Способ определения групп гаптоглобина в крови Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 G01N33/80 

СО

Изобретение относится к медицине а именно к лабораторной диагностике и мржет быть использовано в медикогенетической и судебно-медицинской практике для определения групп гаптоглобнна в сыворотке крови человека.

В настоящее время группу гаптоглобина определяют для медико-генетического консультирования в качестве генетических маркеров, а также в судебно-медицинской практике в случаях экспертизы спорного отцовства, материнства, замены детей.

Гаптоглобин представляет собой сывороточный белок, связанный с с „глобулинами, группа гаптоглобина передается по наследству. Определение различных групп гаптоглобина основано на их электрофоретическом разделении в крахмальном или полиакриламидном геле, В связи с тем, что гаптоглобин не окрашивается, одновременно с ним производят электрофорез гемоглобина, который, связываясь с гаптоглобином, может быть окрашен с помощью бензидиновой реакции

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения группы гаптоглобина в крови. Перед определением группы гаптоглобина исследуемую сывортку обогащают гемоглобином. Для этого используют кровь доноров, желательно с группой гаптоглобина 1-1.

Кровь,взятую из пальца, центрифугируют, насадочную жидкость отсасывают, эритроцитыне менее 7 раз промывают физиологическим раствором а затем к осадку эритроцитов добавляют 3-4-кратное количество дистиллировайной воды. Раствор гемоглобина сохраняют в холодильнике до 1 мес. К исследуемой сыворотке добавляют приготовленный раствор гемоглобина в соотношении 10:1, после чего ставят в холодильник на 12 ч. Комплекс гаптоглобин - гемоглобин подвергают электрофорезу и окрашивают 2,5%-ным раствором бензидина в уксусной кислоте, а затем ,в 0,3%-ной перекиси водорода lj .

Известный метод определения групп гаптоглобина в сыворотке крови человека дает в ряде случаев сомнение в отношении правильной идентификации группы гаптоглобина. Затрудненияв оценке электрофореграммы могут быть отнесены за счет особенностей донорского гемоглобина, который добавляют к исследуемым сывороткам для связи с гаптоглобином. Во-первых, раствор гемоглобина может содержать гаптоглобин донора. Во-вторых, известен значительно выраженный полиморфизм гемоглобина человека

(более 40 видов), каждый из которых может отличасться различной электрофоретической подвижностью и способностью связываться с гаптоглобином. В-третьих, в процессе длительного хранения раствора донорского гомоглобина происходит изменение его свойств, что также может отрицательно сказаться на результатах исследования. Все эти моменты могут в оп ределенной мере исказить электрофореграмму, что приводит к затруднениям и ошибкам при учете результатов исследования.

Как показал опыт р-аботы по определению групп гаптоглобина известным методом, частота сомнительных результатов при его применении составила 23%, что потребовало повторения исследования.

0 Цель изобретения - повышение точности определения.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения групп гаптоглобина в крови путем выделения сыворотки крови, добавления к ней гемолизата эритроцитов и последующего электрофореза, используют гемолизат эритроцитов крови исследуемого.

0 Способ осуществляют следующим образом.

У обследуемого лица берут кровь в количестве 1-1,5 мл, центрифугируют, сыворотку переносят в пробир5 ку, а оставшиеся в осадке эритроциты гемолизируют путем добавления 34-кратного количества дистиллиро ванной воды, тщательно взбалтывают 5 мин, К сыворотке добавляют полу0 ченный раствор гемоглобина в соотношении 10:1, помещают на 12 ч в холодильник при 2-4 С. Электрофоретическое разделение, окраску и учет полученных результатов осуществляют

5 по известному способу.

Пример 1. Ребенок Г., 8 лет, история болезни № 94. Взята кровь из пальца в количестве 1 мл в суг

Э

хуто пробирку, отцентрифугирована при 800 в течение 15 мин. Насадочнуго жидкость (сывортку) переносят в другую пробирку. К осадку эритроцитов добавляют 1,5 мл дистиллированной воды. К 10 каплям полученной в результате центрифугирования сыворотки добавляют 1 каплю гемолизата эритроцитов, содержащую раствор гемоглобина. Смесь «ьщерживают в холодильнике при в течение 12 ч. Электрофорез проводят в полиакриламидном геле, окрашивают бензидином, определена группа гаптоглобина 2-1.

П р и м е р 2. Ребенок П., 3 года акт № 223 от 14 июля 1981 года, Взята кровь в количестве 2 мл, отцентрифугирована при 800 f 18-20 в течение 15 мин. К 10 каплям полученной сыворотки добавляют 1 каплю раст вора гемоглобина с группой гаптоглобина 1-1. Смесь выдерживают в холодильнике при в течение 12 ч Электрофорез проводят в полиакриламидном геле, окрашивают бензидином.

122794

Вначале расположение линий на элект рофорегра № е соответствовало группе гаптоглобина 2-2, а через 3 мин появилось дополнительное кольцо, из5 манившее характер элeктpoфopeгpaи ы. Такой сомнительный результат не позволил диагностировать группу гаптоглобина у ребенка, в связи с чем возникла необходимость повторного

0 исследования.

Предлагаемым методом определения групп гаптоглобина в крови исследовано 643 лиц, из них более, чем 280 детей раннего возраста. При этом

5 нечеткий результат получен у 19 лиц, что составляет 3% случаев. Это дало возможность значительно сократить затраты времени персонала на проведение повторных исследований у од0 ного и того же лица.

Таким образом применение изобретения позволило значительно (более, чем в 7 раз) снизить число сомнительных результатов, тем самым по5 высть точность метода определения группы гаптоглобина в крови.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП ГАПТОГЛОБИНА В КРОВИ путем выделения сыворотки крови, добавления к ней гемолизата эритроцитов и последующего электрофореза, отличающийся тем, что, с целью повышения точности определения, используют гемолизат эритроцитов крови исследуемого.