Способ получения глицерин-дегидрогеназы Советский патент 1983 года по МПК C12N9/04 

;о Изобретение относится к биохимической промьишенности в частности к получению ферментных препаратов,и может быть использовано для энзиматического определения глицерина и его производных (после расщепления последних до глицерина). Известен способ получения глицерин-дегидрогенаэы из микроорганизмов Aerobacter aerogenes штамма 1033 путем их аэробного культивирования на содержащей глицерин (0,2%) среде с последующей очисткой фермента из экстрактов клеток. Культивирование проводят в течение 18 ч, а выход фермента составляет 57,5 ед/л . культуры. Среда культивирования не содержит биотин или дрожжевой экстракт. Величина К для в&деления фер мента не определена точно, но, исхо дя из значений активности при двух концентрациях субстрата. Км быть меньше, чем 1-10 М ij . Недостатками способа являются не обходимость длительного (не менее 18 ч) культивирования клеток, выход фермента в расчете на литр кул туры, а также низкая величина Кд дл глицерина. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаем му эффекту является способ получени глицерин-дегидрогеназы из микроорга низмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивирования содержащей глицерин среде с последу ющей очисткой фермента путем экстракции клеток, фракционирования сульфатом аммония и термоинактиваци примесных белков. Культивирование микроорганизмов проводят при аэрации в течение 18-24 ч на среде с l, глицерина. Выход фермента после кул тивирования в течение 24 ч составля ет 8.3 ед/л среди Н . Недостатками известного способа . являются низкий выход фермента в расче на литр среды, необходимость длитель ного культивирования, а также получение фермента с высокой К () свидетельствунхиий о невысоком срод- стве фермента к субстрату. Последнее обстоятельство не позволяет эффективно использовать полученную глицерин-дегидрогеназу для энзиматического определения глицерина при низких концентрациях последнего. Целью изобретения является увеличение образования целевого продукта в Р4счете на литр культуры, снижение продолжительности ферментации и получение фермента со сниженной К/ для субстрата. Поставленная цель достигается тем что согласно способу получения глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивирования в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экстракции клеток, функционирования суль фатом аммония и термоинактивации примесных белков, в качестве микроорганизмов из вида Aerobacter aerogenes используют штаммы Aerobacter aerogenes DSM 1643 или Aerobacter aerogenes NCIB 418,a после завермения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэробное культивирование. В процессе анаэробного культивирования вводят дополнительные количества глицерина до достижения 1 % его содержания в среде. Кроме того, в питательную среду вводят биотин в концентрации 50 мкг/л. Использование микроорганизмов Aerobacter aerogenes штаммов DSM 1643 или NCI В 418 позволяет значительно увеличть выход глицерин-дегидрогеназы по активности (не менее, чем в 10 раз) даже при использовании известных способов культивирования и внщеления фермента. Предложенная в изобретении последовательность культивирования - сначала аэробные условия с подводом кислорода или кислородсодержащих смесей в течение фазы логарифмического роста, а затем анаэробные условия,позволяют получить фермент с большим выходом, чем при чисто анаэробных условиях. Увеличение образования глицериндегидрогеназы происходит также при введении на стадии анаэробного кулъ тивирования дополнительных количеств глицерина, т.е. количеств , чем потребляется микроорганизмами. Предпочтительно также вводить в среду культивирование биотин в концентрации 50 мкг/мл вместо дрожжевого экстракта. При культивировании в указанных условиях за 6-8 ч ферментации достигается максимальное содержание глицерин-дегидрогеназы, причем окончание культивирования может быть определено по начинающемуся снижению Рн среды. Выход фермента составляет при этом 3000-9000 ед/л среды. Величина К/ у выделенного фермента составЛ.яет 6,6-10 М. Вьзделение фермента из биомассы микроорганизмов проводят после разрушения клеток ультразвуком и последующего отделения растворимого фермента с помощью центрифугирования. Экстракт клеток фракционируют сульфатом аммония. Примесные белки выпадают в осадок при насыщении 35%, а глицерин-дегидрогеназы - при доведении насыщения сульфатом аммония до 45%. Содержащий глицерин-дегидрогеназу осадок растворяют в буфере и нагревают при в течение 4 мин

для денатурации примесных белков, которые отделяют центрифугированием. Удельная активность очигаенного фермента - 20 ед/мг белка.

Пример 1. Микроорганизмы Aerobacter aerogenes штамма DCM 1643 культивируют в среде, содержащей,%: пептон из казеина 0,8; мясной пептон 0,8; К2НРО4 О,3;(NH)НРОд О,2; NaCj 0,6; глицерин 1; биотин 50 мкг/ рН 7,0. Культивирование проводят при 37С, продувании воздуха и перемешивании в 10-литровом ферменте. В ферментер подают 300 л воздуха в час до окончания фазы логарифмического роста. Интенсивность перемешивания 300 об/мин.

При завершении фазы логарифмического роста прекращают доступ воздуха и начинают добавление глицерина При этом концентрация глицерина возрастает от 0,3 до 1,0% при окончании ферментации, протекающей за 6 ч.Количество полученной биомассы составялет 10 г/л, а активность глицериндегидрогеназы - 9000 ед/л.

Полученную суспензию культуры обрабатывают в аппарате, генерирую1;ем ультразвук, в течение 3 мин. Разрушенные клетки центрифугируют для отделения нерастворимых компонентов и определяют активность глицериндегидрогеназы в надосадочной жидкости.

Для дальнейшей очистки экстракт фракционируют сульфатом аммония, доводят насыщение раствора сульфа- том аммония до 35% и отделяют баластные белки центрифугированием, затем доводят насыцение до 45% и отделяют осадок, содержащий глицерин-дегидрогеназу. Осадок фермента растворяют в 0,1 М фосфатном буфе1ре с рН 7,0, содержащем 0,85% Ne(C.

Раствор нагревают при в течение 4 мин для инактивации примесных белков,. которые отделяют центрифугированием. Прозрачный раствор содержит глицерин-дегидрогеназу с удельной активностью 20 ед/мг и Куу для глицерина 6,.

Активность глицерин-дегидрогеназы определяют спектрофотометрически при 366 нм по образованию НАДН в

0 ходе ферментативной реакции. Реакционная смесь общим объемом 3,05 мл содержит 2,65 мл буфера с рН 10 (0,12 М ЫаНСОз и 0,04 М (), 0,1 мл ЮМ раствора НАД, 0,2 мл 1,5 М раствора глицерина и 0,1 мл .

5 экстракта или раствора фермента, разведенного в соответствии с его активностью. Реакцию начинают добавлением глицерина.

Пример 2. Культивирование

0 и вьщеление фермента проводят,как описано в примере 1, но в качестве микроорганизмов используют штамм Aerobacter aerogenes NCIB 4l8 (обозначаемый также как Enterobac-r

5 ter aerogenes). Длительность культивирования составляет 8 ч. Активность глицерин-дегидрогеназы 4000 ед/л культуры.

Применение предлагаемого способа

0 позволяет в 50-100 раз увеличить выход глицерин-дегидрогеназы в расчете на литр культуры, снизить время культивирования в 3-4 раза, а также получить фермент с величиной

5 6,, которая в 60 раз ниже, чем величина Км при других способах получения глицерин-дегидрогеназы. Получение глицерин-дегидрогеназы с более низкой величиной К позволяет более эффективно исполь0зовать этот фермент, особенно, в аналитических целях.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ из микроорганизмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивирования в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экстракции клеток, фракционирования сульфатом аммония и терйоинактивации примесных белков, отличагощийс я тем, что, с целью увеличения образования целевого продукта в расчете на литр культуры, снижения продол жительности ферментации и получения фермента со сниженной К для субстрата, в качестве микроорганизмов из вида Aerobacter aerogenes используют штаммы Aerobacter aerogenes DSM 1643 или Aerobacter aerogenes NCIB 418, a после .завершения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэроб ное культивирование.§ 2.Способ по п. 1, отлича- i- ю щ и и с я тем, что в процессе ана-, эробного культивирования вводят допол| в нительные количества глицерина до- достижения 1% его содержания в ереде. .5 3.способ поп. l,oтличaю щ и и с я тем, что в питательную среду вводят биотин в концентрации 50 мкг/л.