Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L., используемый для получения моноклональных антител к гликопротеидному структурному белку вируса бешенства Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

эо петенне относится к гибридом - ной 1ехчологии и может быть использовано для диа ностики вируса бешенства

Usj. э изобретения является получе- ..ис штамма гибридных культивируемых глоток, гФояуцирующих моноклональные япгмтрла к гликопротеидному структурному бс i;:y вируса бешенства (ВБ) .

получают следующим образом.

ituuHHfcie мяеломные клетки ибридитнэую с клетками селезелки

мышей Balb/c, иммунизированных вирусом бешенства Вну«- ово-32 , Гибридные клоны культивируют на селективной среде ГАТ. С помощью методов иммуноферментного анализа и непрямой иммуноЛлюоресценции выявляют клоны, продуцирующие моноклональные антитела к гликопротеидному белку вируса бешенства штамм Внуково-32. Путем серийных пасса;,сеи клетки одного из наиболее продуктивных кчонов вы- водят в массовую культуру. Штахм

ы

Х5

3

продуцирует моноклинальные антитела к гликопротеидному белку вируса бешенства штамм Внуково-32 на протяжении 17 пассажей (срок наблюдения) .

Штамм получил название Крив-1 С5 и депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур в Институте цитологии АН СССР г.Ленинград под номером ВСКК(Н) № 320D. Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования - среда Дульбекко с 20%-ной эмбриональной телячьей сывороткой, 2 мМ глютамина и 50 мкг/мл гентамицина„ Характер роста - стационарная суспензия. Метод снятия - встряхивание. Частота пассирования - через 2-3 сут Посевная доза - 150000 клеток в 1 мл Кратность рассева - (1:2)-(1:3).

Культивирование в организме животных.

В брюшную полость мышей линии Balb/c, предварительно сенсибилизированных за 1-2 недели внутрибрю- шиинон инъекцией 0,3-0,5 мл минерального масла 2, 4, 105 14 тетраметил- пентадеканом, вводят гибридные клетки. Время образования опухолей 9- 12 сут; на протяжении десяти пассажей наблюдается 100%-ная перевива- емость асцитов.

Морфология клеток.

Культура состоит из слабо прикрепляющихся к субстрату округлых клеток различной величины с крупными ядрами. Цитоплазма имеет вид тонкого ободка.

Кариология.

Кариотип соответствует виду (мышиный) , С помощью окраски по С-мето- ду три маркерные хромосомы, привнесенные в эту линию от родительской миеломной линии.

Продуктивность штамма. Штамм гибридомы Крив-1-С5 продуцирует моноклонапьные антитела к гликопротеиду вируса бешенства при культивировании на протяжении семнадцати пассажей в культуре клеток и десяти пассажей на животных (срок наблюдения). Титр антител в НИФА для культуральных жидкостей составляет 1:810 и 1:65610 для асцнтных жидкостей. В реакции нейтрализации на мышах титр антител равен . 1:500. Кон

н. .

ьi

пк-я 10

15

20

25

1072

центрация моноклональных в асцитной жидкости 4-6 мг/мл.

Характеристика полученного продук- 5 та.

Мышиные моноклональные антитела к гликопротеидному белку вируса бешенства специфично реагируют с гли- копротеидом вируса бешенства в реакции непрямой иммунофлюоресценции (НМФА)5 реакции нейтрализации на мышах и непрямой реакции иммунофермент- ного анализа (НИФА).

Класс иммуноглобулинов.

Штамм гибридных клеток Крив-1-С5 секретнрует антитела класса IgG изо- тип 2а,

Криоконсервирование. Клетки Крив- 1-С5 замораживают на десятом пассаже. Общее количество ампул - 20 по 2- 3 млн.клеток. Криозащитная среда с 50%-ной эмбриональной телячьей сывороткой и 10%-ного ДМСО-диметилсульф- оксида. Выживаемость при размораживании 60-70%.

Контаминация,

Бактерии, грибы и дрожжи не обнаружены.

Использование штамма,

В культуральные матрасы вместимостью 250-500 мл засевают гибридные клетки Крив-1-С5 в концентрации 100- 150 тыс/мл в среде Тальбекко с 20%- ной эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 4 г/л глюкозы и 50 мкг/мл гентамицина. Культуры инкубируют в атмоссЬере воздуха с 6,2- 7,0% СО при 37°С в стационарном состоянии 3-4 сут и используют как образцы культуральной жидкости (КЖ). Осадок клеток ресуспензируют в 1- 1,5 мл среды без сыворотки и вводят 3-5.млн клеток в брюшную полость мышей Balb/c. Через 8-12 сут образуется асцитная жидкость,которую используют как образцы антител в асцитной жидкость (AM) после осаждения клеток.

Активность моноклональных антител (монАТ),

Активность МонАТ к гликопроидному структурному белку вируса бешенства выявляют непрямым методом иммуно- ферментного анализа (ИФА) с очищенным вирусом бешенства и очищенным глико- протеидом, в реакции непрямой иммуно- флуоресценции (НМФА), в реакции нейтрализации на мышах, в защите мышей от &: 3200 LD50 вируса бешенства, введенного в мозг, а также в выраженном

30

35

40

45

50

55

516310

терапевтическом эфсЬекте предварительно зараженных животных. В ИФА титры антител варьируют 5-15 млн.

Полученные данные показывают, что МонАТ Крив-1-С5 специфически реагируют с гликопротеидом различных штаммов вируса бешенства и не взаимодействуют с внутриклеточным нуклеипроте- идом.10

Установлено, что только антитела к гликопротеиду обладают вируснейтра- лизующим и защитньм действием к вирусу бешенства.

Таким образом, полученная гибри- дома секретирует монАТ к основной функционально-значимой детерминанте гликопротеида вируса бешенства.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых ; клеток животных Hus musculus L. BCKK (II) № 320D, используемый для получения моноклональных антител к гли- копротеидному структурному белку вируса бешенства.