Способ определения активности гормона тимуса в крови Советский патент 1983 года по МПК G01N33/48 

Изобретениа относкася к биохимзги и может быть использовано в медицине, в клинической практике и экспериментальных исследованиях ,Известен способ опрецелекин акгизности гормона Ti-шуса в крови путем выделения сьшороткн крови, удалвкия: из нее ингибитора, гормона тимуса ультрафильтрациэй с г;оследуюгдай постановкой реакции розеткообразовгимя в полученном фильтрата 1J,

Однако известный способ ouj:aj:i,.s.i недостаточно зысоксй ч.у,эст; ительностью.

Целью иаобретенкй VTODO;шекие чувстэительности.

Цель ,цостигавтс: VSM )-с- тл::.; определения активности гормон гкмуса а крози ос лдейтвлягот путйм i-j ...о Ленин сьшоротки крови; удален.f: нее ингибитора гормона у- .:-:У:-фильтрац/ ей с последующей поста-,-/;:кой реакции роэеткообразоБанггя Б :.-лученном фультрате,/ удаление л- нгиб}; тора проводят непосредсгвенно из .ч;:С ви путем ее дефибринации, а ре.з.кцягс розеткообразования ведут в полученной скворот1:е с помош, лнмфс-цт.г.со:о тимуса мадией в присутстаик ,:;кна и по степени ингибирования розе/л--кообраэования определяют актиЕ-цос-уi гормона тимуса,

Способ ос тцествляют слвдую-аилм оо-разом.

Определение актиэности гОрмояа .;,iмуса в крови складыБаетск из сле.ц. этапов работы; эзбор и лефибркнация крови и приготовленке сыворот

ки, приготовление суспензии клеток тимуса .мьшюй, приг-отовление эритроци-рарной суспензии, постановка реакции и ее учет.

Кровь собирают из вены н сухой стерильный :.зприц,, в оьъеме 0,8 1,2 мл к переносят в сухую прооирку, содержащую 4-6 сте5сля;1Ных шарикоз диаметрогм 2 Б-З , О KJvi, пробирку в течение всего времен} поступления в нее крови и 15 мин после этого встряхивают до полной дефибринацпи КРОЕН, Дефибринированвую кровь центвифуги-руют при 3 тыс. об/мин в течение 15 МИН; отбирают сыворотку и готовят различные разведения на среда 199 или другой подходящей средде.

Приготовление суспензии клето-с тимуса, эритропитарной суспензии и постановку реакции проводят ьгзвестным способом,

5ышей любого пола возрастог-х 1-4 мео, измельчают ка холоду п среде длч культур TKaHei (напрм1 :ер ера-де 199) любым подхо:с.щяк сиосс-ьом и клеточную взвесь фильтр:,юг чарй;; тонкую стальную или кйпроьовую сйл-о.ку. Затем клетки двалзды отмывают середой, центрифугируя ири 400g- в те-е- нне З-б MKU и готовят взвесь так

что бел 3 олком и иллилитре средь) содер;лалось 3 О - 1. О лимфоцитов .

Для реакции используют зрг троциf J барана у которые хранят Б растворе .::i,,3Opa и Непосредственно перед ее поотаноЕкой трижды физкологичзскИ)-; р;..створом, центрифугируя при ЗОО р- в течение 6-7 1пиНо Откыj;ua эритроциты суспендируют Б культурс Л-:- ой срйде в кондентрацки 250300 14.i клеток в 1 ffij-i,

лсд реакции,,

В Т1ег;тркфужныэ конические пробир;:::% TiHocH,: по Q,i ivui суспензии тимимес1-:1лх н до 0,1 мл ксследуе;-юи CiiuscpoTKii Е различных раэведений:.; . к одно и то;ке развед-янка сьшоротKv - как iViHHHMyM 3 4 пробирки, В ,,оа-.;уольны« пробирки вмасто сьшоротV:,j -liOCHT ПО О Л МП Среды, КонтролЬ л-ч:: к опьггнаг пробы ставят в термостлт на и суспен | -:и клеток инкуО:-:ру.от ;; тачен-не 30 мин После этого :; по:.оанну раз нс ценных проб добавля4r,f по (1,. :Л J 0М раствора таофиллина л;а средэ, а в другую половину по О ,-1 мл среды. Инкубацию в .:::рмостагз продолжают еще з течение ;-i : г-роб.:1 вынимают из термот;-та, к каждую из них добавляют по О,,. мл приготовленной суспензии эрктрошггоБ . Клетки перемешивают и таптришуг ируют прн 200 CJ- э течение .: г-шн . Клэтсчкье осг.цки в; ;есте с надосадочноя й.кдкостью помещают в холо }. ; грн температуре - 4 °С.

i.fif подс- ета рсзеткообразующих .члеток осадки ресуспендируют На вертикальном ротаторе при скорости вра щенин барабана 10 об/мин з течение

0 5 мин, Зате.ч пипеткой отбирают каплю суспензии и .переносят в счетную камесу (например; камеру Горяева) и ) юд с ч итыи аю.г ч кс л о ро зе тк оо бра з iFOK) во всей камере под

5 iMMKpocKonoi.-. Число РОК представляют --а 10- Т кмсо1.;итов, Сравнивают коли/.ест.ьо РОК в пробах с теофилином н овз него и подсчитсшают ингибирующ.ее действие т:ч:оф 1.рлина в процентах.

.1 JiK iiii-iHocTb гсрмс-а тиГГуса в сьшороткй учитывают по наибольшему разведе1-„к;о ее, которое-, обеспечивает ингибиLUiK РОК те ос и :;.). ном на 50%.

Е табпице г;р ;ведены результаты оп ределения .s:c г ;:;ности гормона тимуса г дефйбрлннрсаанной. мышей. При ..-oi.i ПОЛЬ jCD.riKCb предлагае; 4ым спосо6o:vi :-. .для сравнения - известным спо::обо. с г.р;-;;1-1йнение ; О--антисызоротки О у; ли1.-1С.|Оц:.;тс2 салъ тимэктомирой а иных мы11;ея.. Как видно из таблицы, П;.) 1ре.::;лат аег.юму с г особу гормон тимус:а определяется в сь)оротке при разведении 1;200, то.гда как чузствительиость 1:з;зестного способа аначительно ниже - активность гормона тимуса определяется при разведении сьшоротки . Результаты этого определения свидетельствуют также о том, что дефибринация действительно способствует удалению ингибитора гормона тимуса из сыворотки, так как недефибринированная сыворотка не проявляла специфической гормональной активности ни по предлагаемому, ни по известному способам (см. таблицу).

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ГОРМОНА ТИМУСА В КРОВИ путем вьаделения сьторотки крови, удаления из нее ингибитора гормона тимуса ультрафильтрацией с последующей постановкой реакции роэеткообразования в полученном фильтрате, отличающийся тем, что, с целью повыше;ния чувствительности, удгипение инги битора проводят непосредственно из крови путем ее дефибринации, а реакцию розеткообраэования ведут в полученной сыворотке с лимфоцитов тимуса мьвией в присутствии тёофиллина и по степени ингибирования розеткообраэования определяют актигвность гормона тимуса.

Примечание: каждый показатель представляет среднюю трех

Как показали испытания по предла- Предлагаемый способ обладает высогаемому способу, активность тимуса кой чувствительностью и не треопределяется в сыворотке различных55 бует проведения тимэктомии у кишей видов животных: мышей, крыс, морских и приготовления О-антисыворотсвинок - а также и у человека.ки.

параллельных проб.