Способ количественного определения саркоплазматического ретикулума в мышечной ткани Советский патент 1982 года по МПК G01N33/48 

деления, каждый из которых включает гомогенизацию и дифференциальное центрифугирование.

Оксалат кальция в изолированную фракцию добавляют в количестве 5-15 от количества, необходимого до насыщения им изолированной фракции.

Пример. А, Полное извлечение СР из мышцы,

Образец , например, сердце, промывают физиологическим раствором, освобождают от жира и крупных сосудов и после взвешивания и разделения ткани на 2 равныё навески, одну из них измельчают в гомогенизаторе при скорости З000 7000 об/мин в течение 3-5 е в среде выделения, предло,женАой Harigaya, Schwartz и содержа цей 10 мМ NaHCO СрН-7,0) , Навсе х этапах выделения поддерживают температуру Q-k°. Гомогенат центрифугуют 20 мин при 8000 хд.

Осадок суспендируют в новой порции среды выделения и вновь Подвергают гомогенизации в прежнем режиме и центрифугированию. Из супернатанта, разбавленного в два раза 1,2 М раствором КС1 осаждают СР - содержащую фракцию при 105-000 хд в течение kQ мин. Всего проводят 12-15 таких циклов. Полученные осадки микросом представляют собой суммарную фракцию, которая помимо СР содержит примеси других ме| ранных элементов клетки.Суммарную фракцию суспендируют в небольшом объеме 0,05 М КС1 20 мМ трис-малеэтного буфера (рН 6,8).

Б. Выделение изолированной фракции СР.

Для выделения изолированной фракции СР применяют частичное насыщение везикул СР оксалатом кальция в среде, содержащей АТФ, с последующим отделением активных утяжеленных оксалатом кальция везикул центрифугированием в градиенте плотности сахарозы, что позволяет полностью исключить примеси других мембранных элементов клетки.

Вторую навеску гомогенизируют три раза по 5 с с 20 секундными интервалами при скорости 30007000 об/мин.Фракцию микросом выделяют, как описано выше, в результате одного цикла гомогенизации и дифференциального центрифугирования. Определяют максимальную кальций-оксалатную емкость препарата микросом

С ПОМОЩЬЮ рН-метрии в среде, содержащей 20 мМ АТФ, 30 мН MgCb, 10 мМ NaNOg, 0,16 М КС1, 25 мМ оксалата калия, 60 мМ трис-HCI (рН 6,б5). Затем добавляют порциями по 10-20 мк

1М раствор СаС., непрерывно регистрируя изменение рН, пока не наступает насыщение пузырьков СР оксалатом кальция, для чего предварительно определяют изменение рН при 100 насыщении везикул оксалатом кальция. Реакцию проводят при 20 С. Суспензию микросо частично насыщенных оксалатом кальдия, быстро охлаждают до , до|бавляют раствор 3 М КС1 до конечной концентрации 0,6 М и 13 мл суспензии наслаивают на линейный Градиент сахарозы (0,72-1,75 М, содержащей 0,6 М КС1, i| мМ АТФ,

6 мМ MgC1,2. 6,5 мМ оксалата калия, 5 мМ NaNO/j, 10 мМ имидазола рНб,б5 Центрифугирование проводят в бакетроторе при 73000 хд в течение 2-3 ч. Полученный осадок содержит очищенные активные везикулы СР.

В. Внесение маркера 32 р в образцы суммарной и изолированной фракций.2 t

Фосфорилирование Са , Mg зависимой АТФазы осуществляют при в 0,5 мл среды, содержащей 0,1 М КС1, 10 мМ CaCI., 20 мкКм (У-32р-АТФ, 20 мМ трис-HCI, рН 7,1;.

Реакцию инициируют добавлением О,1-0,2 мл белка микросом. Через 15 с реакцию останавливают равным объемом раствора, содержащего 20 трихлоруксусной кислоты, 1 мМ At0,

2мМ . 0,5 мл аликвоты суспензии денатурированного белка фильтруют под вакуумом. Фильтр промывают

6 раз 3 мл трихлоруксусной кислоты. -В контрольные пробы

Э-32р-АТФ вносят после остановки реакции раствором, .содержащим трихлоруксусную кислоту. Включение радиоактивной метки измеряют в сцинтилляционном спектрометре.

Концентрацию белка определяют по Lowryetal (J.Biol. Chem.. 193, 265, 1951), используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

В таблице приведены результаты определения содержания СР в сердце морской свинки.

Из приведенных в таблице результтов следует, что все активные вези5кулы СР были экстрагированы из мышцы, так как выход СР в последних циклах выделения незначителен. Количество фосфорилированного белкового интермедиата в суммарной5 фракции микросом составляет 5f8 нмоль Pi/r сырого веса ткани. При выделении изолированной фракции микросом максимальная капьций-оксалатная емкость составляетО 3,6 мкмоль белка. После насыщения везикул СР оксалатом кальция до 15 от максимальной величины и центрифугирования в градиенте 56 плотности сахарозы получен осадок очищенных везикул СР И О мг белк. Фрак ция чистого СР способна включать 2,5 нмоль неорганического фосфата на 1 мг белка. Отношение суммарного количества фосфобелка, содержащегося в СР, полностью извлеченном из 1 г сердечной мышцы (. к количеству фосфата, включенного в 1 мг по белкуУ чистой :))ракции СР (2,5) дает содержание СР в 1 г сырого :веса мышцы сердца 2,3 мг/г.

Формула изобретения

выделенной путем гомогенизации и дифференциального центрифугирования, 6 т личающийся тем, что, с целью повышения.точности определения, получают суммарную фракцию дробным выделением, а изолированную фракцию очищают путем осаждения в градиенте плотности сахарозы, причем перед ее очисткой в последнюю добавляют хлористый кальций в присутствии АТФ и оксалата, а в качестве специфического маркера используют фосфорилированный интермедиат Са - зависимой аденозинтрифосфатазы.

получают путем проведения 12-15 циклов дробного выделения, каждый из которых включает гомогенизацию и дифференциальное центрифугирование.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2.. Circulation Research, 197, 3, p. 531-550.