Способ определения негемадсорбирующих вирусов Советский патент 1983 года по МПК C12N7/00 

05

4

Изобретение относится к вирусологии и касается способа определения нёгемадсорбирующих вирусов.

Известен способ определения вирусов в реакции гемадсорбции на поверхности зараженных клеток flJОднако известный способ не позволяет определить генемадсорбирующие вирусы.

Известен -способ определения нёгемадсорбирующих вирусов, например вируса герпеса, путем их выращивани в культуре.ткани с последующим наслаиванием суспензии стафилококков Cowan 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубированием реакционной системы и учета полученных результатов Сз.

Однако известный способ тгрудоеНкий, так как предусматривает сложную методику подготовки вирусов для учета результатов.

Цель изобретения - упрощение способа.

; Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения нёгемадсорбирующих вирусов путем их выращивания в культуре ткани с последующим наслоением суспензии стафилококков Cowan 1, сенсибилизированных противовирусной сывороткой, инкубированием реакционной системы и учетом полученных результатов, стафилококки дополнительно сенсибилизируют антиэритроцитарной сывороткой, при этом противовирусную и антиэритроцитарную сыворотки берут в количестве 100 вируснейтрализующих и 100 гемолитических доз соответственно-, после инкубирования добавляют взвесь эритроцитов и определяют вирус по наличию гемадсорб , --

Способ осуществляется следующим образом.

10%-ную взвесь золотистого стафилококка штамм Кован 1, инактивиро ванную формальдегидом, соединяют с гипериммунными сыворотками двух видов - против искомого вируса и гемолитической в соотношении 1:1:1 по объему. Активность исполь.зуемых сывороток должна быть не менее 100 вируснейтрализующих доз для противовирусной сыворотки и не менее 100 гемолитических доз для противоэритроцитарной сыворотки. Время контакта сывороток со стафилококком 40 мин при комнатной температуре. Полученную взвесь стафилококков отмвают дважды в трехкратном объеме ФБР рН-7,2 - 7,4. Для постановки способа используют 1%-ную взвесь стафилококков в ФБР. В каждую про-. бирку с зараженной культурой клеток и в контрольные пробирки вносят по 1 мл 1%-ной ..взвеси стафилококков и

после 15-минутного контакта при комнатной температуре производят трехкратную отмывку клеточного пласта ФБР от неадсорбированных стафилококков. Далее в пробирки вносят по 1 мл 0,4%-ной взвеси эритроцитов, смесь инкубируют 10 мин и производят аналогичную отмывку ФБР. Наличие адсорбции эритроцитов на зараженные клетки определяют тремя способами: визуально по окрашиванию клеточного пласта в рыжий цвет; пол малым увеличением микроскопа (100 раз } непосредственно в пробирках или матрицах; для количественного учета дозы вируса адсорбированные эритроциты: лизируют дистиллированной водой, внося ее по 1,5 мл в каждую пробирку и измеряют количество вируса по количеству гемоглобина, вышедшего из адсорбированных эритроцитов, на спектрофотометре при длине волны 410 нм по сравнению с контролями - незараженная культура клеток и дистиллированная вода.

Время постановки способа составляет 1,0-1,5ч.

Пример 1. Для определения присутствия вируса герпеса простого готовят стафилококковый диагностикум путем соединения 2 мл 10%-ной взвеси стафилококков с 1 мл иммунной кроличьей противогерпетической сыворотки в разведении 1гЗ (.титр сыворотки 1:320 ) и 1 мл гемолитической кроличьей сыворотки против эритроцитов барана в разведении 1:10 (титр сыворотки 1:1200). После контакта в течение 40 мин при 20°С полученный диагностикум 2 раза отмывают в ФБР с центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. Готовый препарат ресуспендируют до 10%-ной концентрации.

Культуру клеток Hep 2 заражают вирусом герпеса простого штамм Толстой в разведении 10 (титр вируса 10 ) и респираторно-синцитиальным (PC ) вирусом в разведении- (титр вируса 10 ). Через 1 и 2 сут после заражения в пробирки с зараженной культурой клеток и в контрольные пробирки вносят по 1 мл 1%-ного стафилококкового диагностикума. После 15-минутного контакта при комнатной температуре диагностикум сливают и трижды отмывают клеточный пласт ФБР от неадсорбированных стафилококков. Затемв пробирки вносят по 1 мл 0,4% эритроцитов барана на 10 мин, после чего пласт снова отмывают ФБР и производят трехэтапный учет результатов: визуальный учет по окрашиванию пласта; полуколичественный учет под микроскопом (подсчет бляшек адсорбции ; количественный учет по количеству гемоглобина в адсорбированных эритроцитах, для чего в каждую пробирку вносят по 1,5 мл дистиллированной воды. Количество гемоглобина определяют на спектрофотометре при длине волны 410 им.

Полученные результаты представлены в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что адсорбция комплекса стафилококк-эритроцит на незараженную культуру клеток и на зараженную не соответствующим иммунной сыворотке вирусом клеточную культуру крайне незначительна (0,0100,020 ОЕ), а на зараженные вирусом герпеса клетки уже в первые сутки адсорбция эритроцитов превышает контрольный уровень в 4 раза (0,085 ОЕ ), на вторые сутки - более, чем в 20. раз (0,400). Цитопатоген ный эффект в зараженной вирусомгерпеса простого клеточной культуре . появился лииф на 7 сут и только по нему без постановки реакции нейтрализации йдентифицировать вирус практически невозможно.

Пример 2. Осуществляют.способ аналогично примеру 1, но определяют 1рисутствие PC-вируса или аденовируса.

Результаты определения приведены в табл. 2.

Из результатов опыта видно, что начиная ,с первых суток после заражения культуры ткани возможно получение гемадсорбции, превышающей контрольный уровень в 4 - 7 раз.

При этом одновременно с получе- .

0 нием гемадсорбции, учитывая применение специфических антивирусных сывороток, происходит и идентификация вируса. По сравнению с использованием реакции нейтрализации в куль

5 туре ткани, применяемой обычно, ответ может быть получен на 1-2 сутки после заражения культуры ткани исследуемым материалом, т.е. на 510 дней раньше, чем в реакции нейтрализации.

0

Использование изобретения позволяет быстро выделить и идентифицировать этиологический агент, что значительно облегчает и сокращает вре5 мя работы по диагностике, что особенно важно при диагностике острых вирусных инфекций центргшьной нервной системы у детей.

Таблица 1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕГЕМАДСОРБИРУКХДИХ ВИРУСОВ путемих выращивания в культуре ткани с последующим наслоением суспензии стафилококков Cowan 1, сенсибилизированных противовирусной сыв-ороткой, инкубированием реакционной системы и учетом полученных результатов, о т л ич а ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения способа, стафилококки дополнительно сенсибилизируют антиэрктроцитарной сывороткой, при этом противовирусную и антиэритррцитаркую сыворотки берут в количестве 100 вируснейтралиэующих и 100 гемолитических доз соответственно, после инкубирования добавляют взвесь эритроцитов и определяют вирус по (Л наличию гемадсорбции.

НезараженОтрицательнаяный

II

Зараженная

вирусом

герпеса

Отрицатель0,020 ный 0,015

и

0,085

Около

40 бляшек

0,400

. Сплошная

гемадсорбция

Таблица 2