Способ получения комплекса ЕАС 1,4,2 для количественного определения функциональной активности с 3 фракции комплемента Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

;о

INS vl

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунохимии.

Известен способ получения комплекса ЕАС 1,4, 2 при помощи обработки неразведенной сывороткой морской свинки сенсибилизированных эритроцитов барана в специально подобранных условиях температурного режима Cl 3Однако известный способ недостаточно чувствителен к сЗ.

Известен также способ получения комплекса, включающий последовательное присоединение к ЕА очищенных фракций комплемента С1, с4иС2, причем присоединение с2 осуществляют в буфере, содержащем 0,00015МСа и 0,0005М специально подобраных условиях темпера турного режима 2 ).

Однако известный способ трудоемок, а полученный комплекс недостаточно стабилен и чувствителен к С

Целью изобретения является упрощение способа и повышение стабильности и чувствительности комплекса ЕАС 1,4,2.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу, включающему последовательное присоединение к ЕА комплексу очищенных фракций комлемента Cl, с4 и с2 , присоединение с2 фракции комплемента осуществляют с помощью третьего реагента R-, окисленного йодом.

Пример 1. Приготовление Rj и его окисление в oxyRjrIO мл смешанной сыворотки (от 15-20 человек) ресуспензируют осадок зимозана, полученный из 5 мл исходной взвеси. Полученную смесь помещают в водяную баню

О

при 37 с на 1 ч с помешиванием через 10 мин. После прогревания, смесь центрифугируют. Центрифугат Rg.

Окисление R производят смешиванием с равным объемом оптимально ,разве денного стандартного раствора йода (предварительно испытывают разведение раствора иода 1/5, 1/7, 1/10, 1/12 в 0,09 М растворе фосфатного буфера, рН 6,0) в течение 5 мин при комнатной температуре. Rj обработанный иодом, диализуют при 4°С в чение ночи против 10 л вероналового буфера, с рН 7,2-7,4. Диализат - oxyR.

Пример2. КЗмл охлажденной гемосистемы (ЕА) добавляют 0,25 мл цельного oxyRj, и выдерживают 15 мин

при 4°С, после чего комплекс ЕАС 1,4,2оху образован и может быт применен в микро- или макроварианте способа определения сЗ.

Постановка макрометода определения сЗ-фракции.

Обычным методом готовится 1%-ая гемосистема (ЕА), к которой добавляется oxyRo в количестве 5 мл реагета на 100 мл гемосистемы. Полученную смесь вьщерживают 15 мин при 4°С в результате чего образовывался комплекс ЕАС 1,4,2

Испытуемую сыворотку прогревают при 52С в течение 30 мин.

Основной опыт ставят по схеме приведенной в табл.1.

Пробирки вьщерживаются в термоста при 37°С 1 ч, после чего производится определение активности сЗ по 100%-ному гемолизу в соответствии со второй схемой приведенной в табл.2.

Постановка микрометодом. К 5 мл охлажденной 2%-ной гемосистемы (ЕА) добавляют 0,25 мл цельного окисленного иодом реагента (oxyR,), вьщерживают 15 мин при 4°С для образования комплекса ЕАС 1,4,2 , после чего смесь подогревается до +45°С и смешивается с равным объемом охлажденной до 45°С 2%-ной агарозы.

Полученную смесь тщательно перемешивают и заливаю.т в камеру, приготовленную из двух фотопластин с П-образной прокладкой между ними толщиной 0,1 см, зафиксированной прищепками.

После застывания геля верхняя пластина и прокладка снимается и в геле пробойником делают микролунки диаметром 0,2 см на расстоянии 1 см. Б ряд лунок вносят гретую сыворотку в различных разведениях: цельная 1:20, 1:30, 1:40, 1:50,. 1:60, 1:70, 1:80, 1:90, 1:100. В остальные лунки вносят опытные пробы гретой неразведенной сыворотки.

Пластинку с Иробами ставят во влажную камеру при 37°С на 3 ч.

По истечении времени определяют титр контрольной сыворотки (проба, где еще наблюдается заметный гемолиз) и измеряют диаметры опытньтх проб. Гемолитическая активность контрольной сыворотки равна обратной величине титра в гемолитичес.ких единицах на миллиметр (гем.ед.мл). Активность опытной пробы опреде ляется по формуле ..JLO где с - активность СЗ в опытной пробе} с - активность С 3 в контроле;Д - диаметр кольца лизиса в опыте, Д - диаметр кольца лизиса в контроле. Введение в способ определения С фракции комплемента оксиленного тре тьего реагента OXY R и обработки исследуемого материала при 52°С в чение 30 мин позволяет значительно улучшить метод определения С 3-фрак ции комплемента. Это выражается уве личением чувствительности (в 2030 раз), его специфичности, в его техническом упрощении. В результате возможна постановка высокочувствительного метода определения важного лабораторного показателя (СЗ). Для доказательства повьшения ста бильности и чувствительности к СЗ комплекса ЕАС 1,4,2 по сравнени с комплексом ЕАС 1,4,2 прототипа проводят следующие эксперименты. Прогретую исследуемую сыворотку разводят 1:20, 1:30, 1:40, 1:80, 1:90, 1:100, 1:110. К разведениям исследуемой сыворотки добавляют соответственно комплекс ЕАС 1,4,2 и полученный данным способом ВАС1,4, в рабочей дозе (1% взвести,комплекса в объеме 1 мл к 0,5 мл разведенной сыворотки). Чере 1 ч инкубации при З7с производят учет результата по 100%-ному гемолизу. Титр исследуемой сыворотки при работе с комплексом ЕАС1,4,2 1:30, предлагаемый - 1:100. Это они детельствует о большей чувствительности предлагаемого комплекса ЕАС 1,4,2 присоединять находящи ся в исследуемой сыворотке С 3. Это соответственно повышает в конечном итоге разрешающую способность метод определения СЗ,. Пригото..гтечные комплексы ЕАС 1,4 и ЕАС 1,4,2 ыдерживают при , , 40°С 15 мин, 30 мин 1 ч, 2,5, Затем комплексы вносят по 1 мл в пр бирки с прогретой исследуемой сывороткой, взятой в рабочей дозе (ахтивность СЗ, способная гемолизировать весь введенный комплекс) и смесь инкубируют при З7с в течение 1 ч. Полученные результаты показывают следующее: комплекс ЕАСг,4,2 при его хранении при уже через 2 ч начинает распадаться, о чем свидетельствует неполное его разрушение в реакции с добавлением СЗ (на дне после центрифугирования, реакционной смеси после инкубации остается небольшой осадок неразрущенньгх эритроцитов) . При хранении данного комплекса при его заметное разрушение начинается через 60 мин, при 40 С - через 15 мин. В то же время комплекс ЕАС1,4,2 хорошо сохраняется при О С и после 10 ч инкубации выявляется незначительная потеря его активности. Признаки снижения активности комплекса ЕАС 1,4, хранении при появляются только через 5ч, при 40с - через 2 ч. Таким образом комплекс ЕАС 1,4,2Ъолее стабилен по сравнению с ЕАС 1,4,2 прототипа. Данный способ получения комплекса ЕАС1,4,2 при помощи (R.J) имеет преимущества перед известными, так как получение ЕАС 1,4,2 первыми двумя известными способами при помощи неразведенной сыворотки (имеются все компоненты, в т.ч. и сЗ) требуют соблюдения строгих режимных условий блокировки присоединения С 3 к ЕАС 1,4,2 температурой или формальдегидом, что усложняет выполнение метода. Для последующей работы с комплексом необходима дополнительная стадия отмывки полученного комплекса от С 3, что требует дополнительной затраты времени и не безразлично для сохранения функционально активного ЕАС 1,4,2 принимая во внимание его лабильность. Эти недостатки нивелируются при применении третьего реагента, который получается несложным способом и. -длительно может сохраняться. Получение комплекса ЕАС 1,4,2 становится упрощенным и представляет собой простое смешивание оптимальных количеств гемосистемы (ЕА) и Rj за 15 мин до опыта. Использование R для получения комплекса ЕАС 1,4,2 значительно упрощает способ. Окисление иодом с2 и введеНИ& в состав комплекса позволя- Способ может быть использован имет более стабильный и более чувстви-мунологами, патфизиологами, аллерголотельньй к СЗ (в 20-30 раз) комплексгами, онкологами при определении

EAcl 4 2®.функциональной активности СЗ.

1097277j

5Таблица

Гретая сыворотка 0,1 0;i5 0,2 иепытуемая 1:40 Вероналоаый бу0,4 0,35 0,3 фер Пилл«мера 1%-ная вэвесь к-омплекйй ЕА Cl,f,2° 1,0 1,0 . 1,0

Примечание: (+) - есть гемолиз, (-) - нет гемолиза 0,25 0,3 0,35 0,4 0,25 0,2 0,15 0,1 0,5 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0