СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БАКТЕРИОФАГОВ ПАРАГЕМОЛИТИЧЕСКИХ ВИБРИОНОВ III, IV, V МОРФОГРУПП ОТ ФИЛАМЕНТОЗНЫХ БАКТЕРИОФАГОВ I МОРФОГРУППЫ Российский патент 2006 года по МПК C12Q1/00 C12N7/00 C12R1/63 

Предлагаемое изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике холеродизентериеподобных заболеваний, вызываемых парагемолитическими вибрионами.

У парагемолитических вибрионов известны диагностические фаги I, III, IV, V морфологических групп по отечественной классификации А.С.Тихоненко (1968 г.). Однако в настоящее время существует проблема в бактериологической диагностике V. parahaemolyticus, связанная с необходимостью простым и надежным методом проводить идентификацию специфичности фагов возбудителя посредством тест-штаммов.

Известен способ дифференциации эпидемических и неэпидемических холерных вибрионов эльтор, несущих гомоиммунные умеренные фаги III гетероиммунной категории (см. СССР, авт.св. №1558987, кл. С 12 Q 1/02, С 12 R 1/63, БИ №15, 1990 г.), заключающийся в использовании тест-штаммов Vibrio cholerae KM-20, Vibrio cholerae КМ-21 и Vibrio cholerae eitor KM-22, при этом рестрикционный профиль фага определяют путем инкубирования фильтрата культуральной жидкости исследуемых холерных вибрионов, содержащего фаг, с каждым тест-штаммом, и по чувствительности фага к тест-штаммам дифференцируют эпидемические и неэпидемические холерные вибрионы.

Однако использовать известный способ для дифференциации парагемолитических бактериофагов не представляется возможным, он применим только к гомоиммунным холерным умеренным фагам III гетероиммунной категории, т.к. парагемолитические фаги обладают специфичной активностью и лизируют только свои фаги V. parahaemolyticus.

За прототип выбран штамм фага Vibrionis parahaemolyticus Ф-139 для фагодиагностики парагемолитических вибрионов серотипа О5:К15 (см. СССР, авт.св. №1671690, 22.04.91 г.), используемый в качестве тест-штамма для размножения этого фага IV морфогруппы.

Недостатком этого штамма является его лизабельность одним типом фага в связи с тем, что он относится к серотипу О5:К15. При этом существует до 12 серовариантов по О-антигену и около 60 по К-антигену штаммов V. parahaemolyticus, для их идентификации применяют другие фаги (I, III, IV, V морфогрупп). Принадлежность известного штамма V. parahaemolyticus к серотипу О5:К15 не позволяет использовать его в качестве штамма-продуцента для существующих диагностических бактериофагов и их дифференциации, что снижает эффективность лабораторной диагностики.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в повышении эффективности за счет изыскания новых тест-штаммов Vibrio parahaemolyticus, позволяющих проводить дифференциацию бактериофагов парагемолитических вибрионов.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов, III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогруппы, используют тест-штаммы Vibrio parahaemolyticus KM 97 и KM 184, каждый из которых отдельно засевают в бульон Мартена с 3% NaCl, помещают в термостат на 4 часа, затем по 0,3 мл взвеси, полученной из каждого выросшего тест-штамма, смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного полужидкого агара Мартена с 3% NaCl, полученную смесь выливают вторым слоем на чашки Петри с застывшим плотным агаром Мартена с 3% NaCl, после застывания агар подсушивают и в центр каждой чашки наносят каплю исследуемой пробы, содержащей бактериофаг, посевы термостатируют в течение 24-48 часов, далее определяют наличие лизиса на выросших культурах тест-штаммов и по наличию лизиса на культурах тест-штаммов КМ 97 и КМ 184 дифференцируют бактериофаги парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп, а по наличию лизиса только на культуре тест-штаммма КМ 184 - филаментозные бактериофаги 1 морфогруппы.

Для осуществления способа используют два штамма.

Штамм Vibrio parahaemolyticus (P-14706) депонирован под номером КМ-97 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Клетки имеют вид грамотрицательных полиморфных слегка изогнутых, преимущественно овоидной формы палочек. Подвижные (при выращивании в 0,3% щелочном агаре с 3% NaCl наблюдается помутнение столбика агара), при просмотре в электронном микроскопе - монотрихи.

На плотных средах - 1,5% агар Мартена с 3% NaCl вибрионы образуют через 18 часов роста при 37°С колонии нескольких видов: правильной округлой формы, плоско-выпуклые с влажной, блестящей поверхностью, ровным или слегка волнистым краем, различные по степени мутности и по величине. Размеры колоний колеблются от 1 до 3,5 мм.

В жидких средах - на бульоне Мартена с 3% NaCl клетки вызывают помутнение с нежной пленкой, штамм не дает роста в 1% пептонной воде с 7-10% NaCl.

Биохимические свойства.

Штамм разлагает глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, маннозу, маннит, мальтозу с образованием кислоты без газа, не ферментирует сахарозу, декарбоксилирует лизин, не расщепляет аргинин, не образует сероводород (ацетилметилкарбинол).

Штамм лизируется диагностическим фагом парагемолитических вибрионов (ДГФ), производимым в Ростовском противочумном институте. Холерными фагами - классическим и эльтор, ХДФ-3, 4, 5, фагами ТЭПВ-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 - не лизируется.

Штамм не агглютинируется холерными агглютинирующими сыворотками "О", Огава, Инаба, RO.

Антигенные свойства штамма не определялись. Штамм не содержит гена токсинообразования (vct^-).

Генетические особенности штамма: нелизогенный, чувствительный к фагам парагемолитических вибрионов различных морфологических групп (III, IV, V).

Культура Р-14706 используется в качестве штамма-продуцента для размножения монофагов, входящих в состав поливалентного препарата ДГФ и выделения фагов из культур, чувствителен к фагам парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп.

Штамм Vibrio parahaemolyticus (P-18575) депонирован под номером КМ-184 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Штамм растет на агаре и бульоне Мартена, содержащих 3% NaCl (pH 7,6-7,8). Штамм состоит из грамотрицательных полиморфных слегка изогнутых, преимущественно овоидной формы палочек. При выращивании на 1,5% агаре Мартена с 3% NaCl вибрионы образуют через 18 часов роста при 37°С колонии нескольких видов: правильной округлой формы, плосковыпуклые, с влажной блестящей поверхностью, ровным или слегка волнистым краем, различные по степени мутности и по величине. Размеры колоний колеблются от 1 до 3,5 мм. В бульоне с 3% NaCl растущие бактерии вызывают помутнение с нежной пленкой.

Биохимические свойства.

Штамм разлагает с образованием кислоты без газа глюкозу в аэробных и анаэробных условиях, маннозу, маннит, арабинозу, мальтозу, не расщепляет сахарозу, лактозу. Прототроф декарбоксилирует лизин, не расщепляет аргинин, не образует сероводород, ацетилметилкарбинол. Штамм лизируется диагностическим фагом галофильных вибрионов (ДГФ), разработанным в Ростовском-на-Дону противочумном институте. Устойчив к холерным фагам - классическому и эльтор, ctx^- и ctx⁺, фагам ТЭПВ - 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7. Лизируется гомологичным фагом 13676/2. Штамм не агглютинируется холерными сыворотками «О», Огава, Инаба, RO. Штамм не содержит гена токсинообразования (vet^-), нелизогенный, чувствителен к фагам парагемолитических вибрионов различных морфологических групп (I, III, IV, V), является тест-штаммом для размножения филаментозных фагов галофильных вибрионов.

При исследовании надосадочных жидкостей 184 штаммов V. parahaemolyticus было обнаружено, что на газонах парагемолитических тест-штаммах КМ 97 и КМ 184 (см. таблицу 1) фаги размножались и образовывали негативные колонии. Биологические свойства штаммов были типичными для парагемолитических вибрионов.

Важной отличительной особенностью тест-штаммов V. parahaemolyticus KM 97 и KM 184 является лизабельность KM 97 наиболее распространенными бактериофагами III-IV-V морфогрупп, а штамма КМ 184 бактериофагом I морфогруппы. Штаммы пригодны для получения диагностических фагов в экспериментальных и производственных условиях. С их помощью осуществляется разграничения фагов III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогруппы. В виду того, что КМ97 лизируется фагами имеющими головку и отросток, а КМ 184 - филаментозными фагами. Штаммы КМ 97 и КМ 184 лизируются только парагемолитическими фагами и резистентны к фагам других представителей семейств Vibrionaceae, Pseudomonadoceae, Enterobacteriaceae (см. таблицу 2).

Осуществление способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

При исследовании проб воды прибрежной зоны моря на наличие бактериофагов парагемолитических вибрионов используют тест-штаммы КМ 97 либо КМ 184.

Исследуемые пробы предварительно подвергают фильтрации через фарфоровые фильтры с ф5.

Культуры тест-штаммов КМ 97 и КМ 184, каждого в отдельности засевают с 3% NaCl и помещают в термостат на 4 часа. Затем 0,3 мл каждой из выросших тест-культур смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают вторым слоем на пластинки застывшего 1,5% агара Мартена с 3% NaCl в чашках Петри. После застывания агар подсушивают и в центр наносят пипеткой фильтрат исследуемой пробы. Посевы оставляют при 37°С на 24-48 часов. При просмотре посевов наблюдают на чашках:

- присутствие КМ 97 вызывает на поверхности образование литического пятна, что говорит о присутствии фагов III, IV, V морфогрупп и отсутствие лизиса фагов I морфогруппы;

- присутствие КМ 184 вызывает на поверхности образование литического пятна, что говорит о присутствии фагов I, III, IV, V морфогрупп и подтверждает присутствие бактериофагов I морфогруппы.

Таким образом, если фаг размножается на V. parahaemolyticus KM 184 и подавляется на V. parahaemolyticus KM 97, то можно с уверенностью утверждать, что данный фаг является филаментозным (I морфогруппы). Напротив, если в подобных условиях фаг размножается на V. parahaemolyticus KM 97 и KM 184, то мы имеем дело с фагами других морфогрупп (III, IV, V).

Пример 2.

Исследования проводились на выделениях больного гастроэнтеритом. Пробу рвотных масс (или мочи) в объеме 1 мл вносили в пробирку (10 мл) с 1% пептонной водой, выдерживают в термостате 24 часа при 37°С, затем присутствие фагов изучали по технологии описанной в примере 1.

Фаговая дифференциация показала, что лизис присутствовал на тест-штаммах КМ 97 и КМ 184. Следовательно, выделенный фаг относится к фагу состоящему из головки и отростка. Определение длины отростка для фагов III, IV, V морфогрупп проводят с помощью электронной микроскопии.

Пример 3.

В качестве исследуемых материалов были взяты пищевые морепродукты (рыба, креветки, мидии). Предварительно продукты помещали в 1% пептонную воду на 24 часа, одновременно выдерживая в термостате при 37°С, после этого взвесь фильтруют и исследуют по технологии описанной в примере 1.

Полученный лизат фага подтвердил принадлежность его к фагам парагемолитических вибрионов, а именно были получены бактериофаги III, IV, V морфогруппы.

Использование предложенного способа дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов с помощью тест-штаммов КМ 97 и КМ 184 позволяет повысить эффективность лабораторной диагностики, так как простым и надежным способом дает возможность проводить первичную характеристику парагемолитических фагов и классифицировать их по морфогруппам.

Таблица 1Вид микроба№ штаммовОбъект, место и год выделения штаммаНаличие лизогенииАгглютинация в сывороткеФагиО:КДГФ6715531092996V.
parahae molyticusKM 184
(3)Получен в 1990 г. из Крымской ПЧС-Не изучали+++++KM 97 (13)Получен в 1990 г. из Крымской ПЧС-Не изучали+--++KM 183 (67)Получен в 1982 г. из Новороссийской ПЧС+Не изучали+----1553 (Р-16886)Получен в 1989 г. из Бердянской гор. СЭС, вода Азовского моря+Не изучали+----109Выделен в 1990 г. от больного+О5:К15+----2996Выделен в 1990 г. от больного+О6:К18+----

Таблица 2ФагиОбъект выделенияМорфогруппаТест-штаммыАналогПрототипKM 97KM 184V. parahae-molyticus 05:K15V. cholerae 04267ШтаммI-+--616КреветкиIII+++-112, 154,175, 201ВодаIV+++-23, 136, 3256ВодаV++--227ВодаV++--Аналог 155 - О5:К15ШтаммIV+++-

Изобретение относится к медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике холеродизентериеподобных заболеваний, вызываемых парагемолитическими вибрионами гастроэнтеритов. Сущность изобретения заключается в том, что в качестве тест-штаммов используют Vibrio parahaemolyticus KM 97 и Vibrio parahaemolyticus KM 184, которые каждый в отдельности засевают в бульон Мартена с 3% NaCl и помещают в термостат на 4 часа, затем 0,3 мл каждой из выросших на тест-штаммах взвеси смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного до 45°С 0,7% агара Мартена с 3% NaCl и выливают вторым слоем на пластинки застывшего 1,5% агара Мартена с 3% NaCI в чаши Петри. После застывания агар подсушивают и в центр каждой чашки наносят каплю исследуемой пробы, затем посевы выдерживают при температуре 37°С в течение 24-48 часов и по выращенным фагам осуществляют их дифференциацию: присутствие лизина на тест-штаммах КМ 97 и КМ 184 соответствует бактериофагам парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп, а лизис только на КМ 184 подтверждает его принадлежность к филаментозным фагам I морфогруппы. Использование изобретения позволит повысить эффективность лабораторной диагностики (первичную) за счет простоты и надежности способа. 2 табл.

Способ дифференциации бактериофагов парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп от филаментозных бактериофагов I морфогруппы, отличающийся тем, что используют тест-штаммы Vibrio parahaemolyticus KM 97 и KM 184, каждый из которых отдельно засевают в бульон Мартена с 3% NaCl, помещают в термостат на 4 ч, затем по 0,3 мл взвеси, полученной из каждого выросшего тест-штамма, смешивают с 4,5 мл расплавленного и охлажденного полужидкого агара Мартена с 3% NaCl, полученную смесь выливают вторым слоем на чашки Петри с застывшим плотным агаром Мартена с 3% NaCI, после застывания агар подсушивают и в центр каждой чашки наносят каплю исследуемой пробы, содержащей бактериофаг, посевы термостатируют в течение 24-48 ч, далее определяют наличие лизиса на выросших культурах тест-штаммов и по наличию лизиса на культурах тест-штаммов КМ 97 и КМ 184 дифференцируют бактериофаги парагемолитических вибрионов III, IV, V морфогрупп, а по наличию лизиса только на культуре тест-штамма КМ 184 - филаментозные бактериофаги I морфогруппы.