Способ получения сорбента для выделения целлюлаз и ксилиназ Советский патент 1986 года по МПК C12N9/42 

1

Изобретение относится к способам приготовления аффинных сорбентов для выделения и очистки ферментов и может быть использовано для получения высокоочищенных препаратов цел- люлазы и ксиланазы, применяемых в пищевой, целлюлозно-бумажной и микробиологической промьппленности, медицине и в научных исследованиях.

Цель изобретения - повышение сорбционной емкости целевого продукта и улучшение его гидродинамических характеристик.

Сущность изобретения заключается в том, что сорбенты, приготовленные из натуральных целлюлозосодержащих материалов, подвергают обработке деградирующими целлюлозу ферментами. Такая обработка приводит к увеличению сорбционной емкости сорбента в 5 и более раз (с 30 - 50 до 150 - 200 ед. фермента на 1 г носителя).

Существенным преимуществом предлагаемого способа является то, что целлюлозы, используемые для предварительной обработки сорбента, могут быть затем выделены из раствора в высокоочищенном виде на сорбенте, полученном с их помощью. Это позволяет свести к минимуму потери ферментного препарата на обработку носителя .

Предлагаемый способ обработки позволяет сократить время измельчения носителя и использовать иоситель с более крупным размером частиц без ухудшения его сорбционной емкости. Так, в случае измельченного хлопкового линта, размер го частиц может быть увеличен с 20 до 50 - 100 мкм и, несмотря на это, ферментативная обработка гарантирует такому носителю высокую сорбционную емкость.

Кроме того, преимуществом предлагаемого метода обработки носителя является то, что десорбированный с него водный раствор очищенных ферментов (целлюлоз) не содержит осадка, который образуется при использовании для очистки необработанного сорбента Это позволяет исключить дополнительную стадию центриф гироваиия очищенного раствора фермента для удаления неактивного осадка и непосредственно после десорбции проводить его сушку или осаждение.

52337J

Дополнительная термообработка сорбента при ЗО-ЮО С после его отмывания от ферментов, использованных для обработки, может проводиться в

5 двух режимах. Обработка при 30 - 50 С водой в течение 1-6 ч вызывает отмывание наиболее прочно адсорбированных ферментов в активной форме (примерно 2-5% общего количества, взя10 того для обработки). Это позволяет уменьшить потери сорбента за счет его разрушения при хранении и с другой стороны, максимально сэкономить ферменты на стадии обработки сорбен15 та. С другой стороны последующее промывание носителя при 50-100 С водой с многократной декантацией полностью удаляет с носителя остатки адсорбированных белков и исключает

20 возможность его разрушения и цирования в ходе длительного хранения. Кипячение сорбента после ферментативной обработки с декантацией окрашенного надосадочного раствора

25 приводит к получению носителя, обладающего отличными гидродинамическими характеристиками и позволяет обеспечить четкий фронт при смене элюентов, а также высокую скорость

30 элюирования водой активных целлюлаз- ных фракций. В результате значительно улучшается концентрирование кси- ланаз и целлюлаз в элюируемых фракциях, а также разделение зтих фер,с ментов при выделении их из препаратов одного продуцента. Описанную процедуру термообработки носителя производят не только на стадии его приготовления, но и после каждой

.Q процедуры очистки. Это позволяет сохранить высокие гидродинамические характеристики, тогда как сорбент, приготовленный по известному методу и не подвергающийся термообработке,

j существенно ухудшает фильтрующие свойства после второго - третьего использования.

Пример 1. 15г измельченного хлопкового линта (средний размер

,Q частиц 75 мкм) обрабатывают при перемешивании 250 мл 10%-ным раствором целловиридина ГЗХ (удельная активность 30 ед/г), затем фильтруют и тщательно промывают 0,1 М фосфат- иым буфером рН 7,0 - 7,5 (определен универсальнь индикатором),

Обработанный imm заливают водой, инкубируют в течение 1 ч при

3

и декантируют. Затем повторно заливают водой и кипятят в течение 10- 15 мин. Декантируют и дополнительио отмывают водой до исчезновения желтой окраски в надосадочной жидкости

Полученный сорбент вносят в колонку размером 300x50 мн с водяной рубашкой для термостатирования и используют для выделения целлюлаэ из целловиридина ГЗХ. Для этого на колонку, уравновешеиную О, М ацетатным буфером рН 4,5 при 5 С наносят 750 мл )0%-ного раствора препарата со скоростью потока 500 мл/ч, ;3атем промывают 300 мл 0,1 М фосфат- ного буфера рН 7,0 для десорбции не- целлолитических ферментов. Адсорбированные целлюлазы смывают 250 мл воды. Фракция целлюлаз объемом 200 мл имеет активность 10 ед/мл. Сорбцион- ная емкость обработанного линта составляет 150 ед на I г носителя. Выход фермента 90%. Линейная скорость элюции 25 см/ч,

Пример 2. 20 г хлопкового линта, обработанного как в примере 1, вносят в колонку (300x50 мм) для отделения ксиланаз из культу- ральной жидкости целлюлазного продуцента.

Колонку охлаждают до и наносят 200 мл культурапьной жидкости с удельной ксиланазной активностью 0,8 ед/мл и целлюлазной активностью 2,0 ед/мл. Далее проводят элюцию ксиланаз 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0. Полученная фракция обладает ксиланазной активностью 0,2 ед/мл. Степень очистки ксиланаз от целлюлаз по отношению к культу- ральнсй жидкости составляет 30 раз.

Пример 3. 18г измельченного хлопкового линта (размер частиц 20-50 мкм) обрабатывают 200 мл 5%-ным раствором целлокандина (цел- лкшолитическая активность 100 ед/г). Приготовленный линт декантируют и промывают 300 мл 0,1 М фосфатным буфером рН 7,0. Осадок линта заливают 500 МП воды и кипятят 15 мин, после чего охлаждают и отмывают двумя порциями по 300 мл воды.

Полученный сорбент суспендируют в 0,1 М ацетатном буфере рН 4,5 и заполняют колонку (200x25 мм), охлажденную водяной рубашкой до . 700 МП раствора целокандина Г10Х с удельной активностью 6 ед/мп наносят

523374

на колонку со скоростью свободного тока. Затем промывают 800 мл О,1 М фосфатного буфера рН 7,0 и пропускают 500 мл воды для про 1вания адсор5 бированных целлюлаз.

Емкость сорбента составляет не менее 200 ед/г и при десорбции фермент выходит острым пиком. Выход фермента 85%.

10 Для предотвращения разрушения сорбента прочно адсорбированными остатками целлюлаз и регенерации его кипятят и потом отмывают водой декантацией, пока поглощение при 280 нм

5 в кварцевом кювете толпшной 1 см не станет меньше 0,05 оптических ед. Пятикратное использование сорбента с последующей регенерацией показывает, что его гидродинамические и сорб20 ционные свойства не ухудшаются.

Пример 4. 50 г микрокристаллической целлюлозы для колоночной хроматографии обрабатывают 200 мл 10%-ного раствора целловиридина ГЗХ

25 в течение 30 мин. Суспензию декаити- руют, отмьпвают 300 мл 0,1 Ц фосфатного буфера рН 7,0 и после повторной декантацией осадок заливают 500 мл воды и инкубируют при 50°С в тече30 ние 2 ч о Насадочные жидкости объединяют и в дальнейшем используют для выделения целлюлаз. Осадок микро- кристалической целлюлазы заливают 300 мл воды и кипятят в течение 20 мин.

Приготовленный сорбент охлаждают и заполняют колонку 300x50 мм. При выделении целлюлазы элюрование проводят свободным током при гидростатическом давлении 1 м. Линейная ско0 рость протока в данном случае составляет 60 см/ч по сравнению с указанной фильтрующей способностью в спецификации микрокристаллической целлюлозы 42 см/ч.

5 Технико-зкономический эффект

предлагаемого изобретения заключается в следующем.

Способ позволяет увеличить сорб- 0 ционную емкость сорбентов на основании измельченного целлюлозного материала, что снижает затраты носителя на единицу фермента в 2 - 5 раз и влечет за собой увеличение степени 5 очистки в 3 - 6 раз. Термообработка сорбента снижает его гидродинамическое сопротивление. Это позволяет сократить затраты времени на очистку за

5

$12523376

счет увеличения скорости разделения та пригодного для крупномасштпбного и экономит энергию. Упомянутые пре- получения ферментов микробного про- имущества этого способа дают возмож- нахождения, сорбирующих на целлюло- ность приготовления аффинного сорбен- зе (целлолаз, ксиланаз).