Способ определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

;о Изобретение относится к медицине в частности к ферментному анализу крови человека, и может быть исполь зовано в медицинской практике при изучении биохимических показателей крови в клинике и эксперименте. Известен способ флюорометрического определения активности моноаминоксидазы (МАО) в тромбоцитах путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом. Определение проводится в 0,2 MJ крови после инкубации реакционной смеси в течение 1 ч при fij. К недостаткам известного способа относятся малый диапазон линейности низкая специфичность. Кроме того, использование в качестве реагенФа 1,2-диаминонафталнна вещества с сильными канцерогенными веществами, придает способу большую травматичность. Известен также способ спектрофото метрического определения активности фермента, включающий экстракцию бекзальдегида циклогексаном с последующей детекцией при242 им 2. Недостатком известного способа является относительно низкая точность. Цель изобретения - повышение точности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности -моноаминоксидазы в тромбоцитах, включающему инкубацию их в присутствии бензиламина с последующим спектрофотометрическим опре делением концентрации образовавшегося бензальдегида, бензальдегид экстрагируют н-гептаном в соотношении (1:2,1) - (1:2,6) , экстракт хроматог рафируют при скорости протока элюента 1,9-2,1 мл/мин, а в качестве элюента используют смесь этанола с ВОДОЙ в соотношении (58:42)-(62:38 Способ осуществляют следующим образом. Тромбоциты вьщеляют из 10 мл крови, взятой из локтевой вены в пласти ковые стаканчики, куда предварительно добавляют 0,3 мл 0,27 М ЭДТА-буфера рН 7,4.. -Эритроциты и лейкоциты осаждают центрифугированием крови в течение 5 мин при 300 g. Надосадок повторно центрифугируют 20 мин при 2000 g. Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,65. Гомогенат центрифугируют при 20000 g 20 мин. Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0,2 М фосфатном буфере рН 8,4. В реакционную среду отбирают 0,1 мл суспензии. Количество белка определяют по методу Лоури и добавляют.0,4 мл 0,2 М K-Na фосфатного буфера рН 8,4. Затем к-реакционной смеси добавляют 0,1 мл (12 ммоль) раствора бензиламина и пробы инкубируют при 37 С в течение 10 мин при постоянном встряхивании. Реакция останавливается 0,1 мл 20% ТХУ. Вслед за этим в реакционную смесь добавляют гептан в отношении 1:2,1-1:2,6. Пробирки интенсивно встряхивают в течение 3 мин и центрифугируют при 1500 g 15 мин. Органическую фазу переносят в пузырьки автоматического пробоотборника, откуда она поступает в петлю хроматографа (жидкостный хроматограф высокого давления AnaIyst-7800, фирмы LDC). Объем вводимого в колонку с обращенной фазой (,6 мм Sperisorb ODS-10) раствора равен 20 мкл. В качестве подвижной фазы используют смесь этанола с водой в соотношении 58:42-62:38. Скорость протока элюента 1,9-2,1 мл/мин. Пример 1. Испытуемый М. . Взятие пробы крови, выделение тромбог цитов, инкубация их с бензиламином производится описанным способом. Образовавшийся бензальдегид экстрагируют Н -гептаном (1:2,1), затем хроматографируют при скорости протока 1,9 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанол-вода (58:42). При этом удельная активность фермента составила 73,33 ммоль/ч/мг белка. Пример 2 . Испытуемый В. Взятие пробы крови, вьщеление тромбоцитов, инкубация их с бензиламином проводится описанным способом. Образовавшийся бензальдегид экстрагируют Н -гептаном (1:2,6), затем хроматографируют при скорости протока 2,1 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанолвода (62:38), при этом удельная активность фермента составила 65,28 ммоль/ч/мг белка.

31091071

Использование предлагаемого спосо- анализа до 94%. Кроме того, способ ба определения активности МАО в тром- прост в использовании, не тр ебует боцитах позволит повысить точность малодоступных химических реактивов.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВ НОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ, включающий инкубацию их в присутствии бензиламина с последующим спектрофотометрическим определением концентрации образовавшегося бензальдегида, отличающийся TeMj что, с целью повьппения точности, беизальдегид экстрагируют Н -гептаном в соотношении