Способ определения т-лимфоцитов Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 G01N33/16 

(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Т-ЛИМФОЦИТОВ

Изобретение относится к области иммунологии.

Известен способ определения Т-лимфоцитов путем центрифугирования крови с последующим отделением мононуклеарных клеток, инкубирования их с эритроцитами барана в среде Хенкса, отделением полученного осадка, ресуспендирования его и подсчета Т-лимфоцитов fl.

Однако известный способ не позволяет точно определить Т-лимфоциты.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Цель достигается тем, что инкубирование проводят в среде Хенкса, дополнительно содержащей хлорид цинка в концентрации 1 105 - 3- 105 г/мл среды при 8 - 22°С.

Пример 1. Выявление Т-лимфоцитов крови у людей. Лимфоциты выделяют из венозной крови. Гепаринизированную (10 ед/мл) кровь (5 мл) разбавляют раствором Хенкса (без Са и Mg - для предотвращения эффекта слипания клеток) в соотнощении 3:2. Затем 8,3 мл разбавленной крови осторожно наслаивают в центрифужных стаканах (емкостью 25 мл) над 7 мл раствора,

состояп его из 5,2% фиколла 400 и 60% верографина плотностью 1,077. Центрифугирование проводят в центрифуге К-23 на роторе-крестовине при 900 g в течение 70 мин при 18°С. Мононуклеарные клетки (96% лимфоцитов), находившихся на границе плазмы крови и фиколла-верографина, отсасывают пастеровской пипеткой, дважды промывают раствором Хенкса (без Са и Mg) по 20 мл и дважды центрифугируют при 200 g в течение 10 мин. Полученный осадок клеток ресуспендируют в растворе Хенкса (с Са и Mg ) с добавлением к нему ZnCIj в конечной концентрации 1 10 г/мл (0,001%). Жизнеспособность клеток составляет 98 - 100%. Определяют концентрацию клеток и доводят ее до 2- 10 на I мл.

Далее в силиконизированные центрифужные пробирки, содержащие по 1 мл суспензии лимфоцитов (2- 10 клеток/мл), добавляют по 0,1 мл дважды отмытых раствором Хенкса эритроцитов барана (хранившихся не более 10 дней в растворе Альверсера при 4°С) в концентрации 10 на 1 мл. В некоторые добавляют еще абсорбированную сыворотку эмбрионального теленка. Инкубационную суспензию клеток перемешивают, центрифугируют при lOOg в течение. 10 мин и оставляют на 8 -20ч при 8 - 22°С. После инкубирования надосадочную жидкость отсасывают, осадок клеток рёсуспёндируют путём остброжногб вращения ( об/с) рукой пробирок с наклоном 30 - 45°. Суспензию клеток вводят в камеру Горяева или н аносят на объективные стекла пастеровской пипеткой. Мазки делают общеизвестным способом, фиксируют абсолютным метанолом и окрашивают по Романовскому-Гимзе.

Процент розеткообразуюших лимфоцитов определяют просматривая по 200 лимфоцитов. Розеткой считают лимфоцит с прикрепившимися X нему не менее трех эритроцитов барана.

В табл. 1 приведены средние арифметические измерения, стандартные отклонения или нижний и верхний пределы измерений.

Таким образом, при инкубировании клеток в Среде Хенкса с хлоридом цинка колиtjfecTBO выявленных розеток наиболее высокое ив 1,4 - 1,8 раза превышает их число при инкубировании клеток в среде Хенкса, яе содержащем хлорида цинка.

Среда Хенкса Среда Хенкса с

;.,2-п.с

Среда Хенкса С:.;;::;:ZnC s. и 50% сы- . воротки

Среда Хенкса и.

57,,5 50% сыворотки

Пример2. Выявление Т-лимфоцитов в крови у крупного рогатого скота. Все операции Выявления розеток у крупногорогатого скота идентичны методике определения розеток у людей за исключением того, что слой мононуклеарных клеток образовался на границе слоев плазмы крови и смеси из фиколла 400-верографина, плотность которого была 1,069 при центрифугировании 1000 g в течение 80 мин.

В табл. 2 приведена характеристика розеткообразующих лимфоцитов в крови крупного рогатого скота.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что введение в инкубируемую суспензию клеток 1-10 - 3- 10 г/мл (а для лимфоцитов крупного рогатого скота еще и 50% сыворотки) позволяет получить наибольшее количество сохранных розеток как в камере Горяева, так и на мазках, а число прилипших эритроцитов к розеткообразующим лимфоцитам зйачительно увеличено.

Предлагаемый способ позволяет с высокой точностью определить Т-лимфоциты как у людей, так и у крупного рогатого скота.

Таблица 1

5(3-10)

4(3-10) 9(3-17) 10(3-18)

11(3-18)

10(3-19)

46,Ot5,5

6(3-11)

5(3-12)

Формула изобретения

Способ определения Т-лимфоцитов путём центрифугирования крови с последующим отделением мононуклеарных клеток, инкубирования их с эритроцитами барана в среде Хенкса, отделением полученного осадка, ресуспендирования его и подсчета Т-лимфоТаблица

цитов, отличающийся тем, что, с целью поJP вышения точности способа, инкубирование проводят в среде Хенкса, дополнительно содержащей хлорид цинка в концентрации 1 10 - 3- 105 г/мл среды при 8 - 22°С.

Источники информации, принятые во внимание приЭкспертизе 35 I. Neurology 1976, 26, 10. с. 997 - 999