Способ получения малатдегидрогеназы из митохондрий головного мозга Советский патент 1985 года по МПК A61K38/44 A61K35/30 

1 Изобретение относится к биохимии и касается способов получения фер.мекта. малатдегидрогенаэы из митохонд рий jOjiosHoro мозга,. Известен способ получения малатдеги.црогеиазы из ткани сердца, 1вклю чающий гомогенизирование ткани, отделение супернатакта высаливание сульфатом аммония отделение ссадкй его перерастворениел диализ, хроматографию на колонке с карбоксиметил цел.п,Н1гюзой,, получение фракций с малатдеп-щрсгеназной активностью, диа лиз фракцш,, хроматографию на колон ке с сефа : ексом С j. Недостатками способа являются его миогостадийностЬ; относительно низкая чистота целевого продукта низкий выход. Известен способ получения малатдегндроген зы из митохондрий головного мозга5 включающий выделение ми тохондрий к очистку фермента с помощью ионообменной хроматеграфии 2 J К недостаткам известного способа относятся высокая трудоемкость и мно гостадийность продесса получения це левого продукт и его низкая удельная активность. Целью изобретения является упрощение спссоба и повышение чистоты целевого продукта. Поставтдвнная цель достигается тем что при способе получения малатдегидролсназы из митохондрий головного MO3raj включающем выделение митоходрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии j очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию проводят при рН 599-6, i, а промьюку и десорбцик фосфатным буферным раствором последовательно при рК 5,,,2 6,3-6,7 и 6,,2„ Пример К Из головного мозга получают (-мтохондрии по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4900мг общая активность 27440 ед, удельная активность 5р6вд/мг белка. Фракцию митохондрий суспендируют в О.,7м сахарозе (рН 7,4) до концентрации 20 мг/мпо Затем проводят центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (0,7:1,2г1,5 М) при 60000 g в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную фракцию митохондрий Общий белок 022 718 мг, общая активность 7811 ед, удельная активность - 11 ед/мг белка-. Митохондрии,, очищенные от миелина и синаптосом, суспендируют в 0,ОШ фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Полученньш гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин для полнего освобождения раствора от митохондриальных мембран. Супернатант отделяют от осадка, его общий белок 286 мг, общая активность 6581 ед, удельная активность 23 ед/мг белка. Доводят рН супернатанта до 5,9 0,1М соляной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного -супернатанта , 115,2 мг, общая активность 3918 ед, удельная активность 34,ед/мг белка. Супернатант пропускают через стеклянную колонку, заполненную катионитом Биокарб (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4,09 см ), со скоростью 88 мл/ч. По окончании сорбции колонку про1-1ывают водой до исчезновения белка в промывных водах (контроль на белок осуществляют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора при длине волны 280 и 260 им). Десорбцию проводят ступенчатым градиентом рН тремя 0,1 М фосфатными бу ферами с рН 5,9; 6,3 и 6,8. Скорость десорбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мл буфера с рН 5,9, затем 50 мл с рН 6,3 и наконец 120 мп с рН 6,8, На выходе из колонки отбираются фракции по 15 мл, в которых определяются рН, концентрация белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометрическим методом), фракции с удельной активностью выше 1000 ед объединяют. Объем активных фракций 76 МП, общий белок 1,23 мг, общая активность 3087,3 ед, удельная активность 2510 ед/мг белка. П р и М е р 2. Получают митохондрии из головного мозга по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4640 мг, общая активность 269S2 ед, удельная активность 5,8 ед/мг белка. Фракцшо : штoxoндpий суспендируют 0,7М раствором сахарозы

3

(рН 7,4) до концентрации 18 мг/мл и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы (О,7:1,2:1,5М) при 60000 g в течение 2 ч. Осадок представляет собой митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом. Общий белок 705 мг, общая активность 8 460 ед, удельная активность 12 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере 7,4 и разрушают в гомогенизаторе типа Блендор при 13000 об./мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин для полного осаждения митохондриальных мембран. Супернатант отделяют, его общий белок 27S мг, общая активность 6,325 ед, удельная активность 23 ед/мг белка. Доводят рН супернатанта до 6,0 О,1Н соляной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мкн для осаждения выпавших в осадок белков. Общий белок полученного супернатанта 118,6 мг, общая активность 3 795 ед, удельная активность 32 ед/нг белка. Супернатант пропускают через колонку, заполненную сорбентом Био- карб (внутренний диаметр колонк.и 1,7 см, объем сорбента 3,9 см), со скоростью 88 мл/ч. По окончании сорбции колонку промывают водой до исчезновения в промывных водах белка (контроль на белок осуществляют спектрометрическим методом).

Десорбцию проводят ступенчатым градиентом рН тремя О,1М фосфатными буферами с РН 6,0; 6,5 и 7,0, скорость десорбции 44 мп/ч. Сначала пропускают 50 мп буфера с рН 6,0, затем 50 мл с рН 6,5 и наконец 90 мл с рН 7,0. На выходе из колонки отбирают фракции элюата по 15 мл в которых определяют рН, концентрацию белка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и активность малатдегидрогеназы (спектрофотометрическим методом). Фракции с удельной активностью 1000 ед/мг белка и выше объединяют. Общкй белок 1,22 мг, общая активность 3080 еде удельная активность 2524 ед/мг белка.

П р и м е р 3, Митохондрии из головного мозга быка получают по методу Фонье и Шомодьи. Общий белок 4980 мг, общая активность

654024

28386 ед, удельная активность 5,7 ед/мг белка. Митохондрии суспендируют в 0,7 М сахарозе и центрифугируют в градиенте плотности 5 сахарозы (0,7:1,2:1,5 М) при

60000 g в течение 2 ч. Осадок представляет собой обогащенную митохондриальную фракцию, очищенную от миелина и синаптосом. Общий белок 10 723 мг, общая активность 7953 ед, удельная активность 11 ед/мг белка. Очищенные митохондрии суспендируют в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4 и разрушают в гомогеf5 низаторе типа Блендор при

13000 об./мин в течении 5 мин. Гомогенат центрифугируют при 150000 g в течение 60 мин для осаждения митохондриальных мембран, в дальнейшем работают с супернатантом. Общий белок 281 мг, общая активность 5901 ед, удельная активность 21 ед/мг белка. Доводят рН супернатанта до 6,1 0,1Н соляной кислотой и центрифугируют при 10000 g в течение 10 мин. Общий белок полученного супернанта 123 мг, общая активность 4059 ед, удельная активность 33 ед/мг белка. 30 . Супернатант пропускают через колонку, заполненную сорбентом Виокарб (внутренний диаметр колонки 1,7 см, объем сорбента 4 см) со скоростью 88 мл/ч. По окончаНИИ сорбции колонку промывают водой до исчезновения в промывных водах белка (контроль на белок осуществляют спектрофотометрическим методом по оптической плотности раствора 0 при длине волны 280 и 260 им).

Десорбцию проводят ступенчатым градиентом рН тремя О,Ш фосфатными буферами, с рН 6,2; 6,7;7,2. Скорость десорбции 44 мл/ч. Сначала 5 пропускают 50 мл буфера с рН 6,2, затем 50 мл с рК 6,7 и наконец 75 мл с рН 7,2, На выходе из колонки собирают фракции по 15 мл, в которых определяют рН, концентрацию бел0 ка (спектрофотометрическим методом и по методу Лоури) и малатдегидро- геназную активность (спектрофотомет-. рическим методом). Фракции с удельной активностью выше чем 1000 ед/мг 5 белка объединяют, их объем 60 мл. Общий белок 1,22 мг, общая активность 2908 ед.удельная активность 2384 ед/мг белка. 5 11654 Активность малатдегидpoгеназы определкют спектрофотометрическим ьктодом по изменению концентрации НАДН в 1 см кювете при длине волны 340 нм. Исследована реакция окис-s ления НАДН при рН среды 7,4. Заединицу активности принято количество фермента, необходимое для окисления 10 моль НАДН в 1 мин. Полученный препарат не содержит10 посторонних дегидрогеназных активностей (глютаматдегидрогеназной, лактатдегидрогеназной). Проведенный электрофоретический анализ пре2gпарата на гомогенность раствора показывает наличие в растворе двух белков, один из которых идентифицирован как малатдегидрогеназа. Продолжительность опыта с момента получениямозга до получения фермента 3-4 дня, собственно на очистку фермента необходимо 9-11 ч. Таким образом, предлагаемьй споеоб высоко надежен, прост в исполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов, позволяет получать фермент с удельной активностью 2400-2550 ед/мг белка.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МАЛАТДЕГВДРОГЕНАЗЫ ИЗ МИТОХОНДРИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА, включанхЕЩй вмделение митохондрий и очистку фермента с помощью ионообменной хроматографии, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и повышения чистоты фермента, очистку фермента проводят с помощью хроматографии на катионите Биокарб, при этом сорбцию проводят при рН 3,9-6,1, а проьывку и десорбцию - фосфатным буферньш раствором последовательно при рН 5,9-6,2; 6,3-6,7 и 6,8-7,2. (Л