Способ получения гамма-глобулина Советский патент 1984 года по МПК A61K39/395 

;с а со

Изобретение относится к вирусологии и может быть использовано в клинической и диагностической работе, а также при изготовлении антительных препаратов для иммунохимических реакций и пассивной иммунизации.

Чистота препаратов антител, получаемых при использовании этого метода, зависит от того, сколь большая часть гамма-глобулинов приходится на долю выделяемых антител, а также от степени предварительного удаления балластных веществ, главным образом липопрйтеинов.

Известен способ получения гамма-глобулина путем его фракционирования по методине Кона спиртовым осаждением на холоде 1.

Использование спиртового метода Кона получения гамма-глобулина ограничено трудоемкостью, длительностью процедуры, необходимостью большого количества холодильного оборудования. К тому же препараты, полученные из молока и молозива, содержат кроме гамма-глобулина альбумин, оС и -глобулины и молочные сахара-.

Известен также способ получения гаммаглобулина, включающий очистку сыворотки от балластных белков путем ее оёработки охлажденным хлороформом в их изоэлектрической точке при рН 5,0-5,6 с последующим концентрированием препарата известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40-бО%-ного насыщения, сульфатом натрия в 18°/о-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем М.В. 6000-10000 дальтон в 8-Ш /о-ной конечной концентрации 2

Однако известные способы не обеспечивают высокой степени очистки целевого продукта с сохранением необходимой степени специфической активности. Длительный и сложный технологический процесс включает открытые стадии и стадии, оказывающие денатурирующие воздействия на сывороточные белки, что является одной из причин снижения активности сывороток на 20-30%.,

Цель изобретения - повыщение степени очистки гамма-глобулина с сохранением высокой специфической активности.

. Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения гамма-глобулина путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5- 1,5%, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2-0,6%, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5-10%.

Учитывая сложный состав таких биологических жидкостей, как сыворотка крови.

молоко, молозиво, желчь, феномен селективного выделения гамма-глобулина обработкой полиэтиленимином, хлороформом и полиакриловой кислотой можно объяснить следующим образом: с помощью полиэтиленимина удаляются из биологической жидкости альбумин и основная часть мелкомолекулярных белков (преальбумин, трансферин, постальбумин и др.), полиэтиленимин флоккулирует в этом случае белки с малым

суммарным зарядом; хлороформ денатурирует крупномолекулярные структурные компоненты, но с малым суммарным зарядом, в том числе липопротеины, глюкопротеины и в последующем переводит их в нерастворимое состояние; при обработке полиакриловой кислотой осаждаются альфа-2- макроглобулины и бета-глобулины, а также образовавщиеся на выщеуказанных этапах агрегаты денатурированного белка и остатки полиэтиленимина.

Селективное выделение гамма-глобулина возможно только вышеуказанной поочередной обработкой. Изменение очередности обработки не дает подобного эффекта, так как присутствие в биологической жидкости

мелкомолекулярных белков снижает эффективность удаления крупномолекулярных компонентов - липопротеинов, глюкопротеинов и др. После этой обработки в биологической жидкости, в основном, находятся крупномолекулярные белки, из которых в

дальнейшем с помощью полиакриловой кислоты удается получить гамма-глобулин.

Пример 1. К 100 мл сыворотки крови крупного рогатого скота добавляют равное количество дистиллированной воды, а затем по каплям добавляют 10 мл 10%-ного водного раствора полиэтиленимина, создав таким образом его 0,5%-ную конечную концентрацию в смеси. Смесь перемешивают до образования флоккул в течение 5-10 мин После образования флоккул в жидкость

добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 5% его конечной концентрации в растворе, и ее энергично гемогенизируют в течение 5-10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об./мин в надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4%-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0,2% ее конечной концентрации в растворе. Затем проводят центрифугирование при 3000 об./мин 20 мин. Для дальнейшего применения используют надосадочную жидкость. При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40-50%-ного насыщения, сульфатом

натрия в 18%-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8- 10%-ной конечной концентрации. Полученный осадок ресуспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований. Пример 2. К 100 мл молока крупного рогатого скота (рН 7,0-7,5) добавляют 10 м 10%-ного водного раствора полиэтилнимина, создав таким образом его 1°/о-ную конечную концентрацию. Смесь перемешивают 5-10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 5 мл хлороформа, что составлят 5 его конечной концентрации, и ее энергично гемогеннзируют в течение 5-10 мин. После центрифугирования в течение 20 мин при 3000 об./мин в надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4%-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0,4% ее конечной концентрации. Затем сыворотку центрифугируют, а для дальнейшей рэботы используют надосадочную жидкость, При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40 X 50%-ного насыщения, сульфатом натрия в 18°/о-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8-10%-ной конечной концентрации. Полученный осадок суспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований. , Пример 3. К 100 мл молозива свиней (рН 7,0-7,6) добавляют 10 мл Ю /о-ного водного раствора полиэтиленимина, создав , таким образом его 1°/о-ную конечную концентрацию в растворе. Смесь перемешивают 5-10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 10% его конечной концентрации, и энергично гемогенизируют в течение 5-10 мин, а затем центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют 10 мл 4%-ной полиакриловой кислоты, что составляет 0,4% ее конечной концентрации, и центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин. Последующее концентрирование с помощью средств, указанных в примерах 1 и 2, не всегда целесообразно в связи с высоким содержанием антител в молозиве. Пример 4. К 100 мл желчи свиней (рН 7,0-7,6) добавляют 15 мл 10%-ного водного раствора полиэтиленимина, что составляет 1,5% его конечной концентрации. Жидкость перемешивают 5-10 мин. После образования флоккул в жидкость добавляют 10 мл хлороформа, что составляет 10% его конечной концентрации, и ее энергично гомогенизируют 5-10 мин, а затем центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин. В надосадочную жидкость добавляют 15 мл 4%-ной полиакриловой югслоты, что составляет 0,6°/о ее конечной концентрации в растворе, и центрифугируют при 3000 об./мин 20 мин При необходимости получения препарата с более высокой удельной серологической активностью гамма-глобулин концентрируют известным образом, например путем обработки жидкости сульфатом аммония 40- 50%-ного насыщения, сульфатом в 18%-ной конечной концентрации в растворе или полиэтиленгликолем в 8-10%-ной конечной концентрации. Полученный осадок ресуспендируют в заданном объеме и используют для дальнейших исследований. Результаты опытов по выделению гаммаглобулиновой фракции из молока и молозива представлены в табл. 1. Данные табл. 1 свидетельствуют об универсальности способа получения гамма-глобулинов. Так при получении гамма-глобулинов из молозива, содержание белка уменьшилось в 7 раз, потери активности не было отмечено. На примере с молоком была отмечена небольшая потеря специфической активности в реакции иейтрализации, но не в РРИД. В табл. 2 представлены результаты опытов по получению гамма-глобулинов с использованием известного (контрольного) и предлагаемого способов. Из табл. 2 видно, что предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет получать гамма-глобулины со значительно большей удельной серологической активностью (1,33-7,54 раз). Эта закономерность подтверждена- и с сыворотками других видов животных (табл. 3). Кроме того, необходимо отметить, что это подтверждено на примере вируснейтрализуюших и преципитирующих антител. Из табл. 4 видно, что при обработке сыворотки по предлагаемому способу происходит селективное выделение гамма-глобулина. Предлагаемый способ биологической жидкости дает возможность, в отличие от ранее используемых способов, получить высококонцентриррванный препарат с заданной активностью. Из проведенных опы- . тов выяснилось, что предлагаемый способ получения гамма-глобулина универсален, так как дает возможность получать гаммаглобулин не только из различных биологических жидкостей, но и из биологических жидкостей различных видов животных. Преимущество предлагаемого способа заключается также в том, что получаемый антительный препарат имеет значительно большую удельную серологическую активность, чем полученный по известному способу, и имеет возможность регулирования активности в зависимости от степени концентрирования. Предлагаемый способ прост, воспроизводим, технологичен, легко выполнимый в аппаратном оформлении. Высокая удельная серологическая активность

в значительной степени исключает возможные при использовании обычной технологии перекрестные реакции, что особенно важно при диагностике инфекционных заболеваний.

Использование антительных препаратов, полученных предложенным способом.

даст возможность получения высокоактивных и специфических диагностикумов (в т. ч. конъюгированных ферментами, флюоресци нами, изотопами, эритроцитами, стафилококками) при незначительных потерях дорогостоящих маркеров и других реактивов, используемых при конъюгации.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММАГЛОБУЛИНА путем обработки биологической жидкости хлороформом с последующей очисткой, отличающийся тем, что, с целью повышения степени очистки целевого продукта с сохранением степени специфической активности, в биологическую жидкость перед обработкой хлороформом добавляют полиэтиленимин в конечной концентрации 0,5-1,5%, далее обработку проводят полиакриловой кислотой в конечной концентрации 0,2-0,6%, причем конечная концентрация хлороформа составляет 5-10%.

2,9 0,5 Молоко коровы 12,5 1,8 Молозиво свиньи

Таблица 1

Таблица 2 1,51,17 3,353,35 6,5 6,5 7,,0

6,3 5,75 0,85

Г|шеримм |Тная сыворотка морской свинки

Реконвалгсцентные сы6,8 6,35 1,18 воротки свиней

Реконвалесиентные сы

7,9 5,90 0,85 воротки КРС

Гиперинмунные сыноротки

/

7,34 5,35 0,54 кроликов

Гамча-глоСупи, полученный по лрелпэгаемому способу

ТаСлиця 3

8,0

1,37

6,75

3,6

5,35

3,7

1,5

5,9

8,0

6,9

0,75 5,35

5,3

6,75

2,90,8 4,90 3,7

.1

6,9

Таблица 4