0 до 0,0 М и глицерина от 0,0 до 50%; фермент злюируется четким пиком в трех фракциях.

Пример 3. Способ фермента включает получение бактериальной массы, разрушение клеток, получение грубого экстракта, хроматографию на голубой сефарозе, хроматографию на фенилсефарозе. Элюируюшая систе : ма представлена градиентом концентрации NaCI от 1,0 до 0,0 М и глицерина от 25 до 50% . Фермент элюируется нечетким размытым пиком в 9 фракциях.

Для стандартной процедуры выделения фермента выбран пример 2. Фермент обнаруживается в последних фракциях градиента, соответствующих 0,0-0,05 М NaCI и 49-50% глицерина

Предлагаемый способ отличается следующей особенностью: элюирование фермента осз цествляется непосредственно 50%-ным глицерином, что позволяет исключить стадию стабилизирующего диализа; ферментный препарат хранится при - в течение 18 мес без потери активности. Активность фермента определена в инкубационной смеси, содержащей 1 мкг ДНК бактериофага лямбда 6 мМ трис-НС1 буфера рН 7,5, 6 мМ MflClj и 6 мМ -меркаптоэтанола. После 60 мин инкубации при 37° С фрагментацию ДНК тестируют электрофорезом в пластинчатом 0,8%-ном агарозном геле. За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления мкг ДНК фага лямбда в течение 1 ч. Удельная активность полученного препарата 700 ед/мл и 6.800 ед. активности из 10 г сухой биомассы.

Пригодность полученного фермента для структурных исследований ДНК и опытов по конструированию in vitro рекомбинантных молекул ДНК определяют следующим образом: чтобь оценить полноту очистки рестриктазы от неспецифических эндонуклеаз ДНК плазмиды pBR 322, не содержащие сайта расщепления эндонуклеазы ..са.1 О К инкубируют с 10-крзтным избытком фермента в течение 6 ч и далее анализируют электрофоретическое поведение плазмидной ДНК; отсутствие экзонуклеаз и фосфатаз в препарате фермента определяют по способности вессоединения Е со СК-фрагментов ДНК вируса SA-7 с помощью ДНК-лигазь1 бактериофага 14. Получеинай препарат рестриктазы .соВл GK не содержит неспецифических эндонзтслеаз, ия что указывает полное сохранение суперспиральной структуры плазмидной ДНК pBR 322, не содержащей сайтов, узнаваемых эндонуклеазой рестрикщш Есо СК, при десятикратном избытке фермента и длительной инкубации. Полученный препарат фермента полностью лишен экзонуклеаз и фосфатаз, так как Е,со СК-фра менты ДНК способны соединяться с помощью ДЩК-лигазы. Все это указывает на то, что данный препарат фермента может быть использо- ван в экспериментах по генетич еской инженерии и структурных исследованиях ДНК. Получеиный препарат фермента - специфическая эндонуклеаза рестрикции Е со СК превосходит лучшие образцы зарубежных коммерческих препаратов (фирмы Берингер, ФРГ, Sigma, США) - ферментов данного класса по удельной активности) и соответствует им по степени очистки. Данная рестриктаза имеет четыре точки расщепления на ДНК бактериофага лямбда и отличается от всех описанных в литературе ферментов данного типа по харктеру фрагментдшш тесторных ДНК (см. таблицу); ДНК фага -Х 174, плазмиды pBR 322 и вируса ферментом Е со СК не расщепляются. Особенностью фермента является его уникальная чувствительность к аденовирусам человека и обезьян. ДНК аденовирусов типа 1,2,5,6 и 7 имеют не менее 10 точек расщепления для рестриктазы ..СО&«€К. Дпя идентификации последовательности узиавания данной рестриктазой использован метод секвенирования фраг 414 ментов ДНК, содержащих сайт узнавания для исследуемого фермента. Анализ совпадающих нуклеотидных последовательностей различных фрагментов ДНК позволяет установить, что сайт узнавания рестриктазы Е со СК является вырожденной прерьшистой несимметричной последовательностью нуклеотидов: мтфзсзе(ы)(м)з0н. Компьютерный анализ последовательной ДНК pBR 322, SV-40 и рк 174 подтверждает отсутствие такого сайта узнавания в указанных ДНК, устойчивых к действию ф мента. Указанная последовательность нуклеотидов, равно как и характер фрагментации тесто 1ых ДНК, отличается от таковых для всех изв естных рестриктаз. Согласно существующей номешсла.туре данная рестиктаза обозначена Е со СК. Количество сайтов узнавания на разных тесторных ДНК для рестриктаз, имеюишх 4 сайта узнавания на ДНК фага Л приведено в таблице.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ, включающий культипирование клеток штамма ..ооб1 -продуцента рестриктазы, разрушение клеток, осаждение клеточных обломков, получение экстракта и последующую хроматографию, отличающийся тем, что, с целью расширения ассортимента эффективных рестриктаз и сокращения времени их получения, в качестве штамма i cjoti используют штамм fc.uoLlCK, продуцирующий рестриктазу . сй UL с сайтом, имеющим следующую Н}та1еотидную последовательность; |ЫТ