Способ получения иммобилизованных холинэстераз Советский патент 1980 года по МПК A61K38/46 C12N11/14 

1

Настоящее изобретение относитсяк области биотехнологии и в частности, к способу получения иммобили зованных холинэстераз, который может быть применен для изготовления высокчувствительных анализаторов для определения отравляющих веществ антихолиэстеразного действия. Такие анализаторы могут быть применены в сельском хозяйстве для определения инсектицидов.

В литературе описан ряд способов получения иммобилизированных на неорганических материалах ферментов, в том числе холинэстераз, включающих обработку неорганического материала

.У -аминопропилтриэтоксисиланом с последующим переводом аминогрупп в такие функциональные группы, которые способны реагировать с функциональными группами молекул ферментов 1, 2.

Недостатком этих способов иммобилизации ферментов является многостадийность процесса получения активных реакционноспособных групп на поверхности неорганического материала.

Известен также -способ получения иммобилизованных холинэстераз на не-i органическом носителе, включающий

активирование неорганического носителя и последующее ковалентное связывание с ним фермента 3. Согласно известному способу, пористое стекло обрабатывают раствором -аминопропитриэтоксисилана в толуоле. Далее аминопроизводное стекла связывают с п-нитробензойной кислотой, полученный нитробензамид восстанавливают и диазотируют. Приводят связывание ацетнлхолинэстеразы с полученным aктивиpoвaнны носителем. При этом выход по активности составляет 0,5%, Полученные препараты иммобилизованно холинэстеразы являютсянестабильными и в течение 10 дней активность иммобилизованного фермента уменьшается в 3 раза. Таким образом, недостатками известного способа иммобилизации холинэкстераз являются многостадийность активирования носителя, малый выход ферментативной активности при иммобилизации и нестабильность полу.ченных препаратов.

Целью описываемого способа является устранение недостатков известного способа, а именно, упрощение способа иммобилизации, увеличение выхода ферментативной активности и по вышение стабильности иммобилизованных холинэстераз. Указанная цель достигается за счет того, что неорганический материал активируют раствором хлористого цианура в органическом растворителе и, после связывания фермента препараты обрабаты вают водным раствором гидроксиламин§

Согласно изобретению описывается упрощенный способ получения иммобилизованных холинэстераз на неорганических носителях, включаквдий активирование неорганического материала и ковалёнтное связывание фермента, с высоким выходом ферментативной активности и повышенной стабильностью иммобилизованных холинэстераз,- заключающийся в том, что неорганичес1 ий носитель активируют раствор хлористого цианура в органическом . растворителе и, после связывания фермента, препараты стабилизируют водным раствором гидроксиламина.

Предпочтительно процесс проводить следующим образом.

Активирование неорганического материала (силикагель, пористое стекло окись алюминия) проводят путем обработки названных материалов 1-5% раствором хлористого цианура в диоксане, ацетоне, хлороформе, или диэтиловом эфире в течение 2-3 ч при комнатной температуре. Количество прореагировавшего с неорганическим материалом хлористого цианура не зависит существенно от растворителя. Обработанный хлористым циануром материал промывают ацетоном, 10-30% раствором уксусной кислоты и водой. Полученный препарат высушивают на ротационном испарителе.

Связывание холинэстераз проводят из раствора фермента в буфере. В случае силикатных носителей (силикагель, пористое стекло) максимальный выход ферментативной активности наблюдается при рН связывания 4,5-6,5, а в случае окиси алюминия - при рН 8,0-8,5. Продолжительность стадии

связывания при комнатной температуре составляет 6-48 ч.

Полученные препараты дважды промывают буфером связывания и обрабатывают 0,2 М раствором гидроксиламина при рИ 8,0-9,0 в течение 2-6 ч. Благдаря этой обработке удаляют непрореагировавшие атомы хлора и существенно повышается стабильность полученных иммобилизованных холинэстераз

Полученные препараты многократно промывают 1,0 М раствором хлористого натрия и хранят в холодильнике во влажном состоянии.

Пример. Навеску окиси алюминия (5,0 г) суспендируют в 20 мл 5% раствора хлористого цианура в диоксан. Через 3 ч избыток раствора дикантируют, препарат промывают дваж диоксаном, дважды 20% раствором уксусной кислоты, многократно водой и три раза ацетоном. Полученный препарат высушивают на ротационном испарителе .

Количество прореагировавшего хлористого цианура определяли спектрофотометрически. С 1 граммом окиси алюминия прореагировало 3 мкмоля хлористого цианура.

Пример 2. Навески активированной, как описано в примере 1, окиси алюминия (0,5 г сухого препарата) суспендируют в 6-миллилитровых порциях буферных растворов (рН 7,2-9,0), содержащих по 9 мг бутирилхолйнэстеразы. Через 24 ч препараты промывают дважды буфером связывания и обрабатывают в течение 3 ч 0,2 М раствором гидроксиламина при рН В,6. После многократного промывания 1,0 М раствором хлористого натрия определяли активность препаратов по скорости гидролиза бромистого бутирилхолина в 0, растворе NaCI в присутствии 4-10м трис-(оксиметил) аминометана. Полученные результаты приведены в табл.1.

рН раствора

7,2 7,6 8,1 8,3 8,6 9,0 связывания 5,4 10,6 10,9 9,0 6,4

ПрИмерЗ. Силикагель марки Силохром-2, активированный по приviepy 1, содержит 2,8 мкмоля хлористого цианура на 1 г носителя. СвязыТаблица 1

вание бутирилхолйнэстеразы и определение ее ферментативной активности . проводят аналогично примеру 2. Результаты представлены в табл.2.