Способ получения анорексогенного средства из сыворотки крови,обладающего эндогенным эффектом насыщения для регулирования потребления пищи через центральную нервную систему Советский патент 1987 года по МПК A61K35/14 

1

Изобретение относится к медицине а именно к препаративной биохимии и касается способа- получения средства обладающего эндогенным эффектом насыщения для центрального регулирования потребления пищи из сыворотки крови человека.

Целью изобретения является вьще- ление из сыворотки крови человека вещества гликопептидной природы - сатиетина,,- обладающего избирательны воздействием на сигнал насыщения и ингибирующим потребления пищи в опытах на крысаз, которые не потребляли пищи в течение 96 ч.

Указанная цепь достигается путем ультрафильтрации сьшоротки человека через мембранньш фильтр с размерами пор, пропускающими вещество с мол.м. 10000-50000 дальтон, лиофили зации, гель-хроматографии через гел с объемом пор, пропускающими вещества 1500-50000 дальтон, элюации 0,1-0,9%-ным водным раствором хлористого натрия, лиофилизации, гель- хроматографии через гель с объемом пор 2000-50000 и лиофилизации.

Способ осуществляется следующим образом.

Сыворотку крови человека подвергают ультрафильтрации через мембранные фильтры, пропускающие вещества мол.м. ниже 50000 дальтон, ультрафильтрацию проводят под давлением 3 атм.с постоянным перемешиванием. В результате такой процедуры сыворока разделяется на две фракции: низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ. Сатиетин находится во фракции низкомолекулярных веществ. Несмотря на мол. м. 60000-100000 даль тон фильтрат высушивают и подвергают гель-хроматографии через гель сефадекса или биогеля с объемом пор 1500-50000, активный продукт выходи в свободном объеме колонки, при элю ции раствором хлористого натрия при нейтральных значениях рН, фракции, содержащие активное вещество, собирают и лиофилизируют, а затем очищают на колонке с биогелем р 2-р 3 элюируют дистиллированной водой, фракции, обладающие активностью, собирают и лиофилизируют.

.Пример 1. 100 л сьшоротки подвергают ультрафильтрации через мембрану Amicon ИМ-10, 700 мл уль- трафильтрата лиофилизируют и затем расo

5

0

5

0

5

0

5

0

творяют в зоне дистиллированной воды и подвергают гель-хроматографии на колонке с сефадексом G-15 (диаметр колонки 5 см, высота 90 см), элюируют 0,9%-ным раствором хлористого натрия при нейтральных значениях рН, собирают фракции по 10 мл. Фракции между полимерами 50 и 60 (между 500 и 600 мл элюирующего раствора) были .найдены биологически активными. Биологически активные фракции собирают, лиофилизируют и растворяют в 10 мл дистиллированной воды, затем наносят на колонку с биогелем Р-30, размер колонки 2,5x90 см и элюируют дистиллированной водой, собирают фракции по 10 мл, фракции между 10 и 15 были биологически активными, их объединяют и лиофилизируют.

В зависимости от качества исходной сьшоротки получают 200-240 мг сухого продукта, который был снежно- белым сходным по структуре с хлопком и гомогенным веществом.

Пример 2. 900 мл сыворотки подвергают ультрафильтрации через мембрану ХМ-50 Amicon, 700 мл фильтрата лиофилизируют и растворяют в дистиллированной воде, затем наносят на колонку с сефадексом G-50 (5x90 см), элюируют 0,9%-ным раствором хлористого натрия и собирают фракции по 10 мл. Биологически активные фракции от 500 до 600 мл объединяют, лиофилизируют, растворяют в 10 мл дистиллированной воды и очищают на колонке с биогелем Р2 (2,5x90 см) с применением в качестве элюэнта дистиллированной воды, с колонки собирают фракции по 10 мл, биологически активной фракции между номерами 11 и 15 собирают и лиофилизируют. Получают 20-30 мг сухого продукта которьй был снежно-белым чистым веществом.

Пример 3. Проводят процесс аналогично примеру 1, но вместо сефа- декс G-15 используют крупнозернистьй сефадекс G-25, а элюцию проводят 0,2%-ным водным раствором хлористого натрия.

Пример 4. Проводят процесс аналогично примеру 1, но-вместо сефадекса G-45 используют тонкодисперс- ньш сефадекс G-25 и элюирутот 0,1%-ным водным раствором хлористого натрия. Гели с меньшими размерами пор, чем сефадекс G-10 не применяются, а при использовании гелей с большими размерами пор, сатиетин нельзя выделить, так как активное вещество проникает в гель и распределяется по всему объему геля,

В результате предложенного спо- соба получено вещество белогр цвета, сходное по виду с хлопком, химический анализ показывает, что оно- является гликопептидом и после его кислотного гидролиза могут быть полу- чены аминокислоты и углеводы: общее содержание аминокислот в продукте составляет 60,6%, редицирукнцих веществ - 13%, углеводов - 10,7%, содержание воды в продукте составляет ;10%, фактически в виде связанной воды. При электрофорезе в полиакрил- амидном геле в присутствии додецил- сульфата натрия обнаружен компонент с мол.м. около 68000 дальтон, но существует компонент с мол.м. 18000 и два компонента с одинаковой мол.м. 28000, хорошо разделяемые.

Спектр поглощения в ультрафиолетовой области не показывает максиму- мов поглощения, но появляется плато примерно в области 275-280 нм, которое может быть характеристикой пептида белка.

Биологическая активность продукта 30 ющего эндогенным эффектом насыщения

на потребление пищи была исследована на самках крыс CFf весом 200- 240 г. Животные были лишены пищи, но воду давали неограниченно. В связи с агрессивностью вызванной голоданием, животньк индивидуально помещали в различные клетки. Каждому животному вводили внутривенно дозу 10 мг/кг сатиетина внутривенно, расдля регулирования потребления пищи через центральную нервную систему путем ультрафильтрацйи сыворотки крб- ви человека через мембранный фильтр 35 с пределами пропускания веществ с мол.м. 10000-50000 дальтон, лиофили- зации фильтрата, растворения его в воде, гель-хроматографии ч.ерез гель с объемом пор 1500-50000 дальтон.

творенного в 0,5 мп физиологического 40 элюции 0,1-0,9%-ным водным раствором

раствора. Животным контрольной группы вводили только 0,5 мл физиологического раствора. Через 1 ч животным давали корм: обычные пищевые таблетки, содержащие альбумин, жир, углевод и 45

хлористого натрия, лнофилиэации целевого продукта и повторной гель-хроматографии через гель с объемом пор 2000-50000, элюции водой и лиофили- зации.

Редактор Г. Волкова

Составитель С. Мельникова

Техред В.Кадар Корректор В. Бутяга

Заказ 2374/58Тираж 595Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

витамины, в неограниченном количестве . Потребление йищи определяли через 1,5 и 24 ч после предоставления корма. Животные с введением сатие- тина снижают потребление пищи при- мерно от 2 до 8 раз в различные сроки по сравнению с контролем и более высокой активностью по сравнению с амфетамином через 24 ч после воздействия.

Для проверки специфического и избирательного действия было проведено испытание препарата на тест подпрыгивания по сравнению с веществом, обладающим сходным воздействием, химическим продуктом амфетамином (d,I амфетамин гидрохлорид, хиноин, даже большие дозы сатиетина не оказывают никакого влияния на повышение или снижение подвижности, также не оказывают влияния и на продольные мьшцы в изолированном состоянии по сравнению с холецистокинином).

Формула изобре.тения

Способ получения анорексогенного средства из сьшоротки крови, облададля регулирования потребления пищи через центральную нервную систему путем ультрафильтрацйи сыворотки крб- ви человека через мембранный фильтр с пределами пропускания веществ с мол.м. 10000-50000 дальтон, лиофили- зации фильтрата, растворения его в воде, гель-хроматографии ч.ерез гель с объемом пор 1500-50000 дальтон.

хлористого натрия, лнофилиэации целевого продукта и повторной гель-хроматографии через гель с объемом пор 2000-50000, элюции водой и лиофили- зации.

Изобретение относится к медицине, а именно к препаративной биохимии, предназначено для получения средства, обладающего эндогенным эффектом насыщения для центрального регулирования потребления пищи, из сыворотки крови человека. Цель изобретения - вьщеление из сьшоротки крови человека вещества гликопедтидной природы - сатиетина, обладающего избирательным воздействием на сигнал насыщения и ингибирующим потребление пищи в опытах на крысах, не потребляющих пищи 96 ч. Дпя этого проводят ультрафильтрацию сыворотки человека через мембранный фильтр под давлением 3 атм с размерами пор, пропускающими вещество мол.м. 10000- 50000 дальтон. В результате сыворотка разделяется на 2 фракции: низкомолекулярных и высокомолекулярных веществ. Сатиетин - во фракции низкомолекулярных веществ. Затем проводят лиофилизацию, гель хр9матографию через гель с объемом пор, пропускающим вещество мол.м. 15000-50000 дальтон. далее элюцию ведут 0,1-0,9%-ным водным раствором NaCl, лиофилизируют, хроматографирутот через гель с объемом пор, пропускающим вещество мол.м. 2000-50000 дальтон, снова лиофилизируют. Получают вещество белого цвета, анализ показывает, что оно является гликопептидом. В результате его кислотного гидролиза получают аминокислоты и углеводы. § О) 00 о: сд СП о СП