Способ культивирования гибридом Советский патент 1984 года по МПК C12N15/00 

(Л

с:

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ П1БIРВДОМ на питательной среде с добавлением сыворотки животных, отличающийся тем, что, с целью увеличения продолжительности продуктивного периода синтеза антител, в качестве сыворотки животных используют свиную сыворотку.

789 Фиг.1

О СО 4 ОО

vj

to f5 21

ЦО Изобретение относится к иммуноло гии и касается способа культигзирова иия 1п vitro гибридом (искусственно созданных гибрнцаьк клеток, продуцируюгцих моноклоиальные антитела) и может найти пр.иг 1енение в медищ-гне, ветеринарии, вирусологии, онкологии биохимии, биотехнологии для пол ™ения определенно заданных мсноклонал ных антител, которые используются например, для ранней диагностики рак и других заболеваний как человека, так и животных; для. высокоэффективной очисткч и получения биологически активных белков (например, интер ферона); для хи;-гао- и иммунотерапии В 1975 г создан:. соматические гибриды клеток млекопитающих (гибридомы), Которые продупировали чистые или моноклональные антитела. Препараты моноклональных антител получают либо из ггсцитной Ж1адкости при культивировании гибридом in vivo либо из культурал1)Ной жидкости (клеточный супернатант) при культивирова нии гибридом in vitro. Для этого отбирают те гибридомы, которые обладают нар большей стабильностью и высокой продуктивность о. Под стабильностью подразумевается длительное сохранение способности к образованию антител (т.е. .антителопродуцирующей способности) при непрерывном культивировании. Продуктивность - это способность клеток клона производить определенное количество антител. Ста бильные клоны с разной продуктивностью удается на раннем эт пе выделения гибридом, но значитель ная часть клонов (может быть 2-3) обычно теряет способность к синтезу антител через 3-10 недель непрерывно го культивировании. При этом утрата основного признака гге зависит от спо соба культивирования in vivo (асцитная форма) или in vitro. Это является одним из основных факторов., препятствующих промыишенному получению моноклональны: антител. Нужно oTi eтить, что межвидовые гибридомы (мышь х. человек, крыса х человек и т.д.) являются всегда нестабильными дак как происходит быстрая злиминация хромосом человека. Поэтому увеличение продолжительности продуктивного периода синтеза антител такими гибри домами хотя бы на несколько неделЬ} является болькшм успехом. 72 Известен способ культивирования гибридом на питательной среде ДНЕМ (питательная среда Игла, модифициронаиная Дальбекко) с добавлением эмбриональной сыворотки коров Cl J Недостаток этого способа заключается, в TDM. что при lienpepbiBHOM культивировании гибридом в такой питательной среде они теряют свою исходную антителопродупирующую способность (стабильность) через 310 недель культивирования (в зависимости от свойств гибридомы). Другой недостаток этого способа состоиг в необходимости добавлять в питательную среду эмбриональную сыворотку коров, которая является весьма дорогостоящим и дефицитным компонентом питательной среды. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ культивирования гибридом на питательной среде Дг-IIi.M с добавлением эмбриональной сыворотки коров и человеческих Э;1дотелиалы1ых клеток или их клеточного суперната1 та (HECS) . Добавление в питательную среду для гибридом че.ловеческих эндотелиальных клеток или их члеточного супернатанта позволяет увеличить период способности продуцировать антитела при непрерывном культивировании гибридом на 34 недели (так, клон гибридомы, полученной после слияния человеческих лимфоцитов и Sn 2/0 - Ag 14 миеломными клетками мышей, сохранял способность продуцировать антитела при непрерывном культивировании его в питательной среде, содержащей человеческие эндоте-гшальные клетки в течение 10 недель, в то время, как тот же клон, культивируемьш без такой добавки, сохранял способность продуи;иро1зать антитела только в течение 7 недель) L23. Недостаток известного способа состоит в том, что гибридомы сохраняют свою стабильность не более 12 недель. Кроме того, для его осуществления необходимы (кроме дефицитной эмбриональной сыворотки коров) эндотелиальные человеческие клетки, которые получают из пупочного канатика (вены) эмбриона человека,. Это очень осложняет и удорожает осуществление способа и ограничивает его применение при крупномасштабном культивировании. 3 Целью изобретения является уветиченне продолжительности продуктивного периода синтеза антител гибтидомами, путем создания селективного преимущества для антителопродуцирующих клеток Поставленная цель достигается тем, что согласно способу культивирования гибридом на питательной сред с добавлением сыворотки животных в качестве сыворотки животных исполь .зуют свиную сыворотку. Нестабильность гибридом, т.е. потеря ими способности производить антитела, связана с обиюй тенденцией клеточных гибридов потерь хромосом в процессе их культивирования. Так, для гибридомы мьпиь X мышь утрата клеткой хотя бы одной хромосомы из трех, в которых находятся все гены иммуноглобулинов у мьрлей, ведет к этой клеткой признакгг антителообразования, а затем в процессе дальнейшего культивирования весь клон теряет этот признак, поскольку для многих клонов гибридом селектив ное преимущество имеют клетки, утра тившие способность образования анти тел. Таким образом, повысить стабил ность гибридом можно лишь созданием условий, в которых бы селективное преимущество имели антителопродуцируюш 1е клетки. Взято 3 клона гибридом (мышь X мышь), полученных известным способом, которые культивировали в среде даШМ с добавлением 5%-ной свиной сыворотки и параллель но в этой же среде, но с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки коров.. Концентрации сывороток выбраны с таким расчетом, чтобы не было различий в скорости пролиферации и в конечном урожае клеток в 1 мл. Периодически проводили тестирование клеточных супернатантов для опр деления антителопродуцирующей спосо ности клонов. Результаты этого продоллштельного опыта (9 мес) показал что: а) клоны гибридом различаются исходно по своей стабильности и про дуктивности; б) из трех клонов два клона потеряли антителопродуьщрующу способность через 4-9 недель культи вирования в .среде с эмбриональной сывороткой коров; один из них при культивировании .в среде со соиной сывороткой сохранял исходную актив™ кость в течение всего опыта (т.е. 9 мес), активность второго (Н14)о 7 не.тель кульпшироззния no;i растала на З-Л порядка и оставалась ; высоко -; yponiie л.о конца опыта; в) третий клоп оказался исходно в ы с о к о с т а б ил ь н ым и вые о к о а к т и. в i ым и оставался такиь при культивировании с использованием обеих сывороток; г) возросшая активность гибридом.ы Н14 бьша высокостабт1льной и соxpaHHjiacb в да,Г;Ь ейшем при куггьтивм-роваш-ги в среде с добавлением как сви1ой, так и эмбриональной сыворотки. TaKHN образом, сврпая сыворотка создает селект11вные преимущества для антптелопродуцируопп-ix клеток, П р и м е р 1 . Культиитп сЕппис гибрпдомы НЯ12.2I,9. Пля культтпзировалп я исип Т;яовали клетки Пбридомы 11,112.21.9, полученной путег- слияния клеток селезенки мышей линии ВАР В/С, иммунр зированпых фагом л, с .1:гломными мыц11П1Ыми клетками Sp 2/0 - Ар,/14 и последуюего отбора гибридного клона, обладающего способпостью продуцировать антитела в фагу Д, Титр антител в суперпатанти: (т.е. антителопродуцирую1иую способность гибpидo iы) определяли известным способом. Исходная антитслопродуцирующая способность гибpидo iы 12.21.9 выралсена в og % инактивировапного фага Л и 2,0 (фиг. 1, точка 2 на оси у), это означает, что при добавлении определенного количества супернатанта (0.3 iл) к oпpeдeлe Iпo y количеству фаговых частиц (250 частиц) инактивмруется 100% 4S; 3biA часСуспензию исходных клеток гибридо:.;ы Н/1 12.21.9 разделили на две части. К.четки каждоГг по)Ц1П1 отмыли центрифугированием (5 мин, 1000 об/мин) в бессывороточ ой среде ДМЕМ (среда ДМЕМ - известная среда Hroia, модифицированная Дальбекко). Первую порцию клеток (510 кл) поместили во флакон КаррелЯ(с1 60 мм), содержащий 10 мл среды ДМЕМ с добавлением 5%-ной свиной сыворотки, использовали свиную сыворотку, пол ггенную от животных в возрасте 8 мес, стерилизованную фильтрованием (фильтр №шлипор 0,22 м) и инактивировапную нагреванием до 56°С в течение 30 мин. Свиную сыворотку добавляли в концентрации 5%, обеспечиваюа ей такую же скорость пролиферации и конечньй урожай клеток в 1 tln, г-сакую обесиечгтваузт 10. л я концентрация эмбрггона.пышй сыворотки коров (обычно применяемая при культивировании гибридом) и культм-вировали при обьпипзК условиях {±37°С5 содержание:- СО в атмосфер-ном воздухе от 5 до 10%) до образования монослоя (через 2-3 сут культивирования j пересевали i3 такой же нропорции, В процессе иепрерывгого ку.гп тивиро-вания гибридомного клона еженеде. проверяли его антителопродуцирую щую способность, которая представлена на фиг, 1, кривая 1, Каре видно из этой кривой, культгп ирование гиб ридомы НЛ 1 2 ,, 2 1 . 9 па питательной среде с добавлеиргем свиной сыворот ки позволяет сохранить ее исходную антителопродуцирующ5.о способность на протяжении (по крайней мере) 40 недель непрерывного культивировани Для сравнения вторую порцию клеток (5-10 кл) г Мб РИД омы И/1 12.2К9 выращивали параллельно на тг1кой же питательной среде ДМЕМ с добавление 10%--ной эмбриональной сыворотки коров, в таких же условияхи с такой же еженедельной проверкой антителопродуцирующей способности непрерывн культивируемого клона Результаты-, определения а}-.тителопродуцирующей способности гибридомы- Н /Т 12 о 21. 9 при ее непрерывном к льтивировании на питательной среде с добавлением эмбрион 1льной сыворотки короз представлены на фиг. 1, кривая 2, Как видно из этой кривой, ку.1тьтивирова- ние гибридомы по известному способу позволяет сохранить ее исходную антител опр одуцирующую способность тол ко в течение 3 недель. Уже через 7 недель такого культивирования антител опр одущфующая способность уменьимлась в 10 раз (точка 1 па оси у), т.е. активность сзшернатант вг 1рал енная в og % инактивР1рованног фага А, равна 1, что означает, что при добавлении 0,3 мл супернатанта к 250 фаговым чacтицa i ннактивирует 10% фаговых частиц, а через 9 недел к льтивирования антител опр оду гтирующая активность исчезает совсем (выживает 100% фаговьк частиц)о П р и м е р 2, Культивирование тнбридомы И Л 14.36 Д.). Для культивирования использовали тслетки гибридомь НЛ 14,36.0, получе ной, как описано в примере , Титр антител в супернатанте .определяли известным способом. Исходная антителонродуцирующая способность гибридомы Н 14,36.0 выражена в fog % инактивированного фага / и равна 2 (фиг, 2, точка 2 на оси у). Суспензию исходных клеток гибридомы Н 14.36.0 разделили на 2 части-, клетки каждой порции отмывали центрифугированием в бессывороточной среде и культивировали кажду порцию так же, как описано в примере 1. Еженедельно определяли антителопродуцирующую способность каждого от/1ельг- о культивируемого клона. График а1гтителопродуцирующей способности гибридомы при непрерывном ее культивировании представлен на фиг. 2. Как ьлщно из этого графика, культивирование гибридомы НЛ 14.36.0 на питательной Среде с добавлением свиной сыворотки - кривая 1 не только позволяет сохранить исходную антителопродуцирующую способность гибридомы в течение длительного времени, но, в данном случае, и повысить ее FI 10000 раз. Как видно из кривой 1, после 5 недель непрерывного культивирования гибридомы в присутствии свиной сыворотки ее антителопродуцирующая способность стала возрастать и на 7-й неделе увеличилась в 10000 раз.. На графике 2 это соответствует точке 6 на оси у, это означает, что при добавлении 0,3 мл нераз веденного супернатанта инактивируется Ю фаговых частиц, тогда как начальный или исходньй супернатант инагливировал 10 фаговых частиц, Определение антителопродуцирующей активности второй порции гибридомы НД 14.36,0 при непрерывном культивировании в присутствии эмбриональной сыворотки коров (фиг. 2, кривая 2) показалоj что в этом случае исходная активность сохраьшлась в течение не более 2 недель, и уже через 5 недель культивирования этот клон полностью потерял антителопродуцирующую способность. Таким образом, предлагаемьй способ кзшьтивирования гибридом в отличие от известного позволяет увеличить продо,гокительность продуктивного периода синтеза антител гибридомами в 10 раз и уменьшить стоимость производства антител.

1т

О

г-г-1-//-Г/А-Го-О-ОУ/О/ЛО.1, L /-L-7/LJ

W if ЧГ

в