Способ определения активности гормонов задней доли гипофиза /вазопрессина и окситоцина/ Советский патент 1984 года по МПК A61B10/00 

Изобретение относится к медицине и 6иоло1 и, а именно к способам определения биологической активност гормонов, и может быть использовано при стандартизации препаратов гормо .нов, извлекаемых из головного мозга млекопитающих или птиц. Известен способ определения активности гормонов задней доли гипофиза (вазопрёссина и окситоцина) путем внесения его в культуру лимфоцитов с последукицим учетом количества измененных клеток V|. Однако этот способ обладает низкой чувствительностью. Целью изобретения является повышение чувствительности способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения активности гормонов задней доли . гипофиза (вазопрёссина и окситоцина) путем внесения его в культуру лимфоцитов с последующим учетом количества измененных клеток, испол зуют культуру лимфоцитов, чувствительную к действию гормона, призтом в нее вносят эpитpoциtы кролика и .активность препарата определяют по степени увеличения количества розет кообразующихлимфоцитов. Для определения активности вазопрессина используют культуру лимфоцитов тимуса морской свинки. Для определения активности окситоцина используют культуру лимфоцитов лимфатических узлов морской свинки. Способ выполняется следующим образом. Осуществление способа стало возможным лтпь после того, как, учитыв ранее известный эффект влияния гормонов эадней доли гипофиза на лимфоциты крови в реакции бластной тра сформации, были проведены более широкие лабораторные исследования по влиянию гормонов окситоцина и вазопрёссина на функциональную активт ность клеток различной локализации; тймоцитов, спленоцитов, лимфоцитов крови, костного мозга, лимфатически узлов с учетом их дифференцировки на Т- и В-лимфоциты. Технически рещение поставленной задачи осуществлялось с помощью реакции розеткообразования (связыва ния лимфоцитов с гетерологическими эритроцитами),которая, ввиду просто высокой чувствительности и специфич ности, позволяет надежно и быстро дифференцировать Т- и В-лимфоциты. В результате проведенных испытаний была выявлена высокая чувствительность Т-лимфоцитов лимфоузла к окситоцину и Т-лимфоцитов тимуса к вазопрессину. При бьщо установлено, что при помощи реакции розеткообразования удается обнаружить . изменение функциональной активности клеток при минимальной дозе гормонов, составляющих 5mU(О,0005 М.ед.), Выявленные новые знания и были положены в основу способа стандартизации гормонов задней доли гипофиза по реакции розеткообразования. В качестве биологического объекта использовали культуру лимфоците тимуса и лимфатического узла морской свинки. При стандартизации окситоцина использовали лимфоциты лимфатического узла, а вазопрёссина лимфоциты тимуса (тимоциты), П р им е р. Были проведены лабораторные испытания способа стандартизации гормонов задней доли гипофиза .- окситоцина и вазопрёссина. Методика проведения реакций была следующей. В силиконовые пробирки, содержащие 0,1 мл взвеси лимфоцитов в среде 199 (25 млн/мл), добавляли по 0,1 мл 2,5%-ной взвеси эритроцитов кролика в той же культуральной среде и соответств5тощий гормон в различных дозах так, что.бы концентрация его составляла 50тU, )И, 0,5 mil. В контрольные пробы вносили образцы тех же взвесей лимфоцитов и эритроцитов по О,1 мл и растворитель плацебо.Полученную смесь центрч-. фугировали при 1700 об/мин в течение 5 мин, осадок ресуспендировалн и в камзре Горяева подсчитывали число РОК В табл. 1 показано влияние окситоцина на количество розеткообразующих клеток лимфоузла морской свинки. В табл. 2 показано влияние вазопрёссина на количество розеткорбразующих клеток тимуса морской свинки. Как видно из таблиц, концентраций гормонов равные и больше 5 mU вызывают стабильное увеличение числа tOK по сравнению с контролем, что позволяет рекомендовать дозу 5mU в качестве минимальной для эталонных образцов при стандартизации гормонов, . Сравним степень чувствительности реакции розеткообразования, используемой в предлагаемом способе, и реакцт бласттрансформации, исполь зуемой в прототипе, с помоЧцью показателя удельного отклонения Д, равногоС Дц-АЛоУ ОО% Мк. где о - относительное отклонение, % и - доза гормона,mil ; ) среднее контрольное и опытн значение параметра реакции, соответственно (т.е. средне количество измененных клето приходящееся на каждое 100 сосчитанных клеток), %; AW - абсолютное отклонение. Этотпоказатель -А , представляе собой отклонение (изменение) функци ональной активности клеток, вызываемое единицей дозы препарата, и поз воляет судить о степени влияния гор мона на различные клeткиi В табл. 3 показано изменение фун циональной активности клеток под действием минимальных эффективных д окситоцина и вазопрессина в реакция розеткообразования и бласттрансформации. Из -Табл. 3 видно, что реактивнос клеток, используемых в реакции розе кообразования, на действие испытуемых гормонов значительно превосходит таковую в реакции бласттрансформации ( рвг благодаря чему реакция розеткообразования является более чувствительной к действию данных гормонов и позволяет обнаружить действие меньших доз () 5тУ), нежели реакциябластной трансформации lOOwU). . Таким образом, в предлагаемом способе по сравнению с прототипом для стандартизации гормонов задней доли гипофиза - окситоцина и вазр- прессина, вместо менее чувствительной и более сложной реакции бластнЬй трансмиссии экспериментально подобрана более чувствительная и простая реакция розеткообразования. Вместо определения функциональной активности лимфоцитов крови человека.под действием гормонов по прототипу, в предлагаемом способе, исследуются более чувствительные и просто получаемые лимфоциты тимуса и лимфоузла морской свинки. Порог чувствительности клеток к Действию гормонов по прототипу составляет 0,1 М. (ад. (lOOmU), а в предлагаемом способе - 0,005 М.ед. (5mU ), что свидетельствует о значительно большей чувствительности данного способа по сравнению с известным и создает определенное его преимущество. Предлагаемый способ в отличие от прототипа более прост, не требует стерильности проведения реакции, процесс получения чистой суспензии лимфоцитов .за счет их высокой концентрации в данных органах значительно проще и легче .процесса получения лимфоцитарной суспензии крови. Предлагаемый способ стандартизации требует в 75 раз меньше времени для его осзш|ествления, чем прототип. Кроме того, предлагаемый способ не требует дорогостоящих и дефицит йых материалов для его осуществления, таких,как: фиколл, глутамин, верографин, фитогемагглютинин, антибиотики - пенициллин и стрептомицин, кровь человек, Ч7О также положительно характеризует данный способ. Яа основании выше перечисленного можно рекомендовать данный способ стандартизации гормонов задней доли гипофиза - окситоцина и вазопрессина.

Таблица 1

Таблица 3

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГОРМОНОВ ЗАДНЕЙ ДОЛИ ГИПОФИЗА (ВАЗОПРЕССИНА И ОКСИТОЦИНА) путем внесения его в культуру лимфоцитов с последующим учетом количества измененных клеток, о т п к ч а ющ и и с я тем, что, с целью повьшения чувствительности способа, используют культуру лимфоцитов, чувствительную к действию гормона, при этом в нее ВНОСИТэритроците кролика и 1. активность препарата определяют по степени увеличения количества розеткообразующих лимфоцитов. 2.Способ по п. , о т п и ч а ющ и и с я тем, что для.определения активности вазопрессина используют культуру лимфоцитов тимуса морской свинки. 3.Способ поп.1,отличаю щ и и с я тем, что для определения , .активности окситоцина используют куль уру лимфоцитов лимфатических узлов морской свинки.

ДМ (Mjj - М)

Относительное отклонение

8 I- 100% MK

Удельное отклонение

А - ,

15,00

62,0

12,40