Способ гидролиза целлюлозы Советский патент 1985 года по МПК C08B1/00 C13K1/04 

3

СПОСОБ ГИДРОЛИЗА ЦЕЛЛЮЛОЗЫ, включанщий кислотную обработку целлюлозы, выдерживание смеси и отделение нерастворившейся целлюлозы с последующим ферментативным гидролизом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, обработку целлюлозы проводят смесью концентрированных фосфорной и серной кислот при их соотношении

СО

til ел

9)

сл Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении глюкозы из целлюлозы, такзке для получения целлюлозы, исЪользуемой в качестве сорбента или носителя для иммобилизации разных веществ. Известен способ гидролиза целлюлозы смешиванием ее с одной из концентрированных кислот, например соляиой, серной или фтористоводородной вьц ерживаиием смеси в определенных условиях с последующей нейтрализацие кислоты и очисткой образовавшейся глюкозы от солей 3. Основным недостатком этого способа, препятствующим использованию его в промышленности, является загрязнение продуктов гидролиза целлюлозы солями, для очистки крторых необхоДИМЫ специальные очистные соорз ения Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ декристаллизации целлюлозы. По этому способу целлюлозу размалывают до частиц размером 1 мм и менее, размол смешивают с 80-85%-ным раствором фосфорной кислоты в соотношении 1 вес,ч. целлюлозы на 3-10 об.ч. фосфорной кислоты, в которой содержится псзерхностно-активное вещество в количестве от 0,01 до 0,5 ч. на 100 ч. кислоты, после реакции к смеси добавляют тетрагидрофуран, см шанный с водой в соотношении 30-100 на 1 ч. воды, в количестве 10-50 ч. растворителя на 1 ч, кислоты, осадо углевода отделяют, а раствор, содер жащий смесь фосфорной кислоты, тетр гидрофурана и воды, подвергают рект фикации для повторного использования 23. Недостатками известного способа являются необходимость работы с бол шим объемом органического растворителя и создания технологии регенера ции реактивов во взрыяобезопасном исполнении, потери органического растворителя, достигающие 5-15 объе мов на 1 вес. ч. целлюлозы, а также необходимость использования фторугл родного поверхностно-активного вещества для снижения расхода кислоты за счет смачивания, что загрязняет продукт токсичными фтористыми соеди нениями, и необходимость размола це люлозного сырья. Целью изобретения является упрощение процесса гидролиза целлюлозы. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу гидролиза целлюлозы, включающему кислотную обработку целлюлозы, вьщерживание смеси и отделение нерастворившейся целлюлозы с последующим ферментативным гидролизом, обработку целлюлозы проводят смесью концентрированных фосфорной и серной кислот при их соотношении (3,5-50):1, смесь вьщерживают 1,5-4,5 ч при 30-50С и дополнительно обрабатывают водой при 2-lO°C. Способ осуществляют следующим образом. 1 вес.ч. (в граммах) целлюлозы смешивают с 5-9 объемами, преимущественно 5 (в миллилитрах), смеси концентрированной фосфорной кислоты (ГОСТ 6552-80/7168-80, массовая доля кислоты не менее 85%) и концентрированно серной кислоты (ГОСТ 420Д-77, массовая доля кИслоты лежит в пределах 93,6-95,6%), взятой в соотношении (3,5-50):1, преимущественно (10-50):. Перемешивание проводят при 30-50°С в течение 1,5-4,5 ч. Доба:вка серной кислоты к фосфорной вызьшает умеренную и контролируемую деполимеризацию целлюлозы и образование в качестве промежуточного продукта водонерастворимого углевода, который после обработки водой на холоду становится сильно набухаемым и хорошо фильтруемым. Благодаря добавлению серной кислоты к фосфорной повьштается смачиваемость целлюлозы кислотой, благодаря чему достаточно брать кислоты не более 10 объемов на 1 вес.ч. целлюлозы. После перемешивания к реакционной смбси добавляют холодную воду, предпочтительно со льдом (температура 2-10°С), тщательно размешивают, фильтруют, для промывки повторно добавляют воду с последующим фильтрованием. Полученный нерастворимый продукт после промежуточной стадии высушивания или без нее подвергают ферментативному гидролизу. Возможность применения предлагаемого способа основана на том, что, как обнаружилось в ходе исследований действия кислот на целлюлозу, при определенных условиях на промежуточной стадии кислотной обработки получается продукт, способный давать зернистую, легко фильтруемзпо массу. 3 состоящую из частично деподимеризованной целлюлозы. Эта масса состоит из набухшего в воде полисахарида, в котором отношение воды к углеводу близко к величине 10:1, в котором растворенные в воде вещества (кислота) быстро смешиваются с добавлен ной водой. Этот набухший материал;. образуется уже при добавлении 1 объ ма воды (со льдом) к 1 объему реакционной смеси и путем фильтрования можно отделять кислоту, концентраци которой достигает 30%. Образование такой частично деполимеризованной целлюлозы возможно только в присутствии добавок другой кислоты, например серной. Благодаря этой добавке смешивание целлюлозы с кислотой улучшается, после выдерживания первоначально твердой смеси при ЗО-ЗО С она разжижается, что об легчает ее перемешивание и создает более полный контакт кислоты с целл лозой. Без добавки серной кислоты целлюлоза постепенно набухает в 10 объемах концентрированной фосфор ной кислоты, при этом образуется резиноподобная масса, которая практически не смешивается с водой и, следовательно, отделение углевода от кислоты становится невозможным. Отделить углевод от кислоты из ее смеси с концентрированной фосфорной кислотой добавлением воды можно толь ко в тех случаях, когда смесь этой кислоты с целлюлозой готовят при избытке кислоты, в 4-10 раз превьш1ающем используемые в данном способе. Частично деполимеризованная целлюлоза, полученная предлагаемым способом, не подвергается обратному процессу рекристаллизации, так как она становится легко гидролизуемой под действием ферментов. Даже после вьюушивания, когда ее набухаемость в воде снижается, она сохраняет способность гидролизоваться фермента ми. Пример 1 (контрольньй)|. 10 г хлопкового линта смешивают со 100 мл концентрированной фосфорной кислоты (отношение целлюлозы к кислоте 1:10) через 3 ч смесь превращается в упругую резиноподобную массу, которая после смешивания с 1 л воды сохраняет форму плотных, трудно растираемых комков резиноподобной массы.Материал не пригоден для дальнейшей обработки. 654 П р и м е р 2 (котрольный). 5 г хлопкового линта смешивают с 35 мл концентрированной фосфорной кислоты и 15 мл 70%-ной серной кислоты (отношение целлюлозы к смеси кислот 1:10), оставляют на 4 ч 20 мин. После этого добавляют 20 мл холодной воды и перемешивают. До конца все размешать нельзя, осадок имеет форму нефильтруемых хлопьев. После нескольких промывок водой с декантированием остаток кислоты нейтрализуют аммиаком. Из-за медленной диффузии кислоты из частиц осадка полной ее нейтрализации добиться не удалось. Материал не пригоден для дальнейшей обработки. Пример 3. 50 г хлопкового линта смешивают при 30С с 250 мл концентрированной фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты 1:5), перемешивают 1 ч при 40С и 2 ч при 50°С. Добавляют 50 г льда и 250 мл воды (), фильтруют, обрабатывают повторно водой и фильтруют, промывку повторяют еще 3 раза. Остаток (вес геля 430 г) обрабатывают при и рН 5,0 50 г целловириди- . на ГЗх (соотношение субстрата и фермента около 1:1). Через сутки вся масса становится жидкой, но трудно отделяемой от нерастворившейся части. Измерение восстанавливающих сахаров после трех суток инкубирования в супернатанте показало концентрацию Сахаров 7,5% (в глюкозных эквивалентах), степень конверсии 70%. Пример 4. 5 г хлопкового линта смешивают при с 35 мл концентрированной фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты 1:10), перемешивают, вьщерживают 2 ч 40 минут при 50°С, обрабатывают 50 мл холодной воды (10°С), фильтруют, промывку водой повторяют еще 3 раза получают 50 г набухшей в воде, целлюлозы в виде рассьтчатой темно-серой массы. К ней добавляют раствор 1 г целловиридина ГЗх (соотношение фермента и субстрата около 1:5) в 4,5 мл воды и инкубируют при рН 4,5 в течение двух при 40°С. Получают сироп с концентрацией 4,1%, степень конверсии 46%. Дополнительное вьщерживание осадка при 40°С в течение 6 дней дало сироп с концентрацией восстанавливающих Сахаров 8,2%. Пример 5. Юг линта смешивают с 50 мл концентрированной фосфорной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты (соотношение целлюлозы и кислоты около 1:5) ппи 15-17С. Перемешивают 1,5чпри40°С, добавляют 50 г льда и столько же воды (), тщательно перемешивают, фильтруют на воронке Бюхнера с бумаж ным фильтром, промывку водой повторяют, после нейтрализации набухшую целлюлозу высушивают на воздухе, по лучают 9,3 г препарата. 2 г этого препарата и 1 г целловиридина ГЗх (соотношение фермента и субстрата 1:2) смешивают с 5 мл 0,1 М ацетатного буфера рН 5,Оуинкубируют при ЗОС в течение 2 сут, в супернатанте .получают концентрацию восстанавливаю щих Сахаров 8%. В примерах 3-5 полностью исключены предварительное размельчение целлюлозы, добавки поверхностно-активных веществ, а также использование органического растворителя. Примерб. 50г линта смешивают при 25-30с с 250 мл концентрированной фосфорной кислоты и 5 мл концентрированной серной кислоты (со отношение целлюлозы и кислоты около 1:5), перемешивают 1,5 ч при 30°С и еще 3 ч при , после чего смешивают с 10 л воды, супернатант (око ло 9 л) декантируют, а остаток фильт руют, нейтрализуют, до рН 5-6, высушивают на воздухе при 60-80°С, получают 46 г темного порошка. Пример ы 6а, 6б, 6в. 2 г пр парата, полученного в примере 6, и целловиридин ГЗх (см.таблицу) смеши вают с 8 мл О,1 М ацетатного буфера рН 5,0, инкубируют при 50°С в течение 2 сут., измеряют концентрацию восстанавливающих Сахаров в суперна танте. Пример 6г. 2г препарата, . полученного в примере 6, смешивают с 8 мл раствора 0,1 г целловиридина ГЗх (активность 77 ед/г по бумаге) И 0,01 г пектофоетидина П10х (активHoCTb ПГА/В 28 ед/г, целлобиазная 143 ме/г), в О,1 М ацетатном буфере рН 5,0. Набухший объем превьш1ает 6 мл. Смесь инкубируют без перемешивания 1,2 и 5 сут при 50°С. Получают сиропы с концентрацией 2,2; 3 и 5,3%. В последнем случае измеряют также концентрацию гёксоз антроновым методом в супернатанте, она равна 5,3%. Следовательно, все гексозы в последнем случае являются глюкозой. Таким образом, предлагаемый способ получения продуктов гидролиза целлюлозы позволяет упростить технологию процесса, получать глюкозные сиропы и целлюлозу в виде хорошо фильтруемого и набухаемого материала, пригодного для использования в качестве сорбентов и носителей иммобилизованных веществ, а также исключить стадию размола целлюлозы, применение поверхностно-активных веществ и полностью исключить стадии обработки органическим растворителем и регенерации растворителя.