Способ получения фермента протеин-глутаминазы для пищевой промышленности в Escherichia coli Российский патент 2023 года по МПК C12P21/02 C12N15/70 C12N9/78 

Изобретение относится к пищевой и кормовой промышленности и может быть использовано при производстве пищевых и кормовых белков.

Разработан способ получения ферментного препарата на основе фермента протеин-глутаминазы.

Извлечение и использование овсяных белков в пищевых и кормовых продуктах затруднено из-за их низкой растворимости в воде и плохой способности к образованию тонких эмульсий.

Возможным решением этой проблемы является создание на поверхности белковых глобул дополнительных одноименных зарядов от ионогенных боковых радикалов аминокислотных остатков. Одним из таких способов является превращение поверхностных глутаминов в глутаминовые кислоты путем гидролиза амидных связей в их боковых радикалах под действием ферментов протеин-глутаминаз. Ферментативный гидролиз по сравнению с химическим позволяет проводить процесс при более низких температурах и без использования агрессивных сред (кислот и щелочей) [1]. Для ферментативного превращения глутаминов в глутаматы на поверхности белка используют фермент протеин-глутаминазу из штамма Chryseobacterium proteolyticum [2]. В настоящий момент известны попытки получения продуцентов протеин глутаминазы на базе Corinebacterium glutamicum [3].

Ближайшим аналогом заявляемого способа получения фермента протеин-глутаминазы является способ по патенту EP 1 748 077 A1, в котором заявлен способ получения рекомбинантной протеин-глутаминазы в штаммах C. glutamicum c использованием tat-зависимого сигнального пути коринебактерий.

Задача заявляемой группы изобретений:

разработать способ получения ферментного препарата протеин-глутаминазы в штаммах E.coli.

Задача решена путем:

разработки плазмидной конструкции pET-PG, определяющей биосинтез фермента протеин-глутаминазы, путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli на среде, содержащей триптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу в фосфатном буфере, индукции биосинтеза фермента лактозой и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом, очистки фермента методами хроматографии, отличающийся тем, что в качестве штамма-продуцента используют штамм E. coli AK21, в среду для культивирования добавляют сульфат аммония до 50 г/л, аммиак до 1% с поддержкой pH=6,9 добавлением смеси H₂SO₄ и HCl в соотношении 7/1,5, а в стадию контроля активности входит обработка надосадочной фракцией ростовой среды штамма Bacillus subtilis KK1112.

Способ получения фермента протеин-глутаминазы в общем виде

В качестве штамма-продуцента протеин-глутаминазы используют клетки штамма E. coli BL21 (DE3), способные синтезировать РНК-полимеразу фага Т7. Для осуществления синтеза протеин-глутаминазы в E. coli сконструирована рекомбинантная плазмида pET-PG. содержащая природную последовательность гена prgA из Chryseobacterium proteolyticum под контролем Т7 промотора и терминатора транскрипции.

Для биосинтеза используют среду, не содержащую NaCl. Индукцию биосинтеза фермента осуществляют добавлением лактозы и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозида (ИПТГ) в среду, содержащую триптон, дрожжевой экстракт, глицерин, глюкозу в фосфатном буфере, сульфат аммония в количестве 15-60 г/л.

На первом этапе проводят биосинтез протеин-глутаминазы в биореакторе, что позволяет получить культуру высокой оптической плотности OD₆₀₀ порядка 50-70 и получить выход целевого продукта порядка 25 г сырой биомассы с литра с содержанием протеин-глутаминазы до 30% от общего содержания клеточного белка. Общее время ферментации составляет от 10 до 14 часов.

Полученную в результате биосинтеза биомассу используют для очистки протеин-глутаминазы. Очистку целевого белка проводят путём дезинтеграции клеток с помощью микрофлюидайзера (M110P Microfluidizer®), осаждением клеточных компонентов с помощью ультрацентрифугирования и дальнейшей очистки растворимой фракции на хроматографической колонке Ni-NTA Agarose (Quiagen).

Полученный в результате очистки белок представляет из себя про-протеин-глутаминазу, активная форма фермента получается при обработке про-протеин-глутаминазы субтилизином. В качестве ферментного препарата субтилизина для обработки про-протеин-глутаминазы используют надосадочную фракцию ростовой среды штамма Bacillus subtilis KK1112. В результате получается активный ферментный препарат протеин-глутаминазы.

Активность протеин-глутаминазы определяют двумя способами:

1. По увеличению растворимости овсяного белка

В реакционную смесь на основе фосфатного буфера добавляют нерастворимый овсяной белок и 2 мг/мл и активный фермент протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С. Спектрофотометрически определяют увеличение доли растворенного овсяного белка в смеси.

2. По высвобождению аммиака при обработке протеин-глутаминазой овсяного белка.

В реакционную смесь на основе фосфатного буфера добавляют нерастворимый овсяной белок 2 мг/мл и активный фермент протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С, после инкубации добавляют реактив Несслера и спектрофотометрически измеряют количество высвобожденного аммиака.

Полученный в результате раствор активного целевого белка протеин-глутаминаз, имеющий чистоту не менее 95% по протеин-глутаминазе, является ферментным препаратом и может храниться как минимум 7 дней в тёмном месте при температуре 4°С.

Заявляемая группа изобретений проиллюстрирована следующими фигурами:

Фиг. 1. Генетическая конструкция pET15b-PG, определяющая синтез протеин-глутаминазы в E.coli.

Фиг. 2. Электрофоретический анализ ферментного препарата протеин-глутаминазы, полученного на основе штамма E. coli AK21. Дорожка 1 – очищенный препарат фермента протеин-глутаминазы, дорожка 2 – белковый маркер PageRuler™ Prestained Protein Ladder (Thermo Fisher Scientific).

Пример 1. Получение генетической конструкции, определяющей синтез протеин-глутаминазы в E.coli

Ген prgA из Chryseobacterium proteolyticum амплифицируют с использованием олигонуклеотидов, определяющих присоединение к белку PrgA 6-Гис-метки с N-конца, а также определяющих наличие сайтов рестрикции с двух концов амплифицированного фрагмента.

Концы амплифицированного фрагмента гена prgA обрабатывают ферментами рестрикции NcoI и BamHI. Коммерческую плазмиду pET15b обрабатывают теми же ферментами рестрикции. Амплифицированный фрагмент гена prgA с использованием фермента ДНК-лигазы сшивают с коммерческим вектором pET15b по липким концам.

Полученная конструкция pET15b-PG (фиг. 1) определяет синтез белка протеин-глутаминазы с 6-Гис-меткой на N-конце под контролем промотора фага Т7 с лактозным оператором.

Полученной генетической конструкцией pET15b-PG трансформируют клетки E.coli. В результате получается штамм-продуцент E. coli AK21.

Пример 2. Получение фермента протеин-глутаминазы

Биосинтез протеин-глутаминазы осуществляют в биореакторе объёмом 1.5 л с использованием штамма E. coli BL21(DE3)-pET15b-PG (E. coli AK21), полученного путём трансформации E. coli BL21 (DE3), плазмидой pET15b-PG. Данный штамм обеспечивает транскрипцию гена prgA находящегося под контролем промотора фага Т7 с лактозным оператором.

Стерилизацию среды проводят в ферментёре в объёме 2.5 л. Среда имеет следующий состав: триптон, дрожжевой экстракт, глицерин (17.5, 8.75 и 7.75 г соответственно). Соли: KH₂PO₄, (NH₄)₂SO₄ и Na₂HPO₄*12H₂O (7.4, 15.3 и 40.3 г. соответственно) стерилизуют отдельно от среды в объёме 115 мл и затем добавляются в ферментёр. Добавки готовят отдельно согласно таблице 1.

Таблица 1. Добавки к ферментационной среде

Вещество Навеска, г Обьем, л Режим стерилизации (NH₄)₂SO₄ 57.5 0.125 Автоклавируется Ампициллин, Ap 1.0 0.005 Разводится стерильной водой Глюкоза моногидрат №1 и №2 53.4 0.125 2 колбы №1 - 170 мл и №2 - 330 мл, фильтр 0,45μм и автоклав Альфа-D Лактоза (водная), №1 и №2 43.2 0.24 2 колбы №1 - 320 мл и №2 - 640 мл, фильтр 0,45 μм и автоклав Питательная среда (ПС) триптон 30 1,1 1 колба на 2,5 л, Автоклав др.экстракт 15 MgSO₄ 0.225 0.00225 Автоклав NaOH 3.85 0.05 фильтр 0,22μм ИПТГ 0.06 0,00025 фильтр 0,22μм

После автоклавирования раствор сульфата аммония и лактозу № 2 добавляют к питательной среде (АЛПС).

Сульфат магния, Ap и глюкозу №1 добавляют в ферментёр непосредственно перед засевом. Посевную культуру выращивают в среде триптон, дрожжевой экстракт и глицерин (11,3, 5,6 и 5,3 г/л соответственно) в объёме 300 мл (две колбы по 150 мл) при температуре 37°С, с аэрацией 200 об/мин до оптической плотности (OD=0,5). Ферментацию проводят при 37°С, с аэрацией, обеспечивающей содержание кислорода в среде кислорода не ниже 20% (после начала индукции DO не должно превышать 60%). Добавление глюкозы № 2 начинают при достижении культурой OD = 5±1, со скоростью подачи, обеспечивающей содержание глюкозы в среде от 5 до 10 г/л. По окончании добавления глюкозы и достижении культурой OD = 25 осуществляют индукцию биосинтеза протеин-глутаминазы добавлением в ферментационную среду лактозы № 1 и ИПТГ. Через час после начала индукции начинают добавлять АЛПС с равномерной скоростью 10 мл/мин. Добавляют аммиак до 1% с поддержкой pH=6,9±0,1 добавлением смеси H₂SO₄ и HCl в соотношении 7/1,5. Далее аммиаком и серной кислотой поддерживают pH=6,9±0,1. Пеногаситель добавляют по мере появления пены. Контроль биосинтеза осуществляют после раунда ферментации по SDS-PAGE белковому электрофорезу. Общее время ферментации 12,5 часов.

В результате ферментации получают от 40 г сырой биомассы с содержанием протеин-глутаминазы от 30% общего содержания клеточного белка.

Пример 3. Очистка фермента протеин-глутаминазы

Полученную в ходе ферментации биомассу используют для выделения целевого белка. Для этого 20 г клеток суспендируют в соотношении 1:10 в 10 мМ калий-фосфатном буфере, рН 7,2. Разрушение клеточной биомассы проводят с помощью микрофлюидайзера (M110P Microfluidizer®). Клеточный лизат центрифугируют, супернатант наносят на колонку с сорбентом Ni-NTA Agarose (Quiagen), уравновешенным буфером A.

Колонку промывают повышающейся концентрацией имидазола (буфер Б). Выход белка протеин-глутаминазы происходит при концентрации имидазола в буфере Б 100 ммоль.

В результате получают гомогенный препарат протеин-глутаминазы (фиг. 2) с концентрацией не менее 3 мг/мл (содержание целевого белка не менее 95%).

Пример 4. Получение активной формы фермента протеин-глутаминазы

К полученному в результате очистки ферментному препарату протеин-глутаминазы добавляют надосадочную фракцию ростовой среды штамма Bacillus subtilis KK1112 из расчета 50 мкл надосадочной на 3 мг протеин-глутаминазы. В результате получается препарат активной формы протеин-глутаминазы с концентрацией не менее 3 мг/мл.

Пример 5. Определение активности полученного препарата протеин-глутаминазы

Активность протеин-глутаминазы определяют двумя способами:

1. По увеличению растворимости овсяного белка

В реакционную смесь на основе фосфатного буфера добавляют нерастворимый овсяной белок и 2 мг/мл и 20 мкг активного фермента протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С. Повышение растворимости овсяного белка оценивают используя спектрофотометр (Shimadzu UV-1800), оценивают рассеивание проходящего света на длине волны λ=600нм (OD600). Для нерастворимого овсяного белка OD600=0.8, после обработки активной формой фермента протеин-глутаминазы OD600=0.2.

2. По высвобождению аммиака при обработке протеин-глутаминазой овсяного белка

В реакционную смесь на основе фосфатного буфера объемом 300 мкл добавляют нерастворимый овсяной белок 2 мг/мл и 20 мкг активного фермента протеин-глутаминазы, инкубируют 1 час при 37°С, после инкубации реакцию останавливают добавлением добавляют 100 мкл 1.5М трихлоруксусной кислоты. После дезактивации образец центрифугируют при 10000 g и к 50 мкл супернатанта добавляют 50мкл реактива Несслера и 1150 мкл воды. Далее, используя спектрофотометр (Shimadzu UV-1800) в образце измеряют поглощение при длине волны λ=450 нм. Количество аммиака считают, используя стандартную кривую: была получена активность порядка 10 ед./мг для овсяного белка.

Заключение

Таким образом, разработан способ получения активной формы фермента протеин-глутаминазы, который позволяет синтезировать до 30% протеин-глутаминазы, в расчете на суммарный клеточный белок. Активная форма фермента протеин-глутаминазы позволяет увеличить растворимость овсяного белка и обладает удельной активностью порядка 10 ед./мг.

Источники информации

Jiang Z., Strohm T. S., Salovaara H., Sibakov J., Kanerva P., Loponen J. (2015) Oat protein solubility and emulsion properties improved by enzymatic deamidation // Journal of Cereal Science (64). 126–132.

Yamaguchi, S., Jeenes, D.J., Archer, D.B., (2001) Protein-glutaminase from Chryseobacterium proteolyticum, an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins - purification, characterization and gene cloning. Eur. J. Biochem. 268, 1410-1421.

Yoshimi Kikuchi & Hiroshi Itaya & Masayo Date & Kazuhiko Matsui & Long-Fei Wu. (2008) Production of Chryseobacterium proteolyticum protein-glutaminase using the twin-arginine translocation pathway in Corynebacterium glutamicum // Appl Microbiol Biotechnol 78:67–74.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения фермента протеин-глутаминазы, предусматривающий культивирование рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli AK21, представляющего собой штамм E. coli BL21(DE3)-pET15b-PG, полученный путём трансформации E. coli BL21 (DE3), плазмидой pET15b-PG, конструкция которой приведена на фиг.1, на среде, содержащей триптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу, индукцию биосинтеза фермента лактозой и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом и очистку фермента методами хроматографии. Изобретение обеспечивает получение фермента протеин-глутаминазы с концентрацией не менее 3 мг/мл и содержанием целевого белка не менее 95%. 2 ил., 1 табл., 5 пр.

Способ получения фермента протеин-глутаминазы путем культивирования рекомбинантного штамма-продуцента Escherichia coli AK21, представляющего собой штамм E. coli BL21(DE3)-pET15b-PG, полученный путём трансформации E. coli BL21 (DE3), плазмидой pET15b-PG, конструкция которой приведена на фиг.1, на среде, содержащей триптон, дрожжевой экстракт, глицерин и глюкозу, индукции биосинтеза фермента лактозой и изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозидом, очистки фермента методами хроматографии.