Способ определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале Советский патент 1987 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимии и может быть использовано для определения лейцинаминопептидазы в биологическом материале.

Цель изобретения - ускорение и по вышение чувствительности способа.

Способ осуществляют следующим образом.

Ликвор (фракции ткани мозга) наносят на хроматографическую колонку с приспособлением для центрифугирования, заполненную сефадексом G-75, центрифугируют в течение 2 мин со скоростью ЗбОО об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, затем 1-4%-ным раствором формальдегида для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин.

Далее на колонку наносят 6-9%-ный раствор формальдегида, оставляют на 30-40 мин при комнатной температуре и вновь центрифугируют ее в течение 2 мин со скоростью 3000 об/мин.

Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности с помощью ЛАП-теста фирмы Ferraognost.

Одновременно в исследуемых образцах проводят количественное определение белка методом Лоури и удельную активность фермента выражают на 1 мг белка.

При этом удельная активность лей;- цинаминопептидаза ( ЛАП) , выделенного из биологических жидкостей и ткани мозга, колебалась в пределах от 5 д 30 ед/мг белка.

Полученный положительньш эффект обусловлен выявленным свойством формальдегида в концентрации от 6 до 9% избирательно элюировать фермент с хроматографической колонки и одновременно активировать его.

Опытным путем установлена оптимальная концентрация формальдегида - в пределах от. 6 до 9%.

5-4%-ный раствор формальдегида смывает лишь балластные белки, 4 - раствор частично элюирует фермент (не более 60%).При концентрации вьше 9% фермент инактивируется.

Время контакта оптимальной концентрации формальдегида (6-9%) с сорбированным на колонке ферментом колеблется в пределах 30 - 46 мин. При инкубации в течении 10-25 мин (за счет недостаточной десорбции фермен

та) и при инкубации более 45 мин (за счет инактиваций) -активность фермента снижалась.

Пример 1. Ликвор больного с рассеянным склерозом наслаивают на хроматографическую колонку (с приспособлением для центрифугирования), заполненную сефадексом G-75, центрифугируют в течение 2 мин со скоростью 3000 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, а затем 1-- 4%-ным раствором формальдегида для удаления балластных белков и вновь центрифугируют 2 мин со скоростью 3000 об/мин. Далее сорбированный на колонке фермент инкубируют 30 мин при комнатной температуре в присутствии 9%-ного раствора формальдегида с последующим центрифугированием при 3000 об/мин.

Удельная активность ЛАП в исходном ликворе О, после инкубации сорбированного на колонке фермента в присутствии 9%-ного раствора формальдегида 30 ед/мг белка.

Таким образом, время выделения фермента сокращается до часа по сравнению с 72-96 ч, в известном способе. Одновременно чувствительность способа повышается в 4 раза.

Пример 2. В ткани мозга выделение фермента проводят из грубоочи- щенных препаратов миелина. Для этого 3,0 г ткани мозга кролика гомогенизируют в присутствии 20 мл 0,32 М сахарозы, наслаивают гомогенат наО,85М раствора сахарозы, центрифугируют при 26000 об/мин в течение 60 мин.

40. .

Фракцию миелина суспензируют двумя объемами дистиллированной , центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин. Осадок обрабатывают 14 мл физиологи- ческого раствора (500-600 у белка/мл) и полученную суспензию наносят на две хроматографические колонки.

50

55

В одном случае процедуру выделения проводят аналогично примеру 1. Вторую колонку оставили в холодильнике на 4 дня. Фермент элюировали физиологическим раствором.

Удельная активность ЛАП в исходной суспензии миелина 0,03 ед/мг белка. После инкубации сорбированного на колонке фермента в присутствии

312936584

6%-ного формальдегида удельная актив- та, элюцией фермента с последующим ность 21 ед/мг белка.определением его спектрофотометрически с помощью субстрата лейцингидрази- Формула изобретенияда, отличающийся тем.

Способ определения -лейцинаминопеп-5 что, с целью ускорения и повышения

тидазы в биологическом материале пу-чувствительности способа, балластные

тем нанесения пробы на колонку, за-белки дополнительно смывают 1-4%-ным

полненную сефадексом G-75 с после-раствором формальдегида, а инкубацию

дующим вымыванием балластных белковпроводят в течение 30-45 мин в прифизиологическим раствором, инкубаци- сутствии 6-9%-ного раствора формапьей сорбированного на колонке фермен-дегида.

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано для определения лейцинаминопептида- зы (ЛАП) в биологическом материале. Цель - ускорение и повышение чувствительности способа. Образец (лик- вор, фракции ткани мозга) наносят на хроматографическую колонку с приспособлением для центрифугирования, заполненную сефадексом G-75, центрифугируют 2 мин при 3000 об/мин, промывают сначала физиологическим раствором, затем 1-4%-ньам раствором формальдегида для удаления балластных белков и центрифугируют 2 мин при 3000 об/мин. Далее на колонку наносят 6-9%-ный раствор формальдегида, который избирательно элюирует фер-. мент и одновременно активизирует его, оставляют на 30-40 мин при комнат- ной температуре, центрифугируют 2 мин при 3000.об/мин. Специфическая активность целевого продукта подвергается исследованию его активности с помощью ЛАП-теста фирмы Fermognost, Удельная активность ЛАП, выделенной из биологических жидкостей и ткани мозга, равна 15-30 ед/мг белка. с и taoA, ю со со Од О 00