Штамм @ @ ТЭПВ-4 для идентификации энтеропатогенных НАГ-вибрионов 4-го фаготипа Советский патент 1984 года по МПК C12N7/00 

INO СП

Изобретение относится к медицинской микробиологии, а именно к диагностическим фагам, применяемым для ускоренной идентификации возбудителей острых кишечных заболеваний, не агглюминирующихся. холерной О-I сывороткой энтеропатогенных НАГ-вибрионов методом фаготипирования.

Известен штамм Phagum Nag 907/2062, обладаюш,ий активностью в отношении Nag-вибрионов 05 серовара, не относяш,ихся к 01 группе 1.

Известен также штамм Phagum cholericum-77 УП серотипа специфически активный к штаммам НАГ-вибрионов 0-56 серовара 2.

Однако известные штаммы специфичны только в отношении штаммов 05 и 56 серовара и не действуют на остальные серовары НАГ-вибрионов.

Целью изобретения является создание штамма фага для идентификации НАГ-вибрионов 4-го фаготипа.

Цель достигается с помошью штамма Phogum cholericum ТЭПВ-4.

Штамм Phagum cholericum ТЭПВ-4 выделен путем селекции из популяции холерного эльтор-фага IX серотипа. Депонирован и хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского научно-исследовательского института вакцин и сывороток МЗ СССР под номером Ф-111. Он используется для идентификации энтеропатогенных, не относящихся к 0-1 группе НАГ-вибрионов 4-го фаго типа методом фаготипирования.

Штамм характеризуется следующими свойствами.

Морфологические признаки.

Фаг ТЭПВ-4 относится к III гомологическому ряду. Частицы фага состоят из головки гексагональной формы размером 650x605 А и короткого отростка 135 А.

Штамм Phagum cholericum ТЭПВ-4 относится к IX серологическому типу холерных фагов.

Специфичность. Штамм Phogum choleriijum ТЭПВ-4 специфически активен к штаммам энтеропатогенных не относяшихоя к О-1 группе НАГ-вибрионам 4-го фаготипа, выделяемых от больных ОКЗ, из сточных вод и реже из открытых водоемов различных регионов, в большинстве которых они занимают второе место после штаммов НАГ--вибрионов 1-го фаготипа. Он абсолютно инактивен к штаммам V. parahacmolyticus. V. alginolyticus и к штаммам других видов вибрионов и близкородственным им Микроорганизмам: Aeromonas, Conamonas, Pseudomonar, Bacteriaceae (Schigeila, Salmonella, scherichia и др.).

Физиологические признаки. Фаг ТЭПВ-4 активен, главным образом, в отношении вирулентных штаммов вибрионов эльтор и НАГ-вибрионов 14, 34, 41 и 43 сероваров.

находящихся в шероховатой форме, что и определяет умеренную степень вирулентности последних.

Оптимальная множественность инфицирования микробной клетки 0,1-0,2 при плотности посевов I...к./мл. Полный лизис в жидкой среде при указанном соотношении наступает через 3-5 ч инкубации при 37°С.

Физические свойства. В жидком видепри 4-10°С хранится 2 г, что делает его удобным для транспортировки.

Для получения штамма Phogum cholericum ТЭПВ-4 применяют специально подобранные эталонные штаммы Vibrio Nag

442 или Vibrio eltor 75 М.

Размножение фага ТЭПВ-4. Культуру штамма-продуцента Vibrio Nag 442 или Vibrio eltor 75 М отсевают на пластинку агара Мартена: рН 7,2-7,6 из 3-4-часовой бульонной культуры. Через 18-20 ч инкубации при 37°С готовят i-2 млрд. взвесь агаровой культуры в бульоне и 0,5-1,0 мл ее вносят во флакон со 100-150 мл того же подогретого в термостате при 37°С бульона. Посев подращивают 2-3 ч при

37°С до концентрации 5.10®м.к./мл. Исходя из оптимальной множественности инфекции (1:1 или 1:2), добавляют сюда маточный фаг в бульон с культурой. Смесь фага с культурой быстро переносят в бутыль (с помощью вакуума), содержащую 1 -1,5 л

также подогретого при 37°С бульона Мартена, с рН 7,2-7,6. Все содержимое бутыли инкубируют в термостате при 37°С и периодически помешивают.

За посевом ведут наблюдение. Нарастание мутности бульона свидетельствует о продолжающемся росте и размножении культуры .микробного штамма. Через ч наступает просветление бульона с посевом на 3+ или 4-f; это указывает на необходи-мость прекращения инкубации. Содержимое фильтруют через стерильные фарфоровые свечи Л-3 или Л-5 либо через асбестовые пластины «СФ.

Отфильтрованный препарат проверяют на стерильность, активность и специфичность диапазона литического действия по методикам согласно Приказу МЗ СССР К° 192 от 19.02.79 г и разливают в ампулы по 2 мл. Препарат жидкий, хранят при

4-10°С.

Штамм Phagum chalericum ТЭПВ-4 применяют для диагностики и идентификации 4-го фаготипа энтеропатогенных НАГ-вибрионов при их фаготипировании в разведениях 10°-10 . Расплавленный и остуженный до 45-50°С 1,5--2% агар на любой основе (Мартена, Хоттингера, МП) рН 7,4-7,6 разливают в стерильные чашки Петри по 20-25 мл и после застывания подсушивают 30 мин при 37°с. В пробирки с 3 мл 0,7% агара, рН 7,2-7,6 расплавленного на водяной бане и остуженного до 45°С, добавляют 0,2-0,3 мл 3-4 часовой бульонной культуры испытуемого штамма НАГ-вибриона, тш,ательно смешивают и быстро выливают на агаровую пластинку в чашку Петри. После его застывания на газон культуры платиновой петлей 2 мм или репликатором наносят указанный фаг из всех разведений. После подсыхания капель чашку закрывают крь1шкой, переворачивают вверх дном и инкубируют при 37°С. В случае необходимости получения ускоренного ответа результат учитывают через 3-4 ч, а при плановом обследовании допускается и позже, в пределах 18-20 ч. Оценку литического действия фага ведут по 4-балльной системе: 4+ - сливной полный лизис; 3+ - множественные негативные колонии фага или полный лизис со следами вторичного роста культуры вибриона; 2+ - изолированные негативные колонии фага (не менее 10) или пятно лизиса со значительным ростом вторичной культуры вибриона. Положительным считают лизис культуры от капли фага любого разведения не ниже 2 + . Использование изобретения позволяет дополнить комплект нового препарата фагов ТЭПВ для ускоренной диагностики возбудителей ОКЗ у людей методом фаготипирования энтеропатогенных НАГ-вибрионов в качестве компонента, идентифицируюш.его штаммы только 4-го фаготипа.

Штамм Phagum cholericum ТЭПВ-4, Ф 111 (Коллекция бактериофагов Тбилисского научно-исследовательского института вакцин и сывороток МЗ СССР), используемый для идентификации энтеропатогенных НАГвибрионов 4-го фаготипа.