Способ выделения дезоксирибонуклеиновой кислоты из дезоксирибонуклеопротеидов Советский патент 1988 года по МПК C07H21/04 

|л0ш

00 Nj

Од

хода и степени очистки мерных ( t-6 lO Дальтон)

Изобретение: относится к би -,,1М11И и биотехнологии и может быть исиоль- зопаио D лабораториях биохимического, биофизическо о, молеку- ляркоОиологического профиля и в про- MbiuiJiennoN производстве для получения с 1101-1ощью простеГиних операций и практически безотходно технологии высоко ПI с ты х препарате ц вы со к (5 полимер ной ДИК, наиболее приближенно к натив- ног-г/ состоянию.

Цель изобретения - иовьпление вывысокополи-концентри- ропанных (0,2 мг/мп} препаратов Д11К. Повышение вььчода и степени очистки обеспечивается в результате ис- пол1,зипания в качестве изб11)атель- Hoi o адсорбента для отделения белка от , li l и.пг.нокислотного ,к 11гч );т,ис- персного катионита. Катио чгг используется не о пиде детгротеинизиругоще- го ,П,ИГ1 агента, а ц виде адсорбента, конкурт1пу10 цего с ДИК за белки п процессе уменьшения солевой концентра- п,ии д, от депротетщизируюшсй ДИП до физиологической. Катионит, представляклдтп co6of спонталп о сс- дп ::тч:руюи(пе гранулы (15,5 19,5 ) , осаждается вместе со ciui- n. i белк1эн, а препарат ДИК остается в надосадке в виде pac i Bopa. ,епие катионита ус. сорить центрифугированием смеси после диализа.

Пример 1 . 20 1- свежезамороженно: ткани тимуса теле1 ка измель- nair/i и диспергируют в 300 м.п стандартного раствора (0,075 М NaCl + + 0, М Na. ЭДТА, рИ 8,0) с помощ ножевого гомогенизатора при 12(ПО об/мип в течение 2 мин. Г омо генат фи:гътру1от через 4 слоя марли и п,ептрифугир::)Пот 10 мип при 2000 g. Надосадок удаляют, а осадок вновь дпспсргпругат в 300 мл стан11,артпого раствора в гомогепизаторе при 8000 об/Mtni в течение 20 с и вновь оса;кда1от при том же режиме центрифугирования. Последняя операция отмывки осаждающегося хроматина от рибо- нуклеопротеидов повторяется 6 раз. Весь процесс выделения ДИП проводят при . После последней отмывки полученный ДНП диспергируют в 0,15 М NaCl + 0,7 мМ Na-фосфатном буфере (рП 7,0). Дисперсия разбавляется до состояпия, когда она содержит коп0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

центра ада ДИК, вдвое превышающую необходимую исследователю концентрацию препарата. Последняя в нашем случае составляла 0,2 мг/мл. К дисперсии приливают равньш объем раствора 4 М NaCl на фосфатном буфере и полу- че1ишй раствор (С. 0,2

мг/мл)

i Q,

инкубируют не менее 3 ч при 4 С. Катионит yVminex А6, BRL-CUIA (15 смМ диспергируют в 30 мл 2 М NaCl и через 30 мин центрифугируют при 1500 g в течение 1 мин. Надосадок сливают и добавляют двойной объем (30 мл) полученного ранее раствора ДНП в 2М NaCl. Катионит тщательно перемешивают с раствором до однородной консистенции и помещают в воронку, широкий конец которой закрыт целлофаном, закрепленным резиновым кольцом в цилиндрической части воронки. В воронку помещают Г-образную стеклянную палочку, вращаемую в смеси электромотором со скоростью 10 об/мин для предотвращения оседания гранул катионита. Е1иж 1пп конец воронки погружают в сосуд с фпзиологическим раствором (0,15 М МаСП + 0,7 мМ Na-фосфатный буфер, рИ 7,0, объем 1 л), перемешиваемым с помощью магнитной мешалки. Диализ проводят 12 ч при 4 С. Затем смесь из поро1ПчИ центрифугируют при 1500g

1мин. Надосадок представляет собой препарат ДИК в виде раствора с концентрацией ДИК 0,2 мг/мл п среде с физиологической ионной силой. Растворитель можно выбрать с меньшей ионнотг силой, что не сказывается на качестве препарата ДНК.

Пример 2. Операции выделения ДНК из ткани тимуса теленка соответствуют примеру 1. Препарат ДНК, вьцтеленный в физиологической среде (0,15 М NaCl), переводят в2М NaCl добавлением равного объема раствора 4 М NaCl. 16 мл ДНП в 2 М NaCl при Сции мг/мл инкубируют в течение 3 ч при 4°С для растворения препарата, Катионит Ostion ЬрА1(16мл) диспергируют в 32 мл 2 М Nad и через 30 мин центрифугируют при 1500 g в течение 1 мин. Надосадок сливают и добавляют 16 мл раствора ДНП в

2М NaCl. Объемное отношение в смеси катионит/ДНК 1. Смесь тщательно перемешивают, а затем проводят удаление соли диализом. Диализ ведут против 1 л раствора О,15 М NaCl +

+ 0,7 мМ Na-фосфатный буфер (рН 7,0)

либо против 0,7 мМ Na-фосфатного буфера (рН 7,0) в течение 16 ч при 4°С Смесь центрифугируют 30 с при 2700 g. Надосадок представляет собой раствор ДНК в физиологическом растворе. Характеристика полученного препарата ДНК: белок/ДНК i 0,01, ,2 мг/мл выход ДНК из ДНП составил 88%. Молекулярная масса препаратов ДНК, полученных на данном катионите, находится в диапазоне А-6-10 Дальтон.

Предлагаемый способ позволяет получить препараты ДНК с массой, определенной методом вискозиметрии, 4-610 Дальтон, с содержанием белка менее 1% при Сдц 0,2 мг/мл. Выход ДНК из препаратов ДНП состапляет

88-94%.

Формула изобретения

Способ выделения дезоксирибонук- леиновой кислоты из дезоксирибонук- леопротеидов с помощью солевой де- протеинизации, отличающий- с я тем, что, с целью повышения выхода и степени очистки высокополимерных концентрированных препаратов ДНК, удаление белков из раствора про- водяд путем сорбции их на высокодиг- персных сильнокислотных катионитах, понижая ионную силу раствора с помощью диализа, при этом ДНК остается в растворе.

Изобретение относится к области биохимии в биотехнологии и позволяет получать с помощью солевой депротеинизации без воздействия потенциально денатурирующих агентов в виде детергентов и органических растворителей высокополимерные концентрированные препараты ДНК (4-6-10 Дальтон, 0,2 мг/мл) с высоким выходом (94%) и содержанием белка менее 1%. Цель изобретения состоит в повышении выхода и степени очистки высокополимерных концентрированных препаратов ДНК. Изобретение заключается в удалении белков из раствора ДНП, депро- теинизированного солью, путем связывания белков высокодисперсными сильнокислыми катионитами при постепенном понижении ионной силы раствора с помощью диализа. 1C