Способ выделения и очистки урокиназы из биологических жидкостей Советский патент 1987 года по МПК C12N9/72 

113250762

Изобретение относится к способам 1 7 СТА/мл пропускают через колонку получения очищенных ферментов, а именно урокиназы, и может быть использоI12 см, заполненную силохромом Св течение 2 ч. Затем колонку отмыва 0,05 М трис-НС буфером, рН 8 (30м г После отмывки через колонку пропус ют 2%-ный раствор аммилка. На выход аммиака из колонки собирают фракцию объемом 4 мл, содержащую концентри рованную и очищенную урокиназу, ак

вано в медицинской промьппленности для получения препаратов урокинаэы.

Целью изобретения является повышение выхода и удельной активности целевого продукта.

Способ заключается в том, что адсорбцию урокиназы ведут на пористом кремнеземе или лигнине, а удаление балластных белков из сорбента осуществляют путем его отмывки трис-НС1 буфером рН 8,0-10,0.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

Биологическую жидкость, содержащую урокиназную активность,пропускают через колонку, заполненную пористым стеклом или лигнином. Объем колонки соответствует 0,1-0,01 объема пропускаемой жидкости. Затем колонку отмывают от примесей, пропуская трис-НС1 буферньм раствор, рН 10. Обычно пропускают 2-5 объемов колонки такого буфера. После отмьшки колонки адсор- бированн то урокиназу элюируют 2- 4%-ным водным раствором аммиака, пропуская его со скоростью около I см/мин.

Урокиназа элюируется узкой зоной, обычно в объеме, равном 0,5 объема колонки, вследствие чего происходит ее концентрирование в десятки раз. Выход очищенной и концентрированной урокиназы составляет 80-95%.

Пример 1. Выделение урокиназы из культуральной жидкости.

Культуральную жидкость, полученную после выращивания перевиваемой культуры клеток почек человека, объемом 5 л и активностью 30 СТА/мл пропускают через колонку 448 см, заполненную пористым стеклом МПС - 2000-ВГХ, в течение 12ч. Затем колонку отмывают 500 мл 0,1 М трис-НС1 буферного раствора, рН 10. Урокиназу элюируют из колонки после отмывки, используя в качестве элюента А%-ный

I12 см, заполненную силохромом С80, в течение 2 ч. Затем колонку отмывают 0,05 М трис-НС буфером, рН 8 (30мл). г После отмывки через колонку пропускают 2%-ный раствор аммилка. На выходе аммиака из колонки собирают фракцию объемом 4 мл, содержащую концентрированную и очищенную урокиназу, акW тивность фракции 950 СТА/мл. Выход урокинаты 90%. Удельная активность препарата 3300 СТА/мг.

П р и М е р 3. Выделение урокиназы из мочи.

15 Мочу человека, разбавленную пополам водой, объемом 2,5 л и активностью 9 СТА/МЛ пропускают через колонку 1,510 см, заполненную пористым стеклом МПС - 2000-ВГХ. Отмьшку ко20 лонки проводят 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 9. Элюцию урокиназы осуществляют раствором аммиака. Получают 7 мл очищенной и концентрированной урокиназы. Выход урокиназы 85%,

25 удельная активность 2600 СТА/мг.

П р и М е р 4. Выделение урокинаэы на лигнине.

Культуральную жидкость.,, полученную после выращивания перевиваемой

30 культуры почки человека, объемом 500 мл и активностью 17 СТА/мл пропускают через колонку, заполненную лигнином (выделенным из хвойных пород деревьев). Объем колонки 11 2 см.

35 Затем колонку отмывают 0,05 М трис- НС буфером, рН 10 (30 мл). После отмывки через колонку пропускают 4%-нь Й водный раствор а; 1миака. На выходе аммиака из колонки собирают

40 фракцию объемом 4 мл, содержащую концентрированную и очирденную урокиназу. Активность фракции 1250 СТА/мл, содержание белка 0,25 мг/мл. Выход урокиназы 80%, удельная активность

45 препарата 5000 СТА/мг.

П р и М е р 5. Выделение урокиназы проводят согласно примеру 4. Для отмывки колонки исцользуют 0,05 М водный раствор аммиака. Скорость элю- 50 трис-НС1 буфер, рН 8,0. Элюцию уроки- ции 6 мл/мин.. Концентрированная и назы проводят 2%-ньм водным раствором

очищенная урокиназа элюируется из колонки вместе с аммиаком в объеме 90 мл и имеет активность 1600 СТА/мл. Содержание белка в полученном препарате 0,4 мг/мл. Выход урокиназы 96%, удельная активность 4000 СТА/мг.

П р и М е р 2, Культуральную жидкость объемом 250 мл и активностью

1 7 СТА/мл пропускают через колонку

I12 см, заполненную силохромом С80, в течение 2 ч. Затем колонку отмывают 0,05 М трис-НС буфером, рН 8 (30мл). После отмывки через колонку пропускают 2%-ный раствор аммилка. На выходе аммиака из колонки собирают фракцию объемом 4 мл, содержащую концентрированную и очищенную урокиназу, активность фракции 950 СТА/мл. Выход урокинаты 90%. Удельная активность препарата 3300 СТА/мг.

П р и М е р 3. Выделение урокиназы из мочи.

Мочу человека, разбавленную пополам водой, объемом 2,5 л и активностью 9 СТА/МЛ пропускают через колонку 1,510 см, заполненную пористым стеклом МПС - 2000-ВГХ. Отмьшку колонки проводят 0,05 М трис-НС1 буфером, рН 9. Элюцию урокиназы осуществляют раствором аммиака. Получают 7 мл очищенной и концентрированной урокиназы. Выход урокиназы 85%,

удельная активность 2600 СТА/мг.

П р и М е р 4. Выделение урокинаэы на лигнине.

Культуральную жидкость.,, полученную после выращивания перевиваемой

культуры почки человека, объемом 500 мл и активностью 17 СТА/мл пропускают через колонку, заполненную лигнином (выделенным из хвойных пород деревьев). Объем колонки 11 2 см.

Затем колонку отмывают 0,05 М трис- НС буфером, рН 10 (30 мл). После отмывки через колонку пропускают 4%-нь Й водный раствор а; 1миака. На выходе аммиака из колонки собирают

фракцию объемом 4 мл, содержащую концентрированную и очирденную урокиназу. Активность фракции 1250 СТА/мл, содержание белка 0,25 мг/мл. Выход урокиназы 80%, удельная активность

препарата 5000 СТА/мг.

аммиака. Выход урокиназы 85%у удельная активность препарата 4500 СТА/мг. il р и М е р 6. Культуральную жид- 55 кость объемом 1 л и активностью 20 СТА/МЛ пропускают через колонку 1, см, заполненную макропористым стеклом МПС-2500-ВГ Х, в течение 4 ч. Затем колонку промывают 0,2 М трис3132

HCl буферным раствором, рН 10. Уро- киназу элюируют водным раствором аммиака. Концентрированная уроки- наза (объем 9 мл) имеет удельную активность 3080 СТА/мг. Выход урокина- зы 98%.

Пример. 16000 мл свежесобранной мочи человека активностью 13 СТА/МЛ пропускают через колонку

2,220 см, заполненную пористым стек-fО ке урокиназу, что не удается при ис- лом МПС 1,150-ЁГХ, в течение ночи. Отмывку от балластных белков проводят 0,1 М раствором трис-НС1 буфера, рН 10. Элюцию урокинаэы осуществляют 2%-ным водным раствором аммиака. По- f5 лучают 170 мл бесцеветного раствора концентрированной очищенной yi тккна- зы, удельная активность 3900 о ГЛ/мг , выход 96%.

Предлагаемый способ позволяет по- 20 лучать в одну стадию с выходом 80-98% препарат урокиназы с удельной активностью до 4500 СТА/мг. Для получения высокоочищенного препарата предусматривается проведение общепринятых xpo- -S матографических операций.

Сорбенты, используемые в предлагаемом способе, обеспечивают достаточно полный выход фермента. Ранее для получения урокиназы эти сорбенты 30 не использовались.

Предлагаемый способ обладает значительными преимуществами перед известными, прежде всего он прост в изготовлении, так как выделение и очи- 35 стка фермента происходит в один этап с использованием одного сорбента. Очистка обеспечивается отмывкой колонки экспериментально подобранным буферным раствором, после чего очу- 40 ществляется элюция фермента.

Установлено, что урокиназа достаточно прочно связывается с пористыми кремнеземами и лигнином. Вследствие этого, отмывку производят буферными 45 растворами с достаточно высоким рН, что обеспечивает удаление большинства примесных белков. Интервал рН буферных растворов, при которых удаляются примесные белки, но не происхо- 50 дит вымывание фермента, должен находиться в пределах 8-10. Отключение рН в одну или другую сторону не обеспечивает необходимые чистоту и выход препарата.

Влияние рН отмывающего буферного раствора на очистку урокиназы показано в таблице.

пользовании различных буферных растворов. Более высокий процент аммиака для десорбции не желателен, так как это не повышает выход фермента, а приводит лишь к повы1 1е П1ой растворимости матрицы сорбента.

Пред.пагаемый способ обладает тех- но.чогичпостью, так как легко осуществим при стерильных услорнлх т про- М1,шшенньсх масштабах. РСуль 1-у;1ал},иая жидкость и буферные растворы стерильно подаются в колонку, которую предварительно стерилизуют и герметизируют. Контроль за процессо:- осуществляют с помощью проточного спектрофотометра. Сорбенты используют многократно,они не содержат вредных примесей, их сорбционные св(йства восстанавливаются после прогтуск-чпия че- рет колонку 4%-ного растпора л. тмиа- ка.

Кроме того, пред.пагаемы -1 способом при использовании в алчестве сорСеп- та лигнина возможно получать npen-iiia- ты, обладающие высоко удельной активностью. Это связано с тем, что лигнин более специфически связывается с урокиназой по сравпегшю с пористым кремнеземом.

Предлагаемы способ в осп рои я водим в аналитическом и njieiu ipaTiiaHoM вариантах, он может прш енлтьси ф1я получения урокиназы в лабораториях и медицинской пром11Ш1Л(. Биологические показатели полученных препаратов (при использоваь ип зтог о способа) свидетельствуют о вотможнос- ти их использования для е;и1Ц1ПП,1,

Формула изобретения

Способ выделения и очистки урокиназы иэ биологических жидкостей, 55 предусматривающий адсорбцию фер;1е}1та на сорбенте, отмывку сорбента м зтпо- цию урокиназы 2-4%-ным раствором аммиака, о т л и ч а ю щ и и с я тем.

TaKiiM образом, при рИ отмтлвающего буфера Bbmie 10 наблюдается вымывание фермента, а при рН ниже 8 содержание примесного белка в препарате повышается .

Специфическим элюентом д.пя уроки- наэы является аммиак. Водным 2-4%-ным раствором аммиака удается полностью элюировать адсорбированную на колонке урокиназу, что не удается при ис-

пользовании различных буферных растворов. Более высокий процент аммиака для десорбции не желателен, так как это не повышает выход фермента, а приводит лишь к повы1 1е П1ой растворимости матрицы сорбента.

Пред.пагаемый способ обладает тех- но.чогичпостью, так как легко осуществим при стерильных услорнлх т про- М1,шшенньсх масштабах. РСуль 1-у;1ал},иая жидкость и буферные растворы стерильно подаются в колонку, которую предварительно стерилизуют и герметизируют. Контроль за процессо:- осуществляют с помощью проточного спектрофотометра. Сорбенты используют многократно,они не содержат вредных примесей, их сорбционные св(йства восстанавливаются после прогтуск-чпия че- рет колонку 4%-ного растпора л. тмиа- ка.

Кроме того, пред.пагаемы -1 способом при использовании в алчестве сорСеп- та лигнина возможно получать npen-iiia- ты, обладающие высоко удельной активностью. Это связано с тем, что лигнин более специфически связывается с урокиназой по сравпегшю с пористым кремнеземом.

Предлагаемы способ в осп рои я водим в аналитическом и njieiu ipaTiiaHoM вариантах, он может прш енлтьси ф1я получения урокиназы в лабораториях и медицинской пром11Ш1Л(. Биологические показатели полученных препаратов (при использоваь ип зтог о способа) свидетельствуют о вотможнос- ти их использования для е;и1Ц1ПП,1,

Формула изобретения

Способ выделения и очистки урокиназы иэ биологических жидкостей, предусматривающий адсорбцию фер;1е}1та на сорбенте, отмывку сорбента м зтпо- цию урокиназы 2-4%-ным раствором аммиака, о т л и ч а ю щ и и с я тем.

513250766

что, с целью повышения выхода и fhraKy сорбента с одновременным удале- удельной активности целевого продук- нием балластных белков осуществляют та, в качестве сорбента используют 0,05-0,2 М трис-НС1 буфером рН 8,0- пористый кремнезем или лигнин, а от- 10,0.

Содержание уро- кинаэы в отмывающем элюате (9%),% О

0,8 0,4

0,5

0,1 М трис-HCl.

15

22

0,3 0,3 0,3

0,2

0,2

Изобретение относится к способам получения очищенных ферментов, а именно урокиназы, и может быть использовано в медицинской промьпплен- ности для получения препаратов урокиназы. Целью изобретения является повышение выхода и удельной активности целевого продукта. Способ предусматривает использование в качестве сорбента при адсорбции фермента пористых кремнеземов или лигнина отмывки сорбента 0,05-0,2 М трис-НС1 буферным раствором рН 8-10 и элюцию фермента 2-4%-ным водным раствором аммиака. Культуральную жидкость, полученную после выращивания перевиваемой культуры клеток почек человека, объемом 5 л и активностью 30 СТА и 1 мл пропускают через колонку см, заполненную пористым стеклом МПС-2000-ВГХ в течение 12 ч. Затем колонку отмывают 500 мл 0,1 М трис-НС буферного раствора рН 10. Урокиназу элюируют из колонки после отмывки, используя в качестве элюента 4%-ный водный раствор аммиака. Скорость элюции 6 мл/мин. Концентрированная и очищенная уроки- наза элюируется из колонки вместе с аммиаком в объеме 90 мл и имеет активность 1600 СТА/МЛ. Содержание белка в полученном препарате 0,4 мг/мл. Выход урокиназы составляет 96%,удельная активность 4000 СТЛ/мг. I табл. С ел