Способ определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине в частности к ферментному анализу крови человека, и может быть использовано в медицинской практике при изучении биохимических показателей крови в клинике и эксперименте. Известен способ определения -активности моноаминоксидазы в тромбоцитах человека, основанный на способности алкогольдегидрогеназы из тканей млекопитаквдих катализировать восстановление альдегидов, образующихся при окислительном дезамиинровании аминов до соответствующих спир тов в присутствии НАДН 1. Недостатком способа является его низкая чувствительность. Известен также способ определения активности моноаминоксидазы путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом, .добавлением индикатора с последующим измерением его флуорес ценции 2. Однако известный способ имеет низкую информативную ценность, так как в качестве субстрата можно использовать только- бензиламин, в то время как по современным представлениям необходимо исследовать актив ность моноаминоксидазы с нecкoльки ш субстратамк, особенно в условиях патологии. Кроме того, 1,2-диаминонафтален, используемый в качестве индикатора в известном способе/ является сильно действующим канцерогенным веществом о Целью изобретения является повыше ние чувствительности способа при диф ференциальной диагностике психопатологических состояний. Поставленная цель достигается тем что согласно способу определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора с последующим измерением его флуоресценции, вьшеляют митохондриальные мембраны тромбоцитов , далее добавляют 110 -210 М пероасидазы и инкубацию проводят при Зб-Зв С в течение 15 - 20 мин, затем в реакционную смесь одновременно вно сят субстрат моноаминоксидазы и скопояитин. повторно инкубируют при 36 - 38°С в течение 20 - 50 мин и из меряют величину флуоресценции скополитина до и после инкубации. Кроме того, в качестве субстратов моноаминоксидазы используют фенилэтиламиНу бензиламин или триптамин. Способ осуществляют следующим об разом.. Из крови испытуемого вьщеляют тромбоциты, из которых получают мито хондриаЛьныв мембраны. Реакционную смесь, содержащую исследуемые фраг менты митохондриальных мембран (О.Щ, 0,2 ми белка), пероксидазу из хрена (1- 10 -2-10 М) , калий-натрий фосфат- , ный буфер 0,2 М с рН 8,4 до конечного объема 1 мл, инкубируют в течение 15 - 20 мин при 36 - с качанием в аппарате Варбурга для удаления-эндогенных субстратов пероксидазы. После охлаждения проб для определения активности моноаминоксидазы к реакционной смеси одновремейно добавляют субстрат фермента; фенилэтиламин, бензиламин или триптамин, в насыщающих концентрациях искополитин с последующим измерением величины флуоресценции екополитина. Далее пробы инкубируют в течение 20 - 5Q мин при 36 - . Реакцию останавливают помещением проб в ледяную баню и определяют величину тушения флуоресценции екополитина. Удельную активность моноаминоксидазы выражают в нмоль №20, образовавшейся, в ходе окислительного дезаминирования аминов на 1 мг белка за 20 - 50 мин повторного инкубирования в описанных условиях. Пример. Суспензию фрагмен-. |тов митохондриальных мембран тромбоцитов 0,01 мг в объеме 0,5 мл натрийкалий фосфатного буфера рН 8,4 помещают в 0, этого же буфера, содержащего 10м пе.роксидазы из хрена и инкубируют 15 мин при с качаниями в аппарате Варбурга. После охлаждения в ледяной .бане в реакцион-. ную.смесь одновременно добавляют .скополитин в концентрации 17 нмоль на 1 мл и бензила н 2,5-10 М, после чего пробы инкубируют 50 мин при в аппарате Варбурга. После охлаждения проб измеряют величину тушения флуоресценции екополитина при длине вЪлны 460 нм, при длине волны возбуждения 350 им и наблюдают генерацию 32 нмоль HjOg на 1 мг белка. П р и м ё р 2. Реакционную смесь,, содержащую фрагменты митохондриальных мембран тромбоцитов 0,05 мг в объеме 0,5 мл натрий-калий фосфатного буфера рН 8,4, пероксидазы 2 10 М в 0,35 мл этого же буфера, инкубируют 20 мин при в аппарате Варбурга. После охлаждения реакционной смеси в нее одновременно добавляют скополитин в концентрации 17 нмоль на 1 мл пробы и фенилэтиламин , после чего пробы повторно инкубируют в течение 20 мин при 38°С, охлаждают, измеряют величину тушения флуоресценции екополитина и наблюдают генерацию 13,1 нмоль на 1 мг белка. Примерз. Суспензию фрагментов митохондриальных мембран тромбоцитоЕ 0,02 мг в объеме 0,5 мл натрийкалий фосфатного буфера рН 8,4 помеают в 0,35 мл этого же буфера, , содержащего 210М пероксидазы, иикубируют 15 мин при . Далее в ох/лажденную реакционную смесь добавляют скополитин 17 нмоль на 1 мл и триптамин 10 М и измеряют величину флуоресценции скополитина. Затем реакционную смесь повторно инкубируют, 40 мин при , охлаждают и измерявют флуоресценцию скополитина и по . изменению флуоресценции определяют

активность моноаминоксидазы. При этих условиях наблюдают генерацию 27,9 нмоль бeлka.

Предлагаемый способ нетоксичен, обладает высокой чувствительностью, может быть использован в психиатрии при диагностике различных психических заболеваний и оценке эффектив.ности лечения.

I

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом в присутствии индикатора, с последующим измерением его флуоресценции, отличающийся тем, что, с целью пов лие-г ния чувствительности способа при диф ференциальной диагностике психопатологических состояний, вьщеляют митохондрис)льные мембраны тромбоцитов, далее добавляют -210 М пероксидаэы и инкубацию проводят при 36 в течение 15-20 мин, затем в реакционную смесь одновременно вносят субстрат моноаминоксидазы и скополитин. повторно инкубируют, при S 36 - в течение20 - 50. мин и (П измеряют величину флуоресценции скополитина до и после инкубации. 2. Способ по п. 1, отли ч а ющ и и с я тем, что, в качестве субс стратов моносиъшноксидазы используют фенилэтилсшин, бензиламин или триптамин. 4 СО 00