Способ определения активности комплемента Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 G01N33/53 

Изобретение относится к области биологии и может быть использовано для изучения комплемента в эксперименте и в клинике, особенно при необходимости многократных исследований и в тех случаях, когда взятие крови затруднено маленькими размерами подопытных животных или тяжелым- состоянием больных.

Целью изобретения является повыше ние чувствительности метода и его упрощение за счет сокращения числа ста- .дий.

Пример 1. Делают забор крови в капилляр.

Крови для исследования достаточно 1 капли.

Центрифугированием отделяют сыворотку. В качестве разводящей жидкости применяют веронал-мединаловый буфер или физраствор (рН 7,2-7,4).

Эритроциты барана трижды отмывают физраствором, центрифугируют при 1000 об/мин. Готовят взвесь 4-10 эритроцитов в 1 мкл физиологического раствора. К приготовленной взвеси в равном объеме приливают разведенную в тройном титре гемолитическую кроПоказатели

М2| 3 Г4|5| 6-|7|8|9llo|ll

Количество эритроцитов в 5 квадратах

Активность комплемента, л.е.

62 21 131 72 139 86 135 39 151 61 199

68 90 34 64 30 56 32 80 23 69 П р и м е р 2. Берут 400 мг гемо- гената селезенки мьши, добавляют 1,2 мл физиологического раствора.

Далее способ осздцествляют аналогично примеру 1.

Получают в контроле - 202 эритроцита в 5 больших квадратах; в опыте- 170 эритроцитов, 20 лимфоцитов.

Комплементарная активность равна 15,8 л.е.

Процент примеси в данном случае достаточно высок (9%) что, несомненно, повлияло бы на результат при фотокалориметрическом и визуальном учете.

личью сыворотку.-Полученную гемосис- тему инкубируют 10 мин при 37 С.

В опытные пробирки вносят по 0,2 мл физраствора и гемосистемы и автопипеткой - 2 мкл испытуемой сыворотки. В контрольную пробирку вносят те же ингредиенты, но вместо сыворотки - 2 мкл физраствора. Инкубация 30 мин при 37°С, Пипетируют содержимое про- 10 бирок, отбирают 0,1 мл реакционной взвеси, соединяют с 0,9 мл физрас-Г- вора (разводят в 10 раз) и нелизиро- ванные эритроциты считают в камере Горяева; в 5 больших квадратах (уве- 15 личение 10x10) проводят опытные и контрольные пробы.

Для вычисления результата пользуются формулой

20

X X 100,

где X - комплементарная активность; а - количество сосчитанных эритроцитов опытной пробы; в - количество со25 считанных эритроцитов контрольной пробы. Результат выражают в литичес - ких единицах (л.е.).

Результаты определения комплементарной активности сыворотки 10 крыс

JQ представлены.в таблице.

Проба

45 В том случае, если биологическая жидкость обладает крайне слабой или высокой активностью комплемента, следует увеличить или уменьшить ее количество в опыте и в последующем ис50 пользовать подобранное для данного материала соотношение. Например, при низкой активности, не определяющейся в 2 мкл сыворотки, берут 3 мкл, а при необходимости и больше, до получения

fr положительных результатов. Напротив, при высокой активности можно уменьшить количество исследуемой сыворотки до предельного (1 мкл), в последующем прибегая к разведениям.

312981

Формула изобретения

Способ определения активности комплемента, включающий разведение гемолитической сыворотки в тройном титре, добавление к ней взвеси эритроцитов барана с последующим инкубированием полученной смеси с испытуемым биологическим препаратом и физиологическим раствором и учетом результатов, fO отличающийся тем, что, 944

с целью повышения чувствительности способа ч его упрощения за счет сокращения числа стадий, взвесь эритроцитов барана берут в количестве 4-10 в 1 мкл физиологического раствора, а гемолитическую сыворотку, физиологический раствор и взвесь эритроцитов берут при их соотношении 1:100:100 соответственно, а учет результатов проводят путем подсчета количества лизированных эритроцитов.

Изобретение относится к биологии, предназначено для изучения комплемента в эксперименте ив клинике при необходимости многократных исследований и в тех случаях когда забор крови труден из-за малых размеров подопытных животных или из-за тяжелого состояния больных. Цель изобретения - повышение чувствительности метода и упрощение путем сокращения числа стадий. Для этого эритроциты барана 3 раза отмывают физраствором- центрифугируют при 1000 об/мин. Готовят взвесь 4-10 эритроцитов в 1 мкл физиологического раствора, в равном объеме приливают разведенную в тройном титре гемолитическую кро- молью сыворотку. Полученную гемосис- тему инкубируют 10 мин при . В опытные пробирки вносят по 6,2 мл физраствора и гемосистемы и испытуемую сыворотку - 2 мкл. В контрольную пробирку вносят те же ингредиенты, но вместо сыворотки - 2 мкл физраствора. Инкубация 30 мин при пипе- тируют содержимое пробирок, отбирают 0,1 мл реакционной взвеси соединяют с 0,9 мл физраствора разводят в 10 раз) и нелизироваиные эритроциты считают в камере Гореева опытные и контрольные пробы. Расчет по формуле х(в-а):в-100, где х - комплементарная активность, а - количество сосчитанных эритроцитов опытной пробы, в - количество сосчитанных эритроцитов контрольной пробы. Результат дается в литических единицах. 1 табл, г (Л