Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS ,используемый для получения моноклональных антител к Са @ -АТФазе саркоплазматического ретикулума сердца собаки Советский патент 1988 года по МПК C12N5/00 A61K39/395 

00

; Изобретение относится к биотех- юлогии и- может быть использовано i кардиологических исследованиях. : Цель изобретения - получение фтамма гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus, продуцирующего моноклональные антитела МонАТ), взаимодействующие с ЛТфазой саркоплазматического ретику- jjyMa (СР) сердДа и скелетных мышц я ивотньпс и человека. I Штамм получают следующим образом. I Мьшей линии BALB/C иммунизируют три брюшин но кальций-оскалатным препаратом. СР из сердечной мышцы собаки. Первую иммунизацию проводят IPO мкг антигена в полном адьюванте Фрейнда. Повторно антиген в дозе 5р мкг в буфере ФСБ (0,15 М NaCl, 0,005 М Na-фосфатный буфер, рН .7,46) вводят внутрибрюшинно через 7 дн, а затем через Н, 15, 16 и 17 дн. Кпетки селезенки используют для гиб родизации на 18-й день.

f Клетки миеломы линии P3-Ag8 653 pjacTHT на среде RPMI 1640, содержа- щЬй 2 мМ Ь-глута гана, 100 мкг канами цина в 1 мл, 0,05% меркаптоэтанола, ai также 10% донорской или эмбрио- телячьей сыворотки. Клетки культивируют при 37 С в СО -инку- . Слияние клеток селезенки И | мунизироваиных мьш1ей с клетками М1|1еломы проводят с использованием п лиэтиленгликоля с мол.м. 2000.

Суспензию спленоцитов получают из селезенок в стеклянном гомогенизаторе и промывают в бессьшороточной среде Игла. Затем суспензию клеток центрифугируют в перкрлле (плотность ) и для слияния используют клетки, осаждаемые в течение 20 мин при скорости 2000 об/мин, 50 млн сплено цмтов смешивают с 10 млн миеломных клеток ч центрифугируют в течение 10 мин при 900 об/мин. Смесь клеток помещают в термостат при 37 С на 20 мин. Надосадочную жццкость сливают, к клеткам в течение 2 мин добавляют 0,6 мл теплого 40%-ного раствора полиэтиленгликоля на среде RPMI с 15% диметилсульфоксида. Клетки после слияния отмьшают средой RPMI, суспендируют в селективной среде ГАТ, содержащей 0,1 мМ гипоксантина, 16 мкМ тимидина, 0,4 мкИ аминоптери- на и 0,3 мкМ глицина. Кпетки рассевают в 96-лурочные плоскодонные

5

пластинки из. расчета 50000 клеток на одну лунку. Гибридомные популяции, секретирующие в культуральную 5 среду антитела к мембранам СР сердечной мьппцы собаки, клонируют далее методом конечных разведений. В качестве питающего слоя используют перитонеальные клетки мьшгей линии O BALB/C. Полученный штамм обозначает 1ЕЗ, он хранится в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером

5 ВСКК(П) 96D и характеризуется следующими признаками.

Культуральные признаки. Стандартные условия культивирования - сердца RPMI-1640 с 10% донорской телячьей

0 сыворотки, 4 мМ L-глутамина

100 мкг/мл канамицина, 0,05 мМ меркаптоэтанола при 37 С в атмосфере 5% СОг .

Для вьфащивания штамма используют пластиковую посуду; посевная доза 100 тыс. клеток на 1 мл, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Культура суспензионная. Культивирование в организме жи0 вотных. Для вьфащивания асцита пригодны мьшш BALB/C. Мышам за 7-15 дн до инъекции клеток штамма вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл пристана. Кпетки инъецируют внутрибрюшинно по

5 1-3x10 клеток в 1 мл среды Игла. Асцит формируется через 12-14 дней. Продуктивность штамма. Секреция СонАТ на 3-4-й день культивирования составляет 15-20 мкг в 1 мл культу-;

0 ральной среды и 5 мг в 1 мл асцит- ной жидкости при определении методом торможения радиоиммуноадсорбции.

Характеристика полученного продукта. Штамм продуцирует НонАТ, относя5 щиеся к 1g М классу. Метод оценки специфичности: тест на связывание МонАТ с иммобилизованными мембранами СР или с очищенной Са -АТфазой (радиоиммунный анализ). Антитела

не оказьгаают ингибирующего действия на активность Са -АТфазы.

Стабильность продукции. Продукция МонАТ сохраняется как минимум до 20 пассажей in vitro и до трех

г пассажей в асцитной форме.

Криоконсернирование.Для длительного хранения клетки штамма замораживают в эмбриональной телячьей сыворотке с добавлением 10% диметил

сульфоксида. Режим замораживания: 40 мин до +4 С, затем 1 /мин до -40°С. После замораживания клетки переносят в жидкий азот. Размораживание проводят на водяной бане при +37 С. Жизнеспособность клеток после размораживания 70-80% по окрашиванию трипановым синим.

Контаминация. Бактерии и грибы в культуре не обнаружены при длительном наблюдении и посевах на питательные среды. Заражение микроплазмой не выявлено при окрашивании красителями на ДНК и по характеру включения тимидиновой метки.

Пример. На 96-ячеечных гибких полихлорвиниповых пластинках сорбирую очищенную Са -АТфазу - 2 мкг на ячейку в 100 мкл буфера ФСБ. После 2 ч инкубации при комнатной температуре лунки промывают ФСБ, содержащим 0,05% Твин 80 (буфер А). После трехкратной отмывки ячейку заполняют буфером А и инкубируют 1 ч при комнатной температуре или ночь при Для тестирования в ячейку вносят 100 мкл культуральной жидкости гибри- домного клона, затем проводят 1 ч инкубацию и отмывку буфером А. После этого в ячейку добавляют 100 мкл того же буфеоа, содержащего проявляющий реагент - меченые J антитела кролика к Легким цепям иммуноглобулинов мыши (100 тыс. имп/мин). После 1 ч инкубации пластинки отмывают и ячейки просчитывают в гамма-спектрометре.

10

870

Специфичность реакции моноклональ- ньгх антител 1ЕЗ с Са -АТфазой показано в табл. 1.

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют о высокой специфичности полученных МонАТ к Са -АТфазе сердца собаки.

Данные о способности МонАТ 1ЕЗ реагировать с Са -АТфазой PC сердца и скелетных мышц, а также клеточной мембраны эритроцитов приведены в табл. 2.

Результаты, приведенные в табл. 2, свидетельствуют о том, что полученный гибридомный штамм продуцирует МонАТ, реагирующие с Са -АТфазой из сердца и скелетных мьш1ц ряда лабораторных животных, а также из сердечной мьш1цы и эритроцитов человека. Таким образом, полученные МОнАТ отличаются от известных способностью перекрестно реагировать с Са -АТфазой СР сердца, а также

эритроцитов человека. Это позволяет использовать данные МонАТ для диагностики патологий микромиокарда и сердечно-сосудистой системы.

30

35

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемьс4 клеток животных Mus musculus, BCKK(II) № 96 D, используемый для получения моноклональных антител к -АТфазе саркоплазматического ретикулума сердца собаки.

I Т а б л и ц а 1

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для кардиологических исследований. Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных MUS musculus, продуцирующего моноклональные антитела (МонАТ), реагирующие с Са -АТфазой из сердца и скелетных мьппц животных и человека. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии BALB/C, иммунизированных кальций-ок- салатным препаратом саркоплазмати- ческого ретикулума сердечной мышцы собаки, с клетками миеломы P3-Ag 8«653. Клетки культивируют в среде RPMI-1640 с 10% донорской телячьей сыворотки при 37°С в атмосфере 5% СО, клетки пассируют один раз в 3-4 дня, кратность рассева 1:10. Секреция МОнАТ на 3-4 день культи- вирования составляет 15-20 мкг/мл культуральной среды и 5 мг/мл асци- . . тической жидкости. МонАТ относятся к классу Ig М, они специфически взаимодействуют с Са - АТфазой из сердца и скелетных мьшц животных и человека. МонАТ могут быть использованы для диагностики патологий миокарда и сердечно- . сосудистой системы, 2 табл.

Са-АТфаза сердца собаки Штамм 1ЕЗ.

То же

Бычий сывороточный альбумин (контроль)

Са-АТфаза сердца собаки

То же

6300

1:10

5900

1:100

4400

1600 450

400 360

14148706

Т аблица 2

Антиген (препарат, из которого выделена Са-АТфаза

Сердечная мышца морской свинки

Сердечная мьипца собаки

Сердечная мышца кролика

Сердечная мышца человека

Скелетные мьш1цы собаки

Скелетные мьш1цы кролика

Скелетные мьш1цы крысы

Эритроциты человек

Бычий сывороточный альбумин (контроль

Связывание меченых вторых антител, имп/мин

8050 8090 6640 6230 8850 11550

10190 6280

450