Способ определения фотосенсибилизирующего действия химических веществ на биологические объекты Советский патент 1985 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к фармаколо гии, медицине и может быть использовано для оценки фотосенсибилизирующего действия различных агентов на биологические объекты. Целью изобретения является сокращение времени и повьшение чувствительности способа. Пример. Для получения фрагментов саркоплазматического ретикулу ма белые скелетные мышцы кролика или спинные мышцы рыбы (200 г) промьтаю в охлажденном 0,9%-ном растворе NaC измельчают ножницами и помещают в среду, содержащую 0,3 М сахарозы, 0,1 мМ ЭДТА, 1,5 мм АДФ и 10 мМ гистидина,-рН 7,7, объем среды. .300 мл. Гомогенизирование проводится при 4 С ножевым гомогенизатором, до полного измельчения ткани (удобен гомогенизатор типа Политрон). Гомогенат центрифугируют при 11 000 g 20 мин. Надосадочную жидкость фильтруют через несколько слоев марли и центрифугируют при . 40 000 g 60 мин. Осадок суспендируют в 400 мл среды, содержащей 0,6 М КС1 0,1 мМ ЭДТА, 0,2 мм CaClj,. сывороточный альбумин человека (О,6 мг/мл) 5 мМ гистидина., рН 7,4, и после 1 ч инкубации при слабом перемешивании центрифугируют 20 мин при 11 000 g. Осадок отбрасывают, а супернатант центрифугируют при 45 000 g 60мин. Осадок, представляющий собой фрагмен ты саркоплазматического ретикулума, суспендируют в 12 мл среды, содержащей 25% глицерина (по объему) 0,2 мИ CaCl2, 0,1 мМ ЭДТА, 10 мМ гистидина рН 7,2 при 4°С. Полученный препарат может храниться при -20 С в течение месяца и годен для проведения более 1000 измерений. I Регистрацию параметров транспорта Са ферментативной системой мембран саркоплазматического ретикулума проводят методом рН-метрии с помощью стеклянного электрода ЭСЛ-41 Г-04. В качестве электрода сравнения используется хлор-серебряный электрод, соединенный- агаровым мос гиком с измерительной ячейкой. Регистрация изменения рН, происходящая в результате гидролиза АТФ ферментативной системой мембран санкоплазматического ретикулума, проводится при помощи рН-метра ЛПУ-0,1, а запись - на согласованном с ним электронном потенциометре КСП-4. Измерение производится в ячейке из оптического стекла прямоугольной формы размером 2312 30 мм. Длина оптического пути ячейки составляет 10 мм. Ячейка помещается в термостатируемый держатель, изготовленный таким образом, чтобы одна его сторона бьша открыта для освещения. Освещение ячейки проводят 250-ваттной кварцево-галоидной лампой, освещенность 100 000 лк/см, длительность освещения 10 мин. Инкубационная смесь в ячейке содержала, мМ: -NaCl 100; MgClj 4, оксалат натрия 5, АТФ 2, имидазол 2,5, рН 7,0. В ячейку вносят 25 кг белка фрагментов саркоплазматического ретикулума. Измерения проводят до внесения испытуемого вещества, после внесения испытуемого вещества в известной концентрации и после освещения ячейки, содержащей систему транспорта и испытуемое вещество. В ячейку вносят 100 мМ это приводит к резкому закислению.среды инкубации (кривая 1) Через некоторое время скорость закисления снижается и на кривой появляется перегиб, свидетельствующий о том, что весь имеющийся в инкубационной среде Са закачался внутрь пузырьков саркоплазматическога ретикулума. Опыт повторяется в присутствии в системе фотосенсибилизатора красителя - основной фиолетовый К в концентрации 12,5 мг/л. Измерение повторяется третий раз после освещения системы в течение 10 мин. Приняв темновой образец за 100%, производят расчет фотосенсибилизирующего,действия красителя на транспорт ионов .. Вычисляют отношение . Величина добавления Са (в моль) делится на величину образовавшегося неорганического фосфата (в моль), который определяется из калибровки, относительно добавки 10 мМ .. Результаты выражают в процентах относительно контрольного (уровня) измерения (в присутствии красителя). Результаты аналцза некоторых красителей приведены в табл. 1. Фотосенсибилиэированное повреждение системы транспорта ионов красителями целлюлозно-бумажного производства в мембранах саркоплазматического ретикулума скелетньсх мьш1ц кролика (в О к контролю).

Сокращение времени и повышение чувствительности в сравнении с прототипом приведено в табл. 2. . -

Т а б л и ц .а 1

Продолжение табл.2

Предлагаемый споПрототипсоб

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ SHE r i;i;i ВЕЩЕСТВ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ путем сравнительного исследования освещенной и неосвещенной систем, содержащих биологический материал и фотосенсибилизатор, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени и повышения чувствительности способа, систему,содержащую мембраны саркоплазматического ретикулума мьшц и тестируемое соединение, освещают, затем рН-метрически определяют количество молей транспортироo«t ванного в мембраны Са в расчете на моль АТФ, причем снижение этого показателя в освещенном образце свидетельствует о фотосенсибилизирующем действии тестируемого химического ве(Л щества. 00 CD

О П в а ц т н б)Приготовление б) Процедура отсутствуетлипосом - не менее 1 ч в)Время измерев) Время измерения ния (необходимо не более 10 мин снять не менее 5 точек для получения кинетической кривой) 1-2 ч Приго товле нйе Выделение мембран липосом необхоможно проводить 1 раз в месяц (храдимо перед кажнение при -40°С не дым экспериментом. Таким обраизменяет их функциональных свойств) зом, суммарное Суммарное время извремя измерения по способу-промерения, таким образом, составляет тотипу - не мене более 10 мин для нее 2 ч одного образца и может быть автоматизированоЧувствительность способа Достижение 50% фотосенсибшшзированного действия регистрируется при одинаковом освещении следунндими концентрациями красителя (МКГ/Л): Прямой часто-голубой 130110 12,,3 Прямой красный 2 с 1б7±13 14,OiO,5 Эсновной йрко-зеленый 240±25 50,OiO,7