Способ получения спин-меченых эфиров холестерина или спин-меченого лецитина Советский патент 1984 года по МПК C07J9/00 C07F9/10 

кд

о

01

Изобретение относится к химии природных соеди 1ений, а именно к усовершенствованному способу получения спин-меченых эфиров холестерина и спин-меченого лецитина, которые широко используются в различных биохимических, биофизических и медикобиологических исслрдЬваниях для изучения топографии и функционирования биологических мембран, липидно-белковых.комплексов, липидных дисперсий и пленок, липосом и липопротеинов плазмы, . Известен способ получения спинмеченых эфиров холестерина и спинмечено.го лецитина ацилированйем холестерина и лизолецитина ангидридами спин-меченой карбонрвой кислоты СО« Недостатками этого способа являются низкий выход (50%)целевых продуктов и большая длительность процесса (8-12 ч). Наиболее близким к изобретению по технический сущности и достигаемому результату является способ получения спин-меченых эфиров холестерина или спин-меченого лецитина ацилированйем. холестерина или лизолецитина избытком спин-меченой карбоновой кислоты в присутствии конденсирующего реагента - карбонилдиимидазола при нагревании до 2. К недостаткам этого способа относятся: невысокий выход целевого продукта, не превьшающий 40-50%; требование избытка спин-меченой кислоты необходимость проведения реакции в атмосфере инертного газа, длительное время проведения процесса (6-8 ч J, жесткие условия (продолжительное нагревание до 5 С ), приводящие к заметной деградации исходных продуктов. Цель изобретения - повьшение выхода целевых продуктов и сокращение продолжительности процесса. Поставленная цель достигается согласно способу получения спин-меченых эфиров холестерина или спинмеченого лецитина ацилированйем холестерина или лиэолецитина спин-меченой карбоновой кислотой в присутствии конденсирующего реагента арилсульфотетразолида и нуклеофильного катализатора в среде органического растворителя при комнатной температуре. При этом холестерин или лизоле- цитин, спин-меченую карбоновую кис- П26574 ло кл в 5 зо на ка ра то во то Че пр 15 це ся « 2у, арилсульфотетразолид или нуофильный катализатор используют олярных соотношениях 1;1: 1:2. Процесс проводят следующим обра. Эквимольные количества холестериили лизолецитина, спин-меченой боновой кислоты и арилсульфотетолида высушивают упариванием с уолом, добавляют инертный раститель и 2-кратный молярный избынуклеофильного катализатора. ез 30-60 мин наблюдается полное вращение исходных компонентов в евой продукт. Предлагаемый способ осуществляетпо схеме; О CHjOCOR -Н (СН2)2(%)г о CHjOCOR Х,0 СН20РО(СНз)2(СНз). iffe X. /

-С(СН2)7С(СН2)2СН

Х9

з;

0-N О

R - остаток жирной кислоты.

В предлагаемом способе используют арилсульфотетразолиды: мезитйленсульфотетразолид или 2, 4, 6-три изопропилбензолсульфотетразолид. В качестве спин-меченых карбоновых кислот применяют 2, 2, 5, 5-тетраметилпирролидин-1-оксил-З-карбоновуили 9 2-спиро-4 , 4-диметилоксазолидин-З-оксил)-тридекановую кислоты. Нуклеофильным катализатором служит 4-(| диметиламино )-:-пиридин винерном растворителе {абс.бензЪле, абс. ацетонитриле, абс.хлороформе или их смесях),

Иные: чем эквимолярные соотношения холестерина или лизолецитина, спин-меченой карбоновой кислоты и арилсульфотетразолида приводят к ненужной затрате реактивов и последующим затруднениям в очистке целевого продукта от непрореагировавших исходных компонентов.

.Более чем 2-кратный молярный избытой ну клеофильного катализатора затрудняет выделение и очистку целевого продукта. Использование меньших количеств катализатора приводит к уменьшению выхода и снижению скорости процесса.

В предлагаемом способе впервые для ацилирования холестерина и лизолецитина спин-мечеными карбоновыми кислотами в качестве конденсирующего реагента использованы арилсульфотетразолиды (мезитиленсульфотетразолид или 2, 4, бттриизопропилбензолсульфотетразолид.

Пример 1 . Смесь 116 мг {0,3 ммоль )холестерина, 56 мг(0,3 ммоль ) 2,2,5,5-тетраметилпирролидин-1-оксил-3-карбоновой кислоты сушат упариванием с толуолом, растворяют в 1 мл абс.бензола и 1 мл абс. ацетонитрила, добавляют 83 г (0,39 ммоль J мезитиленсульфотетразолида, 80 мг (0,66 ммоль ) 4-(.диметиламино)пиридина и перемешивают 30 мин.

К смеси добавляют 5 мл бензола, промывают мл насыщентм раствором NaHCOj, мл воды, сушат, упаривают с абс.этанолом, кристаллизуют из зтанола, маточник концентрируют, отделяют выпавшие кристаллы, объединенный продукт кристаллизуют из 96%-ного этанола, сушат в вакууме. Т.пл.158С. Выход 136 мг (0,25 ммоль f, 85%.

Rf ( бензол-.этилацетат ) - 0,53.

Rf (толуол-.зфир 9;1 } - 0,50. Спектр ЭПР (бензол): острый триплет, с(в15,4 ГС, концентрация радикала 5,7 (to,5) 10 спин/моль.

При щелочном гидролизе {1 н. КОН в смеси метанол.вода 4; I, 4 ч кипячения) продукт дает исходную спинмеченую кислоту (К -соль) и холестерин.

П р и м е р 2. Смесь 20 мг (63 мкмоль ) 9-(2-спиро-4,4 -диметилоксазолидин-3 -оксил)-тридекановой кислоты, 25 мг (65 мкмоль холестерина высушивают упариванием с толуолом, растворяют в 1 мл абс. бензола, добавляют 23 мг (68 мкмоль) 2,4,6-триизопропилбензолсульфотетразолида, 18 мг (140 мкмоль) 4-(диметиламино)пиридина, перемешивают 1 ч добавляют 3 мл толуола, промывают мл насыщенного раствора NaHCO,,, 3t2 мл

воды, сущат, упаривают, растворяют

в 0,5 мл толуола и наносят на колонну 1, см SiOj , уравновешенную Толуолом, промывают 12 мл толуола. Желтую фракцию злюируют смесью толуол.эфир 9 fl, упаривают, кристаллизуют из абсолютного метанола, сушат в вакууме. Выход 41 мг (58 мкмоль). Т.пл. 48°С (92%).

Rf (бензолVэтилацетат 9. 1 ) - 0,63.

Rf (толуол-.эфир- 9 ; I ) - 0,67.

Спектр ЭПР (бензол)Ь острый триплет, а0.15,4 ГС, концентрация радикала 5,9(tO,5) 10 -спин/моль. П р и м е р 3. Смесь 20 мг

(63 мкмоль .) 9-(2-спиро-4 ,4-диметилоксазолидин-З-оксил )-тридекановой кислоты, 40 мг (около 70 мкмоль) лизолецитина высушивают упариванием с толуолом, добавляют 1 мл абс.ацетонитрила, 20 мг (80 мкмоль) мезитиленсульфотетразолида 24 мг ( 200 мкмоль) 4-(диметиламино)-пиридина и перемешивают в эвакуированной колбе 30 мин, затем добавляют 2 мл хлороформа, перемешивают 30 мин, затем

2 мл метанола, .3 мл xлopoфopмa, раствор промывают мл насыщенным раствором КаНСОз, водный слой экстрагируют 3«-3 wi омеси хлороформа и метанола 12М). Объединенный органический слой промывают 312 мл насьпценного раствора Na2SOj/, сушаг Na-SQj,, упаривают со 150 мг SiO, смесь наносит на колонку 1,2«10 см iSiOj , уравновешенную смесью хлороформ-, метанол 4il, промывают 30 мл смеси хлороформ:метанол ,,элюируют желтую зону смесью I хлороформ ij метанол,аммиак (конц.) 12,8ч1. Продукт - гомогенное по ТСХ желтое масло .

Rf (хлороформ.метаноламмиак конц. 65.35. ) - 0,62.

Rf (хлороформ: метанол: вод а -.8 ) - 0,40. .

Спектр ЭПР (метанол}: острый триплет, ад 15,2 гс, концентрация (радикала 5,8 (±0,5 ) Ю спин/моль фосфата.

Продукт полностью гидролйзуется фосфолипазой А яда кобры (Naja naja), давая исходную спин-ме еиую кислоту и лизолецитин (контроль ТСХ I, полностью омыдяется 1 н.. раствором КОН (метанол.вода 4;1).

Выход 60 мг (58 мкмоль. фосфата, 89%.

Таким образом, предпагаемый способ позволяет повысить выход спинмеченых эфнров холестерина и спинмеченого лецитина с 40-50 до 85-92%, сократить продолжительность процесса от 6-8 до 0,5-1 ч.

Кроме того, способ характеризует5 ся сравнительно мягкими условиями, реакции получения целевых продуктов, он прост в исполнении и не требует нагревания, работы в атмосфере инарт- ноги газа, х роведения реакции в ге0 терогенных смесях, что характерно, для известного способа C2J.

Для получения целевых продуктов . не требуется также избытка спин-ме- ченой карбоновой кислоты, что поз5 воляет избежать непроизводительность расходов этого дорогостоящего и труд. нодоступного реагента.

Спин-меченые эфиры холестерина и спин-меченый лецитин используют0 ся для изучения структуры и функции биологических мембран,липопротеинов плазмы крови, для исследования белково-липидных взаимодействий в основных компонентах плазмы крови и их

5 .моделях. Простота получения спинмеченых липидных зоидав с помощью предлагаемого способа позволит шире использовать их в различных исследо- ваниях, в частности для изучения мо0 лекулярных основ таких заболеваний, как атеросклероз и дислипопротеидемии.

. .

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СПИН-МЕЧЕНЫХ Э«ШРОВ ХОЛЕСТЕРИНА ИЛИ СПИН-МЕЧЕНОГО ЛЕ1ЩТИНА путем ацилирования холестерина или лизолецитина спинмеченой карбоновой кислотой в присутствии конденсирующего реагента в среде органического растворителя, отличающийся тем, что, с целью повьшения выхода целевьЬс продуктов и сокращения продолжительности процесса, в качестве конденсирующего реагента используют арилсульфотетразолид и процесс проводят в при-сутствии нуклеофнльного катализатора при комнатной температуре. г 2. Способ по п.1, о т л и ч а ю щ.и и с я тем., что холестерин или &) лизолецитин, спии-меченую карбоновую кислоту, арилсульфотетразолид и нус клеофильный катализатор используют в молярных соотношениях 1:1:1:2,