Питательная среда для получения сферопластов микобактерий туберкулеза Советский патент 1983 года по МПК C12N1/20 

ел 1 сд

со

САЭ Изобретение относигея к микробиолог в частности к бактериологической диагн тике, и касается питательной среды для получения сферся1ластов микобактерий ту беркулеза. Известна.питательная среда для получения сферопласгов микобактерий тубе кулеза, содержащая калий фосфорнокислы однозамещенный, натрий фосфорн-окислый двузамещенный, магний сернокислый, гл церин, сахарозу, ЛИЗоцим, цитрат аммон аспарагин, бактоагар, бычий сывороточны альбумин, никотинамид, хояестероп, ЭДТ и дистиллированную воду l . Однако известная среда не обеспечиваег быстрого получения сферопластов. Цель изобретения - ускорение получе сферопластов. Поставленная цель достигается тем, в питательной среде для получения сфер пластов микобактерий туберкулеза, содер жащей калий фосфорнокислый однозамеще ный, натрий фосфорнокислый двузамещен магний сернокислый, глицерин, сахарозу лизоцим и дистиллированную воду, она дополнительно содержит лаурилсульфат натрия при следующем количественном с отношении компонентов, вес.%: Калий фосфорнокислый ОД-ОД 5 однозамещенный На трий фосфорнокислый 0,15-0,17 двузамещенный 0,05-0,075 Магний сернокислый 2,5-3,0 Глицерин 15,0-20,0 Сахароза 0,8-1,0 .Лизоцим 0,4-0,6 Лаурилсульфат натрия Дистиллированная вода Остальное СреДу готовят следующим образом. Пример 1. Соли, глицерин и сах розу берут в следующем порядке и в соо ношении ингредиентов, вес.%: Калий фосфорнокислый однозамешенный Натрий фосфорнокислый двузамещенный Магний сернокислый Сахароза Глицерин Указанные ингредиенгы растворяют в 2100 мл дистиллированной воды и стери лизуют в автоклаве при 0,5 атм в течение ЗО мин. После охлаждения раствора нему добавляют, соблюдая стерильность, лизоцим и лаурилсульфат натрия при следующем соотношении ингредиентов, кес.% ЛизоцимО,9 Лаурилсульфат натрия0,5 Среда готова к применению. Пример 2. Среду готовят при следующем соотношении ингредиентов, вес.%: Калий фосфорнокислый одноаамещенный0,1 Натрий фосфорнокислый дву замешенный0,15 Магний сернокислый0,05 Глицерин2,5 Сахароза 15,0 ЛизоцимО,8 Лаурилсульфат натрия0,4 Дистиллированная водаОстальное В приготовленную среду помешают микобактерий туберкулеза человеческого вида штамм Н .RV в концентрации 0,05 г сухого веса культуры на 1 среды (или 5 г на 1ОО мл среды). Среду с помещенным в нее штаммом инкубируют в термостате в течение 24 ч при , после чего полученные сферопласты трижды отмыв ают путем центрифугирования йри 3 тыс. об/мин, физиологическим раствором. При этом общий выход биомассы сферопласз-ов составляет 4,5 г или 9О% . от исходного веса культуры. При весовом соотношении ингредиентов среды ниже приведенных в примере значений выход биомассы существенно снижается. Так, при весовом соотношении ингредиентов среды ниже приведенных в данном примере значений на О,О5-0Д выход биомассы сферопластов с предлагаемой среды составляет 65-75% от исходного веса культуры. Пример 3. Среду готовят при ледующем соотношении ингредиентов, ес.%: Калий фосфорнокислый однозам€ щенный0,15 Натрий фосфорнокислый двузамещенный.0,2 Магний сернокислый0,075 Глицерин3,0 Сахароза.2 О,О Лизоцим1,0 Лаурилсульфат натрия0,6 Дистиллированная водаОстальное В приготовленную среду помещают миобактерий :губеркулеза человеческого вида тамм И-1-, в концентрации 5 г на 00 мл среды. Среду с помещенным в нее таммом инкубируют в термостате в те ение 24 ч при 37 С, после чего полученые сферопласты трижды отмывают путем ентрифугирования при 3 тыс. об/мин в изиологическом растворе. При этом общий ыход биомассы сферопластов составляет ,9 г или 97% от исходного веса культу1Ы, Максимальные весовые значенияингредиенгов, приведенные в данном примере, явяяюгся оптимальными, при когорых на рреде наблюдается лизис сферопластов.

KoHrptOTb за сферопласгообразованием проводят методом фазовоконтрастной и электронной микроскопии. Среды имеют следующие характеристики .сферопластообразования (см.табл).

Как видно.из таблицы, наиболее эффективной оказалась среца |1 с 0,8% лизо

Сферопластообразование на испытуемых средах

цима и 0,4% лаурилсульфата натрия, в которой процент сфергашастообразования за 24 ч инкубации составил 96,8%. Лиз№цимы J и TZ вызывают лизис клеток.

Использование питательной среды поз«воляет ускорить получение сферопластов микобактерий туберкулеза (24 ч вместо 7-14 сут), удешевить среду, исключить длительный процесс пассирования, что, в свою очередь, позволяет снизить расход питательных сред.

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СФЕРОПЛАСТОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА, содержащая калий фосфорнокислый однозамешенный, натрий фосфорнокислый двуэамешенный, магний сернокислый, глицерин, сахарозу, лизоцим и дистиллированную воду, о т л и чающаяся тем, что, с целью ускорения получения сферопластов, она дополнительно содержит лаурилсульфат натрия при следующем количественном соотношении компонентов, мае. %: Калий фосфорнокислый, однозамещенныйО,1-О,15 Натрий фосфорнокислый двузамещенный0,15-0,17 Магний сернокислый0,05-0,075 Глицерин2,5-3,0 Сахароза15,О-2О,0 Лизоцчм0,8-1,0 i Лаурилсульфат натрияО,4-0,6 Дистиллированная вода Остальное (Л

Сферопластообразование, % Среда при времени инкубации, ч