Способ получения очищенного протеолитического фермента Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 C07G7/28 

Изобретение относится к способам получения микробиологических препаратов и может быть использовано в микробиологической и медицинской промышленност медицине, микробиологии. Наиболее близким по технической сущ ности к предлагаемому является способ получения протеолитических ферментов, предусматривающий аэробное кулнгивирование пррдуцируйщего его с юрмента на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и кганеральных солей, осаждение и отделение клеток от культуральной жидкости с последующим диализом и лиофильной сушкой И Недостатками способа являются невозможность получения индиввдуаль1 1Ъго целевого продукта, а также нестабильнос последнего. Цель изобретения - обеспечение стабильности фермента и увеличение его выхода. Цель достигается тем, что в качестве продуцента протеолитического фермента используют BQcie tus , vos tinHirnvjs , при этом культивирование проводят глубинным способом 3 течение 36-48 ч при 28-32 С, а осаждение ведут сульфатом аммония при насыщении 0,8-О,9 с последующим диалиаом и очист кой целевого продукта на сефадексе, продуцент культивируют на cpeдv, следующего состава, вес. %: глицерин 0,5-1,5; О,О1О,05; MnSQ4-5H2O О,ООЗ-О,008; CaCBg О,ОО5-О,О1; ZneO4-7H2O О.ОООЗО,ОО07; CuSO -5H2O О,ОООЗ-ОгООО7; reSO4 7Hj,O 0,00002-0,00008; КаНРО 0,03-0,07; (NH)2S04 ОД0,3; N а лимоннокислый трехзамещенный 0,1-0,3; вода дистил1фованная - остальное. Выход целевого продукта составляет 2О98 усл.ед./мл фибринолитической активности при культивировании продуцента на синтетической среде и за 3 ч инкубации фйбриновой пластинки при концентрации белка 100 мкг/мЛс Цепе1юй продукт бой индивидуальный фермент.

штамма

Активность

Стабильность фибринолитическая, усл. едЛ1л Bocit U5 -ttiuring-ien- 2О98 St5 чаг- sили 839 Xctwom ces -tVie moN t csrisВысокая фибринолитическая активност целевого продукта наблюдается при выра щаваяии продуцента на обеих приведенных средах. Целевой продукт, офаауемый предлагаемым шта ммом-продуиентом - одни фермент, не требующий дальнейшей очист ки и какой-либо обработки, отличаювшйся также от известного высокой стабильностью. Причем, он сохраняет свою актив ность при значительном нахревании и гфи длительном хранении в лиофиянзоваяиом состоянии, не требуя ори этом, например иммобилизации. Штамм Bcjcittus tViuringrJews s NQr- iimtftnvjs был «сделен в Канаде в 1Й58 году и хранитса в кшшекшш ВНИИ Прикладной мавробнологии. Штамм tlwHn irtsie -WW.ti niiimus имеет следующие морфологические и физиолого-диохи11«яческиё хфактеристики. М орфологи)Ч еские свойства. Клетки односуточной культуры палочковидные, удлиненные, с тупыми краями, часто соединены в цепочки. Размер клетсж 7-1о мкм, длина 1,5, ширина 3f мкм. Культура образует крупные овальные споры и округлые, мелкие параспоральны кристаллы, соединенные со спорами. Кле ки неподвижны. Гра«положительные. Культуральные свой ств а . Культура Bcsc fcCus ttiuring ensi Nor. образует беловатую пленку на мясо-пептошюм бульоне и

Экономичность

Степень способа лчистки Стабилен He стаби лен 37323824 предсташгяет соО5еспичо)ио нсстабилыилггн фермеит.ч и стабильныйи уво.игчение его выхода предславлено в- таблице. ОдинВьфащивание профермент дуцента на дешевой синтетическойсреде или на сложной среде, идущей в отходы производства Комплекс Выращивание различных продуцента на ферментов среде, содержащей крахмал, растворимыйсреде с сахарозой. На мясо-пептонном и молочном агаре штрих обильный, беловатого цвета, вязкой консистенции. Колонии на мясо-пептонком агаре через 3 сут. имеют правильную округлую форму беловато.шсерого цвета, плоские, непрозрачвые, со слегка волнистым краем, однородные. Физиолого-биохимические свойства. Культура itiuHngfiensis Nar. Eiviiti us разжижает жепативу, гидропизует альбумин, казеин, фибрин, фибриноген. BaciEEus -tVvuHttg ensie Nar.iniMn u9 еаофъп, оптимальная температура для его развития 28i-30 C, диапазон значений рН 7-8-8, оптимальное значение рН 7,. 8. Отношение к углеводам: f использует глюкозу с образованием ацетилметилкар;6инола, сахарозу, целлобиозу, не исполь- эует крахмал, маннозу. ОгНСййение к спиртам: усваивает сорЗит, глицерин. Отношение к органическим кислотам ; усваивает сукцинат, лактат, цитрат. Огнслпение к источникам азота: ассимилируетг аммоний сернокислый и другие аммонийные соли, усваивает глютамат, глютамин, аспартат, аспарагин, глицин, валин, пролин, аргшшн, орнитин. В синтетическую среду состава, г/%; глицерин 1%; MgSO47H2O 0,03%; MnSO45H2O О,О05%, СаСЕг О,ОО8%; f ZnSO4-7H2O 0,0005%, СиБОлЗНгО O,OOO5%;FeSO47H,2,O О,ОООО5%; К,НРОд 0,05%; (Nli,;),.,504 О,2%. На ;,имоннокисяый трехзамешенный О, 57 (рН среды. 7,2) пскзле стерилизации вносят 5% по объему 1-2-с точного посевного материала BaciKus -itiuring -iensis jc -ini-two6, выращенного на этой же среде после смыва с 2-суточных косяко молочного агара. Культивирование осуществпявот глубинным способом в колбах на 25О мл с 50 мл среды на качалке, например фирмы Gab&enVap, Англия при 28-32С в течение 2 сут. Из культуральной жидкости (клетки отделяют при бООО обА1ин в течение 1О мин) выделяют Препарат протеазы пу тем высаливания сернокислым аммонием до насьпцения 0,9, оставляя его для более полного высаливания на 24 ч ггрн Выпавший осадок, содержащий протеолитический фермент, очищают от ионов суль фата аммония на колонке фирмы Фармация (ЗОлбОО см) с сефадексом Gr-25 (wedium). Диалибованный препарат фибрйнолнтическую активность 2О98 усл. ед/мл при концентрации белка 1ОО мкг/м за 3 ч инкубации фибриновой пластинки. Преимущества предлагаемого способа по сравнению с известными заключаются в получении гомогенного стабильного очищенного фибринолитического фермента в повьшении экономичности способа, в увели чении выхода целевого продукт а, а также в возможности использования для получения целевого продукта среды, идущей в отходы микробиологического производства. Фор м у л а изобретения 1. Способ получения очищенного проуеолитнческого фермента, предусматривающий аэробное культивирование проду.цирующего его фермента на питательной 2 среде, содержащей источники углерода, азота н кшнерал-ьиых солей, осаждение и отделение клеток от культуральной жидкости, с последующим диализом и ляофильной сушкой полученного фермента, отличающийся тем, что, с целью обеспечения стабильности фермежга и увеличения его выхода, в качестве продуцента используют штамм BacitEus -t uringriensisNar-finit-imus, при этом культивирование проводят глубинным способом в течение 36-48 ч при 2832 С, осаждение ведут сульфатом аммония при насыщении 0,8-О,9 с последующим диалязом и очисткой целевого продукта на сефадексе. 2. Способ ПОП.1, отличающийся тем, что продуцент культивируют на среде следующего состава, вес.%: Глицерин О,5-1,5 0,О1-О,О5 с.ооз-о.ооа NMiSO.-SH О сасе; 0,005-О О1 Zn 304-1 2.0 О,ОООЗ-О,ООО7 О,ОООЗ-Ор007 СоЗОд5Н О О,ОООО2-0,О0008 peso -тн О К ПРО. 0,03-О,О7 (0,1-О,3 Т4а лимоннокислый трехзамещенный 0,1-О,3 Вода днстшшрованнаяОстальноеИсточники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Выборных С. Н., Егоров К. С. зучение препарата протеолитич;ескнх ерментов термофильного актиномицета ctinomvices -LtiermoNuKgaH штамма -54. Прикладная биохимия и микробиоло- йя, 1975, т. XI, вып. 6, с. 82933 (прототип).