Способ получения эндонуклеаз-рестриктаз, обладающих способностью узнавать и расщеплять последовательности нуклеотидов 5 @ -GPUCGPYC-3 @ и 5 @ -CATG-3 @ Советский патент 1989 года по МПК C12N9/22 C12N9/22 C12R1/21 

I

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к производству ферментов, в частности к способу получения рестриктаз.

Целью изобретения является ynjio- щение способа получения и повышение выхода целевых продуктов.

Штамм Haemophilus influenzae RFL I получен из ЦНИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова и хранится во Всесоюзной коллекции промьшшенных микроорганизмов института ВНИИ генетика под номером ВКПМ В-4035.

314

Используемый штамм Haemophilus

influenzae RFL I обладает следующими

морфологическими, культуральными и

|)изиологическими признаками. Клетки

коккобациллярные. Грамотрицательные,

неподвижные, бескапсульные; требует

для роста X и У факторов; на плотных

средах формируют прозрачные мелкие

колонии; гемолиз отсутствует.. Штамм

1образует уреазу, расщепляет ксилозу;

образует индол, не имеет /,-галактозида-зы и не утилизирует орнитин (относится к второму биотипу по Killian На агаризованном экстракте мозга

и сердца теленка после 24 ч инкубации в термостате при образует мелкие, круглые,V с ровными краями колонии. Колонии гладкие, блестящие, с агаром не срастаются. В мясо-пеп- тонном бульоне культура не размножается. Оптимальная температура роста

.

осуществляют следующим

Способ образом-.

Пример. Получение рестрик- таз Hin 1 I и Hin 1 II .из Haemophilus influenzae RFL I.

Последовательность операций. I. Культивирование штамма и полубиомассы. , Выделение и очистка рестрикчениеII таз:

, 2.

Разрушение клеток Хроматография на фосфоцеллюло- зе.

3.1.Очистка реетриктазы Hin 1 I:

3.1.1.Фракционирование белков на голубой сефарозе.

3.1.2.Хроматография на гепарин- сефарозе.

3.2.Очистка рестриктазы Hin 1 II:

3.2.1.Хроматография на ДЭАЭ-цел- люлозе..

3.2.2.Хроматография на гепарин- сефарозе.

1. Для получения биомассы Haemophilus influenzae RFL I используют аппаратуру: лабораторный ферментер Биолафит (Франция),. рН-метр, термостат, автоклав, круговые качалки, спектрофотометр СФ-26, проточная це:1трифуга типа ЦЕПл (ФРГ), бокс ламинарный.

Для размножения и культивирования штамма используют сердечно-мозговой экстракт (Brain Heart Infusion Difco,c добавлением X и У факторов. Питательная среда в своем составе

содержит

0

5

0

25

3,7% экстракта мозга и сердца теленка, 0,02% никотинамидаденин- динуклеотида (НАД) и 0,1% гемина, рН 7,0. Сердечно-мозговой экстракт стерилизуют при 1 атм в течение 20 мин, раствор гемина - при 70°С в течение часа, раствор НАД - ультрафильтрацией.

Штамм Н. influenzae RFL I поддерживают в лиофильно высушенном виде при +4 С. Криозащитную среду для хранении культуры готовят отдельно следующим образом: раствор сахарозы и желатины стерилизуют.при 0,9 атм в течение 30 мин два раза через сутки и перед пригото1злением бактериальной суспензии в так приготовленный .стерильный раствор в асептических условиях до бавляют такое же количество бычьей сыворотки.

Дпя оживления культуры в две пробирки с питательной средой (сердечно-мозговой экстракт, НАД и гемин) и две пробирки с мясо--пептон11ым бульоном (для контроля чистоты культуры) переносят лиофильно высушенную культуру. Пробирки инкубируют 18 ч при 37 С, затем бактериологической петлей культуру повторно пересевают в две пробирки с питательной средой и мясо-пептонным .бульоном и помещают на круговые качалки при 80-100 об/мин. Через 18-20 ч культивирования проводят третий пассаж - для непосредственного засева ферментера: по 0,25-0,30 мл таким образом полученной суспензии клеток добавляют в две колбы с 0,25 л в каждой 40 среда. Йнокулят выращивают на тер- мостатирован1а1х круговых качалках при 200 об/мин, в течение 18- 20 ч. Оптическая плотность суспензии иНокулята при длине волны 540 нм составляет 3,0-3,5 о.е. Полученный инокулят засевают в лабораторный ферментер Биолафит, содержащий 10 л питательной сред1 1. Культуру Н. influenzae RFL I выращивают при ,. рН 7,0-7,2 со скоростью перемешивания в первый час культивирования 150 об/мин и далее до 250 об/мин а также подачей стерильного воздуха 3 л/мин в .первый час роста туры с постепенным увеличением до 5 л/мин на 6-м часу роста. Зада нную рН во время выращивания культуры поддерживают добавлением насыщенного, раствора бикарбоната натрия.

30

35

45

50

55

Во Ьремя культивирования периодически отбирают лробы и измеряют оптическую плотность суспензии клеток. Культивирование штамма проводят до поздней логарифмической фазы роста - оптическая плотность суспензии клето составляет 1,8-2,5 о.е. (длина волны 540 нм).

Культуральную жидкость охлаждают до +4°С и центрифугируют на проточно центрифуге типа ЦЕПА при 2,5-10 об/ /мин. Полученную биомассу-хранят при -20°С. Выход сырой биомассы 2,5- ,.) 3,5 г/л культуральной жидкости.

II. Для выделения и очистки рест- риктаз используют следующую аппаратуру: ультразвуковой дезинтегратор УЗДН-2Т, центрифугу Бекман Ж21Ц, холодильную камеру Миниколдлаб, хро- матографические колонки, термостат, аппарат для электрофореза, универсальный источник питания.

ДНК фага лямбда выделена по известной методике (Salto Н., Miura K.I. Biochem. Biophys Acta, 1963, 72, 619-629).

При разрушении клеток и хроматографии используют буферньй раствор (В): 10 мМ калийфосфатный буфер рН 7,4, содержащий 10 мМ 2-меркапто- зтанола.

Активность рестриктаз тестируют методом гидролиза ДНК фага лямбда с последующим . разделением полученных фрагментов электрофорезом в агароз- ном геле. Реакционная смесь для гид ролиза ДНК фага лямбда рестриктазой Hin 1 I содержит 10 мМ трис-НС1 рН 8,5, 25 мМ NaCl, 5 мМ MgCl , 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37°С 5 мин. Реакционная смесь для гидролиза ДIiK фага лямбда рестриктазой Hin.1 II содержит 10 мМ трис-НС рН 8,Ь, 50 мМ NaCl,, 10 MM.MgCli, 100 мкг/мл альбумина бычьей сыворотки, 2 мкг ДНК фага лямбда в 40 мкл смеси и 5 мкл фермента.

Реакцию проводят при 10 мин

Электрофорез проводят в О,1 М натрийборатном буфере рН 8,2, 2 мМ ЭДТА в течение 2 ч при напряжении 101Э В и силе тока 100 мА. Окрашенны этидийбромидом (1 мкг/мл) гели просматривают в УФ-свете.

g

0

5

О

5

0

5

0

5

За условную единицу активности принимается то.количество фермента, которое в оптимальных условиях за 1 ч полностью .расщепляет 1 мкг ДНК фага лямбда.

Все операций по выделению и очистке фермента проводят при .

1..Разрушение клеток. 30 г биог. массы, полученной при культивировании Н. influenzae RFL I суспендируют в 100 мл буфера В, содержащего 0,1 М NaCl, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН72Т в течение 15 мин и центрифугируют при 20000 об/мин на центрифуге Бекман Ж-21Ц, ротор ЖА-20.

2. Хроматография на фосфоцеллюло- зе. Полученный бесклеточный экстракт со скоростью 30 мл/ч наносят на колонку размером 2,5 15 см с фосфо- целлюлозой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,1 М NaCl. Колонку промывают 150 мл того же буфера и элюируют линейным градиентом NaCl от О,1 до 1,0 М в 500 мл буфера В. Отдельно собирают фракции, элюируе- мые при 0,25-0,36 М NaCl, содержащие основную часть активности рестрикта- зы Hin 1 I, и фракции, элюируемые при 0,58-0,7 М, содержащие активность рестриктазы Hin 1 II. Далее очистку рестриктаз Hin 1 I и Hin 1 II проводят отдельно.

3.1.Очистка рестриктазы Hin 1 I.

3.1.1.Фракционирование белков на голубой сефарозе.

Фракции, содержащие активность рестриктазы Hin 1 I, объединяют и диализируют в течение 16 ч против буфера В, содержащего 0,2 М NaCl. Фёрментньш раствор после диализа со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером l, см с голубой сефа- розой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 М NaCI, и промывают 60 мл того же буфера. Собирают элю- эт, содержащий основную часть рест- риктазной активности (фракции I).

3.1.2.Хроматография на гепарин- сефарозе.

Фракцию 1 со скоростью 20 мл/ч наносят на колонку размером 1, см с гепаринсефарозой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,2 М NaCl, промывают тем же буфером (30 мл) и элюирУют линейным градиентом концентрации NaCl от 0,2 до 0,6 М в 240 мл буфера В. Фракции, злюируемые

/1458388

1;|ри 0,3-0,4 М NaCl, объединяют и фер- этими рестриктазами

Ментный препарат концентрируют путем диализа против буфера В, содержащего и,1 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА и 50% -гли- Церина (по объему). Ферментньй препарат хранят при -20 С. Из одного 1 рамма биомассы получают 15000 еди- Йиц активности рестриктазы Hin 1 I.

3.2. Очистка рестриктазы Hin 1 II. ю

: 3.2.1. Хроматография на ДЭАЭ-цел- Люлозе.

i Фракции, содержащие активность 11естриктазы Hin 1 II, объединяют и д: иализиру1от в течение 16 ч против буфера В. После диализа раствор фер1ента центрифугируют при 20000 об/мин

электрофореграммы совпадают с элект- рофореграммой, полученной послеоб- работки ДНК фага лямбда только рест- риктазой Hin 1 I. Это указывает на то, что эти рестриктазы являются изошизомарами, т.е. расщепляют последовательность нуклеотидов 5 GPuCGPyC- 3 Для подтверждения узнаваемой последоватетшности нуклеотидов и определения места расщепления проводили частичный гидролиз 5- Р мечен- л ных Hin 1 I фрагментов ДНК pBR322. 15 Двухмерное разделение полученного

гидролизата электрофорезом на ацетил- целлюлозе и гомохроматографией в тонком слое ДЭАЭ-целлюлозы привело к фингерпринту, из которого выявлено.

на центрифуге Бекман Ж-21Ц, ротор )|СА-20.

Полученный супернатант.со скорое- 20 что гомологичной последовательностью 20 мл/ч наносят на колонку разме- в участке расщепления являются тетоом 1,5 15 см с ДЭАЭ-целлюлозой, фавновешенной буфером В промывают ТИМ же буфером (80 мл) и элюйруют ллнейным градиентом ЫаС1 от О,О до ,5 М в 280 мл буфера В. Фракции, флюируемые при 0,04-0,12 М NaCl, Объединяют; они .содержат, основную Часть рестриктазной актиззности (фрак1|1ИЯ 1 ) .

3.2.2. Хроматография на.гепарин- (Ьефарозе. ,

Фракцию 1 со скоростью 20 мл/ч на- liocHT на колонку размером Г, см С гепаринсефарозой, уравновешенной буфером В, содержащим 0,1 М NaCl, промывают 30 мл того же буфера и Ьлюируют линейным градиентом концен- |грации NaCl от 0,1 до 1 ,0 М в 120 мл буфера В, Фракции, элюируемые при 0,68-0,8 М NaClj объединяют И ферментный препарат концентрируют путем Диализа против буфера В, содержащего 0,1 М NaCl, 0,1 мМ. ЭДТА и 50% глицерина (по объему) Ферментный препарат хранят при . Из одного грамма биомассы получают 1000 единиц активности рестриктазы Hin II.

Определение последовательностей

рануклеотиды 5 -CG(T/C)G-3 . Следовательно, рестриктаза Hin 1 I раст щепляет узнаваемый участок между

25 вторым и третьим основаниями, образуя фрагменты с 5 -выступающими липкими концами:

5 -GPuCGPyC--3 ; 3 CPyGCPuG-5 ,

30 Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Hin 1 II, использовали ДНК фагов 01 74, fd и плазмиды pBR322 с известной первичной структурой. Их обра35 батывали рестриктазой Hin 1 II и полученные данные о числе и длине фраг ментов сравнивали с табличными (Fucbs С. et al Gene (1978), 4, 1-23 Fuchs С. et al Gene, 1980, 10, 35740 370). Сравнение этих результатов поз волило обнаружить, что последователь ность нуклеотидов 5 -C.ATG, узнаваема рестриктазой Nla III, имеет такую же частоту встречаемости на использован

45 ных субстратах, как и Hin 1 II. Из этого делали предположение, что рест риктаза Hin 1 II Обладает идентичной субстратной специфичностью с рестрик тазой Nla III. Око нчательное подтвер

нуклеотидов, узнавае1 ых рестриктаза- 50 ждение специфичности исследуемой ми Hin I и Hin 1 II.рестриктазы было получено после опДля определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Hin 1 I, использовали ДНК фага лямбда. Проведено расщепление этой ДНК рестриктазой Hin 1 I, рестриктазой А ha II (которая узнает VL рас щепляет последовательность нуклеоределения места расщепления субстрата. Для этого использовали самокомплементарный синтетический декадвзок- 55 синуклеотид, содержашр;й участок, уз- наваемый исследуемым ферментом:

тидоя З -GPuCGFyC-З ) и совместно

5 -GCG

3 -CGC

GCG.

этими рестриктазами

Во всех случаях

электрофореграммы совпадают с элект- рофореграммой, полученной послеоб- работки ДНК фага лямбда только рест- риктазой Hin 1 I. Это указывает на то, что эти рестриктазы являются изошизомарами, т.е. расщепляют после довательность нуклеотидов 5 GPuCGPyC- 3. Для подтверждения узнаваемой последоватетшности нуклеотидов и определения места расщепления проводили частичный гидролиз 5- Р мечен- л ных Hin 1 I фрагментов ДНК pBR322. Двухмерное разделение полученного

гидролизата электрофорезом на ацетил- целлюлозе и гомохроматографией в тонком слое ДЭАЭ-целлюлозы привело к фингерпринту, из которого выявлено.

что гомологичной последовательностью в участке расщепления являются тетрануклеотиды 5 -CG(T/C)G-3 . Следовательно, рестриктаза Hin 1 I раст щепляет узнаваемый участок между

вторым и третьим основаниями, образуя фрагменты с 5 -выступающими липкими концами:

5 -GPuCGPyC--3 ; 3 CPyGCPuG-5 ,

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Hin 1 II, использовали ДНК фагов 01 74, fd и плазмиды pBR322 с известной первичной структурой. Их обрабатывали рестриктазой Hin 1 II и полученные данные о числе и длине фрагментов сравнивали с табличными (Fucbs С. et al Gene (1978), 4, 1-23; Fuchs С. et al Gene, 1980, 10, 357370). Сравнение этих результатов позволило обнаружить, что последовательность нуклеотидов 5 -C.ATG, узнаваемая рестриктазой Nla III, имеет такую же частоту встречаемости на использованных субстратах, как и Hin 1 II. Из этого делали предположение, что рестриктаза Hin 1 II Обладает идентичной субстратной специфичностью с рестриктазой Nla III. Око нчательное подтвер50 ждение специфичности исследуемой рестриктазы было получено после определения места расщепления субстрата. Для этого использовали самокомплементарный синтетический декадвзок- 55 синуклеотид, содержашр;й участок, уз- наваемый исследуемым ферментом:

5 -GCG

3 -CGC

GCG.

После введения - концевой метки двухспиральный субстрат обрабатывали рестриктазой Hin 1 II и меченные продукты рестриктазной реакции анализировали в тонком слое ДЭАЭ- целлюлозы. В параллельной дорожке анализировали частичный 3 -экзонук- леазный гидролизат этого же меченно го декануклеотида, входящего в состав исследуемого дуплекса. Единственным меченным продуктом расщепления оказался гептануклеотид 5-- pGCGCATG Полученные результаты свидетельствуют, что рестриктаза Hin 1 II расщепляет субстрат

З -САТС З ;

3 -GTAC-5 ,

f .

в местах, указанных стрелками. Формула изобретения

Способ получения эндонуклеаз-рест- риктаз, обладающих способностью узнавать и расщеплять последователь- .ности нуклеотидов 5 -GPuCGPyC-3 и |Ь -САТС-3 , включающий культивирование продуцента до достижения заданной n iOTHOCTH клеток на жидкой питательной среде, содержащей сердечно- мозговой экстракт и факторы биосинте- }.

за фермента, разрушение клеток ультп развуком и последующее получение целевого продукта с использованием хрома тог рафич ее кой очистки на фосфоцел люлозе в калийфосфатном буфере и элюции ферментов градиентрм хлористого натрия j отличающий- с я тем, что, с целью упрощения

0 способа получения и повьшения выхода целевых продуктов, в качестве продуцента используют штамм Haemophilus influenzae ВКПМ В-4035, после хрома- тографической очистки рестриктаз,

5 разделяющихся на фосфоцеллюлозе, осуществляют дополнительиую очистку дли рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотндов 5 - -GPuCGPyC-З , путем хроматографии

0 на голубой сефарозе и гепаринеефаро- зе с элюцией фермента буфером, содержащим 0,2 М NaCl, при хроматографии на голубой сефарозе и градиентом NaCl 0,2-0,6 М при хроматографии на

25 гепаринсефарозе, а хроматографичес- кую очистку рестриктазы, узнающей и расщепляющей последовательность нуклеотидов 5 -CATG 3 , осуществляют на ДЭАЭ-целлюлозе и гепаринсефарозе

30 с злюцией фермента градиентом NaCl 0,0-0,5 М и 0,1-1,0 М NaCl соответственно.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, к способам получения фермента, специфически расщепляющего даК. Рестриктазы могут быть использованы для исследования первичной структуры ДНК и в i генной инженерии. Цель изобретения - упрощение способа получения и повышение- выхода целевых продуктов. Способ заключается в том, что в качестве продуцента рестриктаз используют штамм Haemophilus influenzae RFL I (BiaiM B-4035). Культивирование проводят в условиях аэрации на питательной среде до достижения оптической плотности суспензии клеток 1,8-2,5 о.е. Клетки разрушают ультразвуком, центрифугируют и проводят очистку ферментов из полученного бесклеточного экстракта путем хро матографии на фосфоцеллюлозе с последующей очисткой рестриктазы Hin И на голубой сефарозе и гепаринсефарозе и хро- матографической очисткой рест риктазы Hin III на ДЭАЭ-целлюлозе и гепаринсефарозе. При использовании способа получают высокие выходы высокоочищенных рестриктаз. Hin II и Hin III