Поставленная цель достигается октапептидом формулы 1 ъл I I -v I I- . . s.. га Sar-Ai g-aza-d. -Hva-Tyr-Val-His-Pro-3 где Sar - остаток саркозина; aza-{ -Hva aza-(i -гомо-1-валина - NH-CH-NH-CO- . t ен(сно,)о Все аминокислоты L-конфигурации. Соединение ,отличается от саралазина и других его структурных аналогов дополнительной модификацией в положении 3 (остаток валина в положении 3 заменен на остаток аза-cL-гомовали на), что приводит к понижению пресеорной активности без изменения сродства к рецепторам ангиотензина II. В опытах in vivo и in vitro соединение I не проявляет прессорного эффекта, даже при наивысших применяемых концентрациях соединения I (до 500 мкг/кг). Саралазин же обладает 1 , прессорной активностью природ ного гормона. Таким образом, соединение I имеет существенно улучшенные фармакологиче кие свойства по сравнению с известным ингибитором ангиотензина II, вес ма важные для практического применения Zj, в частности для диагностики и терапии рениновых форм гипертониче кой болезни. СоединениеI, синтезировано конден сацией отдельных фрагментов известными методами IkJ согласно схеме. Пр межуточные соединения (2)-{6) и(10) (18) получены также известными способами Г4}, При этом применялись бензилоксикарбонильная, нитро.метиль ная, трет-бутилоксикарбонилгидразидная, гидразидная, п-нитробензильная группа. трет-Бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-саркозил-М-нитроаргинил-валина (7) получают карбодиимидным методом ,,конденсируя бензилоксикарбонил-М-йироаргинин-(5) с трет-бутилоксикарбонилгидразидом валина (6) в присутствии двух моль 1-оксибензотриазола, Защиту гидразидной функции-трет-бутилоксикарбонильную группу соединения (7) -отщеп ляют трифторуксусной кислотой при комнатной температуре. Азид, получен ный по методу Рудингера из гидразида (8) выдерживают в растворе диметилформамида при 60®С 1 ч, 8 таких усло виях азид полностью перегруппировы(г) вается в изоцианат (9), который без выделения вводят в реакцию с аминокомпонентом (18). Защитные группы у полученного октапептида (19) удаляют каталитическим гидрогенолизом. Октапептид I очищают ионообменной хроматографией на СМ-целлюлозе в градиенте ацетата аммония. Состав и однородность полученного аналога доказаны аминокислотным и элементным анализами на хромато- и электрофореграммах имеется одно пятно с положительной реакцией на нингидрин, реактив Сакагучи Паули,Рейнделя-Хоппе,Эрлиха1 (на уреидную группу). Исследование биологических свойств соединения I. . Миотропная активность (1-саркозин, З-аза-с -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ангиотензина Ц изучалась в опытах in vitro согласно методике van Rossum 5J посредством регистрации изотонических сокращений восходящей ободочной кишки (Colon ascendens) крыс, являющейся наиболее чувствительным тест-органом для исследования миотропной активности ангиотензина II (6) , с использованием модифицированного прибора ВИ6-5МЛ. Агонистические и антагонистические свойства изучак1т в диапазоне консвойства изучают центраций 1(ГН, время предварительной экспозиции кишки с исследуемым соединением составляет 3 мин. При вычислении кумулятивных кривых концентрация - эффект (КККЭ) применяют машинную обработку экспериментальных данных (каждая точка опре деляется как средняя из 6 опытов) с определением стандартной ошибки при ,05. Для количественной характеристики конкурентного антагонизма (1-саркозин, 3-аза- oL -гомовалин,5-валин, 8-изолейцин) ангиотензина II вычисляют параметр рЛг. В опытах in vitro соединение I в диапазоне концентраций 10- 1СГМ не проявляет миотропного эффекта, но в концентрациях 1 вызывает прогрессивное параллельное перемещение КККЭ ангиотензина II в сторону высших концентраций, т.е. проявляет конкурентный антагонизм с ангиотензином II, характеризующийся величиной pA(8,60i 0,29. В концентрации исследуемое соединение вызывает понижение высоты КККЭ ангиоконцентрациях 1 П тензина М полностью ингибирует миотропный эффект ангиотензина I (фиг.1). В опытах in vivo регистрируют артериальное давление из общей сонной артерии наркотизированных уретаном белых крыс обоего пола весом 180200 г с помощью ртутного манометра на закопченной ленте кимографа. Qeщества вводят в бедренную вену в виде инъекций в объеме 0,1 мл/200 г ве са в дозах 0,5-500 мкг/кг. При изучении антагонизма исследуемого соединения по истечении 1 ми с момента его введения крысам вводят ангиотензин И в стандартных дозах 0,5; 2,5 и 5 мкг/кг. Вычисляют кривые доза-эффект для ангиотензина I1 в присутствии и в отсутствии арг тагониста. В опытах in vtvo исследуемое сое динение не обладает прессорной актив ностью, даже при наивысших применяемых концентрациях (до 500 мкг/кг), н значительно ингибирует прессорное де ствие ангиотензина II. В присутствии (1-саркозин,3-аза-сС-гомовалин,8-изо лейцин)ангиотензина II в дозе 5 мкг/ требуется 10-ти кратное увеличение дозы ангиотензина II для достижения его первоначального эффекта (фиг.2) В синтезе используют аминокислоты L-ряда. Температуры плавления соединений определяют в открытых капилярах без исправления. Удельные углы оптического вращения измеряют на цифровом поляриметре модели фирмы Perkln-Elmer (СИЛ). Электрофорез проводят на бумаге FN-l6(Fi1trak ГДР) в 5 и. (рН 1,9) уксусной кислоте при 18 В/см. Электрофоретическая подвижность соединений приведена по отношению к гистидину (Ец тех проводят на пластинках силикагеля фирмы Merck в системах хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетатвода Юб: : (л) н-бутанол-этанол-вода-уксусная кислота 80:10:30:5 (Б); хлороформ-метанол-уксусная кислота 80:10:5 (В); хлороформ-изопропанол-этилацетат-уксусная кислотавода 85:5.8:2:0,25 (Д) . Вещества на хромато- и электрофореграммах в зависимости от структуры соединения обнаруживает нингидрином и реактивом Паули, а также реактивами Сакагу чи, Рейнделя-Хоппе и Бартона. Для эл ментного анализа вещества высушивают в пистолете Фишера в течение ч над PU. 5 Р 60°С и остаточном давле 6 НИИ 0,1 мм рт.ст. Кислотный гидролиз пептидов проводят в 6н соляной кислоте при 105°С в запаянных ампулах в течение 2k ч. Аминокислотный состав определяют в автоматическом анализаторе ВС-200 фирмы Ciocal (ФРГ). Трет-бутилоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-саркозил-Н нитроаргинил-валина (7). К охлажденному до О С раствору 6,36 г (15лМмоль) бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроагинина (5), З. г (15 ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида валина (6 и ,06 г (30 ммоль) 1-оксибензотриазола в 50 мл ДНФА приливают раствор 3,2 г (16 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 10 мл ДМФА и выдерживают ч при 2°С и 5 ч при выдерживают 22 С, Дициклогексилмочевину отфильтровызают, фильтрат выливают в 500 мл смеси, содержащей насыщенный раствор NaCl и раствор КНСОз в соотношении 1:1, вещество экстрагируют смесью этилацетат-н-бутанол 1:1,промывают насыщенным раствором NaCl| 5%-ным раствором KHS04, насыщенным раствором NaCl, высушивают над MgS04, упаривают, и полученное вещество растирают с эфиром. Выход 8,8 (92); т.пл. 180-185°С, W 22,4 (С 1,ДМФА); R 0,27(В); Rj 0,78 (Г) ; R О,+7 (Д)Найдено,о: С 51,+5; Н 6,79; N 19,б7 Cjji-fH aNgOg. Вычислено,: С 50,85; Н 6,80; N 19,76. Гидразид бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроаргинилвалина(8). Раствор 8j7 г (13,б ммоль) трет-бутилоксикарбонилгидразида (7) в ЗС мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 20 мин при 22 С и упаривают, остаток растирают эфиром, отфильтровывают и перекристаллизовывают из этанола. Кристаллический осадок отфильтровывают, промывают этилацетатом и эфиром, высушивают в вакууме. Выход 6,6 г (87%); т.пл.1б8170°C; ci. 8,3 (С 1, ДМФА); Rr 0,20 (Д). С +6,87; Н 6,28; Найдено,%: N 21,81. C HjjNgOg С ii6,39; Н 6,19; Вычислено,- N 22,13. П -(итробензиловый эфир бензилоксикарбонилсаркозил-М нитроаргинил-аза-. -cL-гомовалил-тирозил-валил-гистидил-пролил-изолейцина (9) к раствсру 2,85 г (5 ммоль)(8) в 15 мл ДМФА прибавляют мл 4,5н раствора НС1 в этилацетате. реакцион ную смесь охлаждают до -20 С, прибавляют 0,62 мл (5,5 ммоль) трет-бутилнитрита и выдерживают 20 мин при -15С, охлаждают до -40С, при интен сивном перемешивании небольшими порциями прибавляют триэтиламин до рН среды 7, и упаривают реакционную смесь в вакууме (10° мм рт.ст.). Сухой остаток высушивают 3 ч в глубоком вакууме ( 10) при температуре бани 20-30 0, потом растворяют в 30 мл сухого этилацетата и выдерживают 1 ч при (в течение Ьервых 10-15 мин выделяются пузырьки азота). Полученный раствор изоцианата (9) прибавляют к раствору 2,29 г (3 ммоль) дигидробромида п-нитробензилового эфира тирозил-валйл-гистидил-пролил-йзолейцина и 0,7 мл (6 ммоль) триэтиламина в 15 мл ДМФА, выдерживают 15 ч при комнатной температуре и выливают в 200 мл насыщенного раствора NaCl. Осадок отфиль ровывают, промывают последовательно 5%-ным раствором NaHCOj,водой, раствором KHS04, водой и высушивают на воздухе. Сухое вещество кипятят с 50 мл этанола, отфильтровывают нерастворимую часть, фильтрат упариваю и полученный защищенный октапептид 8 8 очищают хроматографией на силикагеле в системе хлороформ-этанол-изопропанол-этилацетат-вода 10:6:+: 3:1. Выход 2,1 г (, считая на аминокомпонент). Т.пл. 180-183С;{а. 21,7 (С 1,ДМФА); R 0,52(А) R. 0,81 (Б); Е|,,43(рН 1,9). Найдено,%: С 55,2; Н 6,33; N 16,91. СбоНе бО ь . Вычислено,: С 5б,20; Н 6,37; N 17.7. Саркозил-аргинил-аза- cL -гомоваил-тирозил-валил-гистидил-пролил-изоейцин 1. К раствору 1,5 г (1,17 ммоль)(t9) в 50 мл смеси метанол-уксусная кислота-вода 6:1:1 прибавляют 1 г палладиевой черни и гидрируют 12 ч, катализатор отфильтровывают, и фильтрат упаривают. Полученный октапептид 1 очищают ионообменной хроматографией на СМ-целлюлозе. Выход 0,91 г (67%). Т.пл. 210-213С; д.,0°С (С 0,5, 1н CHjCOOH); R 0,06 (г), Rr 0,Oi(B); ,75 (рН 1,9). Найдено,: С 49,90; Н N 16,72. %%2СН СООН Вычислено,%: С 50,59; Н 7,80; N 16,86.
СН(СНз)(1) .
Схема си«теза (1-саркозин, 3 аза-|Стомовалин,5 валин,
8-изолейцин) ангиотензина I I Формула изобретения ОктасТептид формулы IOЭ.45 Ь 7 Sar-Arc -ci2Q-tl-Hva-Tar-Vae-His-PrQобладающий способность специфически ингибировать прессорный эффект и мио тропное действие ангиотензина II. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Laragh J. H.,Case D. В,, WallaceJ.M., Keim Н, Blocade of remin or angiotensin for understanoling of human hypertension: a coraparison of propranolol, saralasin and converting enzyme blocade. . :Proc. 1977, V. 36, N 5, p. 1781-178 2.Wallace J. M., Case O.B., Laragh j. H.,Kein H.J.,f)rayer J.I.M. Sea ley J. E. I he immediate pressor responce to saralasin in man. A test of angiotens.in 11 receptor Vacancy.. Res , 1979, v.tt, N 1, p.38-kk 3. Keim H. J., Drayer J. I ., Case O.B., Lopez-Ovejeroh J., V/allace J.M., Weber М.Л., Laragh J.H. A role for renin in rebound hypertension and encepholopathy after infusion of saralasin acetate(sar-ala -angiotensin t ), N.Engl. JJ1ed., 1976, v. 295, Vf 21, p. 1175-1177. 4. Химия полипептидов. Под ред. П. Кацоянниса, Пер. с англ. М.,Мир 1977. 5.Van Rossum J.M. Cumulative dose-response curves. II. Technique for the, ma King of doseresponce curves in isolated organs and the evaluation in isolated organs and the evaluation of drug parameters. - Arch, int. Pharmacodyn., 1963, v. ЙЗ, № 3-, p. 299-330. 6.Regoii D., Vane J.R. A sensitive method for the assay of angrotensin. - Brit J. Pharmacol., 196, V. 23, N 2, p. 351-359..
Йммртст.
0
го
10
2,5 S,ff
0,5
мкг1кг Фиг.2
