Способ определения метаболитов витамина д в сыворотке крови Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 C07C172/00 

со ;о 1 Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано в биохимии при исследованиях метаболитов витамина D. В настоящее время известно около двух десятков метаболитов витамина D. Предлагаемый метод относится к опседелению трех важнейших из н|1х Это 25-оксихолекальциферол/25 (ОН)Da/ 1,25-диоксихолекальциферол/ ih,25(OH) и 24,25-диоксихолекальЦиферол/24,25(ОН)21)5/. Эти вещества являются биологически активными формами витамина D в организме человека Известен способ определения метаболитов витамина D в сыворотке крови путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматеграфической очистки на колонке с силикагелем с последующей элюцией и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Способ заключается в добавлении к 1 мл сыворотки меченого тритием стандарта ./ Н/-25-оксихолекальциферола и последующей экстракции образца смесью .хлороформ-метанол (2:1). Затем акстракт очищают на микроколонке с силикагелем 0,5 2 см. Перву . фракцию элюируют 2 мл гексана, вторую фракцию 7 мл смеси хлороформ-Ге сан (3:2). Эти фракции отбрасывают. Метаболит элюируют 7 мл смеси хлоро форм-гексан (3:2). Образец упариваю и определяют концентрацию 25(ОН)1)я помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и изотопного анализа 1. Недостатком известного способа является его сложность и длительность Цель изобретения - упрощение спо соба. X. Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения метаболитов витамина D в сыворотке крови путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очистки на колонке с силикагелем с последующей Элюцией и высокоэффек тивной жидкостной хроматографии, в качестве внутреннего стандарта используют 17-адетат эквиленола, а элюцию с колонки с силикагелем .проводят последовательно смесью гексен хлороформ в объемном соотношении 100:2, смесью гексан:хлороформ:уксу ная кислота в соотношении 100:10:2, 92 хлороформом, смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлоро-. форм:ацетон:уксусная кислота в соотношении 50:50:1. Пример.К1 мл исследуемой сыворотки крови добавляют 25 мг 17-ацетат эквиленола в 100 мкл этанола и перемешивают в течение 10 мин. Затем проводят экстракцию, добавляя 3,75 мл смеси гексан-изопропанол (1:2), 5 мин перемешивают и добавляют еще 1,25 мл гексана, и после тщательного перемешивания центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин. Органическую фазу отбирают, а остаток экстрагируют гексаном (1 ,25 мл х 2) . Объединенный экстракт упаривают и переносят на микроколонку в гексане (0,25 мл,х 2). Предварительную очистку проводят на автоматическом процессоре образцов PREP-1 фирмы Du Pont Jnctruments (США) с двенадцатиколончатым ротором с модифицированными стеклянными колонками 66x3 мм на сшшкагеле RSIL PREPSILICA с диаметром частиц 25-40 мкм фирмы Alltech Associates (США) при скорости 1000 об/мин 4 мин. Первую фракцию элюируют 2 мл смеси гексан-хлороформ (100:2); вторую 2 мл смеси гексанхлорбформ-уксусная кислота (100: 10:2); третью фракцию, содержащую 25(OH)D , элюируют 2 мл хлороформа четиертуюфракцию 2 мл смеси хлороформ-ацетон (100:10), 1, 2 и 4 фракции отбрасывают. Пятую фракцию, содержащую 1,25(OH)jDg и 24,25(OH)D элюируют 2 мл смеси хлороформ-ацетон-уксусная кислота (50:50:1) . Фракции, содержащие метаболиты, упаривают досуха под вакуумом при температуре не более 40 С, переносят в конические флаконы объемом 0,3 мл, перерастворяют в 50 мкл смеси гексан.-изопропанол (90:10) и анализируют с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии на приборе 322 МР, AITEX (США) на колонке ultraspHere Si (5 мкм, 4 6x250 мм). Детектирование при длине волны 265 им. Элюирующая система гексан-изопропанол (90:10). Расчет осуществляют по калибровочному графику. Для его построения определяют отношение высот пиков 25(OH)D. и -ацетат эквиленола при значениях 25(OH)D, равных 5 нг, 10 иг, 25 нг, 50 нг и ,100 нг. В данном примере отношение высоты, пика 25(OH)D9 к высоте пика 17-ацетат эквиленола равно

Высота пика 25(OH)Da

Высота пика 17-ацетат эквиленола

47 мм 0,65

72 мм

Концентрация 25(OH)Dj , определенная методом ВЖХ, мг/мл

10,5

1

15

2 3 4 5 6 7 8 9 10

21

26

31

41

50,5

60

70,5

80

1140039 ,

По калибровочному графику определяют концентрацию 25(ОН)Dд.равную 29 нг/мл.

Другие примеры определения конJ центрации 25(OH)Dj с помощью списанного метода представлены в таблице.

Истинная концентрация 25(ОН)Вз, мг/мл

10 15

20 25 30 40 50 60 70 80

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕТАБОЛИТОВ ВИТАМИНА D В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем добавления к образцу внутреннего стандарта, экстракции липидной фракции, хроматографической очистки на колонке с силикагелем с последующей элюцией и высокоэффективной жидкостной хроматографии, отличающий ся тем, что, с целью упрощения способа, в качестве внутреннего стандарта используют 17-ацетат эквиленола, а элюцию с колонки с силикагелем проводят последовательно смесью гексан:хлороформ в объемном соотношении 100:2, смесью гексан:хлороформ:уксусная кислота в соотношении 100:10:2, хлороформом, смесью хлороформ:ацетон в соотношении 100:10 и смесью хлороформ:ацетон: уксусная кислота в соотношении 50:50:1. (Л

По сравнению с известным предлагаемый способ обеспечивает упрощение, сокращение времени анализа, возможность максимальной автоматизации и повышение достоверности получаемых результатов.: