Штамм вкм-а591-продуцент холестериноксидазы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к области микробиологического синтеза ферментов и касается получения штаммов, продуцирующих холестериноксидазу. .Холестериноксилаза, катализирующая превращение холестерина согласно уравнению: холестерин-Ю, - д 4 -холестенон-ьН О может быть применена в препаративной медицинской биохимии для количественного определения холестерина в крови. Применение ферментного препарата в лаборатбрных клинических анализах позволит значительно ускорить проведение анализов крови на холестерин. Известно, что многие микроорганизмы способны использовать холесте рин в качестве единственного источника углерода. В ряде случаев было показано превращение холестерина в холестенон с помощью ферментных пр паратов, J oлyчeнныx из различных микроорганизмов. В настоящее время для получения холестериноксидазы используются преимущественно микроорганизмы рода Nocardia которые выращиваются на средах, содержащих холе терин . Наиболее б.лизким по своей тех ической сущности кизобретению является штамм-продуцент холестериноксидазы, относящийся к виду ProQctinovnyceFerythropoCis 1 . Холестериноксидаэа является внутриклеточным ферментом, поэтому для ее получения клетки микроорганизма-продуцента должны быть разрушены. Клетки нокардий и проактиномицетов трудно разрушаются, так как их клеточные стенки содержат большее количество носков и липидов по сравнению с другими микроорганизмами. Целью изобретения является штамм актиномицетов AcVinomvce, avencJi)Pne ВКМ-А591, образующий внутриклеточную холестериноксидазу. При выращивании Actinomvces на простой среде в течение 20 - 22 ч образуется до 2 г/л сухой биомассы с удельной активностью 1,5 ед/г. Мицелий Aclinomyces eavencl(.)9ae разрушается значительно легче, чем клетки нокардий и проактиномицетов. Кроме того, Actinomvces fovendDPoe обладает антибиотической активностью, что предотвращает.заражение культуры при выращивании в больших объемах.

Предлагаемый штамм был выделен из окультуренной почвы Подмосковья, ,селекционирован и идентифицирован как Aclinomvces tovencJu ae ВКМ-А591. Штамм хранится во Всесоюзной коллекции непатогенных микроорганизмов ИНМИ АН СССР,

Морфология. Типичный актиномицет, имеющий разветвленный мицелий,около 1 мкм в поперечнике, Спороносцы с примитивными спиралями около 0,5 витка, расположены одиночно. Споры овгшные с гладкой оболочкой. .

Культуральные признаки. На агаризованной глюкозоаспаргиновой среде, применяемой для получения активной биомассы,при посеве на чашки Петри .образуют круглые выпуклые колонии с приподнятым центром.Окраска воздушного мицелия в центре колоний Сероваторозовая (цвет лаванды),по перифери серая. Субстратный мицелий темнобурого цвета. На картофельном агаре образуются выпуклые колонии до 100 мм в диаметре с воздушным мицелием светло-серого или белого цвета. Субстратный мицелий светло-бурый. Вокруг колоний на картофельном агаре часто образуются бурые зоны из выделяемых в среду меланоидных пигментов. На ломтиках картофеля коло-нии складчатые, воздушный мицелий скудный, серого цвета, Картофель буреет. На масло-пептонном бульоне образует на поверхности пристеночное кольцо, затем хлопья, выпадающие в осадок,

Хорошо растет на глюкозо-дрожжево среде, образуя колонии до 10 мм в диметре белого или сероватого цвета; воздушный мицелий хорошо развит на 5 сут. по всей поверхности колонийJ. образуется бурый пигмент, выделяемый в среду.

На среде СР-1 Красильникова растет очень хорошо, колонии крупные (до 13 мм в диаметре на 8-10 сут), воздушный мицелий серого или серовато-коричневого цвета хорошо развит по всей поверхности колоний, нижняя сторона колоний темно-бурого цвета.

На среде Чапека с глюкозой растет плохо, образует мелкие (до 5-7 мм в диаметре) полупрозрачные колонии, воздушный мицелий слабо развит, локализован по краям колоний, пигмент не образуется.

На сусло-агаре с 0,5% мела растет медленно,.колонии мелкие (до 5 мм), слабо развитый воздушный мицелий появляется на 7 сут, пигмент не образуется.

Физиологические признаки.Желатину не разжижает. Молоко подщелачи.вает и пептонизирует без коагуляции на 10-12 сут. при 28°С. Сероводород и индол не образует. Нитраты

не востанавливает. В качестве источника углерода потребляет глюкозу, галактозу, мальтозу, глицерин, маннит, лимонную кислоту, хуже растет на, маннозе, фруктозе, рамнозе, янтарной и пирдвиноградной кислотах. Не потреб- ляет ксилозу, инулин, сорбит, инозит, дульцит, эскулин, щавелевую и уксусную кислоты.

Оптимальная температура роста 28 - 30°С. При 20с рост удовлетвори тельный, воздушный мицелий слабо развит. При 37°С рост очень слабый, без воздушного мицелия, при роста нет.

5 Антимикробный спектр.Предлагаемый штамм Actinomvces PavendiuEoe подавляет рост грам-положительных бактерий и слабо активен против грамотрицательных бактерий.

0 Пример. Получение холестериноксидазы из мицелия ActmomvceS, Pavenriluyac ВКМ-А591.

Посевным материалом служит жидкая односуточная культура Aclmomvces tayenciutoe ВКМ-А591, выращенная на среде следующего состава,%: глюкоза 0,5, аспарагин 0,05, дрожжевой экстракт 0,1, рН 7,0-7,2. Выращиваг ние биомассы проводят ферментерах

. объемом 100 л на вышеуказанной среде.

Количество посевного материала составляет 7,0% от-объема среда. Длительность выращивания 22 ч. При таком культивировании получают 2,0 г сухой биомассы из 1л жидкой культуры.

Биомассу, дважды промытую сол шокислым трис-буфером рН 7,9 с добавлением ЭДТА {500 мг на 100 мл), разрушают в замороженном виде под давлением 4000 кг/см.Фермент экстра гируют тем же буфером в течение 24 ч при 5°С и разрушенные клетки удаляют центрифугированием при 20000g в

с течение 30 мин. Из полученного

центрифугата ферментный препарат получают высаливанием сульфатом аммония при насыщении 0,7. Выход холестериноксидазы составляет 1, Ь Е на 1 г сухой биомассы {удельная активность препарата 0,04 Е/мг белка). При этом одна единица активности {1 Е) соответствует образованию 1 мкмоля холестенона в 1 мин при 37°С в следующей реакционной смеси:

5 2,80 мл 0,5 М фосфатного буфера,

рН 7,0; 0,15 мл раствора холестерина в этаноле (с 3,86 мкг/мл), 0,03 мл 2-ТВИН-20 {с г 0,5%), 0,02 мл экстракта мицелия актиномицета.

0 Сопоставление предлагаемого штаг- ма с продуцентом холестериноксидазы Proactinomvce& ervthropofki приведено в таблице.